高中生物《微生物的分离》课件

微生物的 分离
待筛选分离微生物种 类
导入了目的基因的受体细胞 尿素分解菌 纤维素分解菌 酵母菌、霉菌等真菌 金黄色葡萄球菌 固氮菌 自养型微生物
培养基要求
添加青霉素等抗生素 尿素是唯一氮源 纤维素是唯一碳源 添加青霉素 添加高浓度食盐 不加氮源的无氮培养基 不加含碳有机物的无碳培养基
土壤中分解尿素的细菌的 分离与计数
通过实验测定土壤中的细菌数量，下列与此操作 有关的叙述中，不正确的是 ( D ) A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、 高压灭菌后倒平板 B．取10－4、10－5的土壤稀释液0.1 mL，分别涂布于 各组平板上 C．将培养皿倒置，37 ℃恒温培养24～48小时
D．选择菌落数在300个以上的培养皿进行计数
平 平 平 1 2 3 均 1 2 3 均 1 2 3 均 值 值 值
菌落数 /平板 菌数/ 克土壤
实验设计
关于土壤中某细菌的分离与计数的实验操作步骤如 下： 1．土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm 左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 牛肉膏蛋白胨 选择 2．制备培养基 多于 准备 培养基和 培养基。 将菌液稀释相同的倍数,在牛肉膏蛋白胨培养基上 生长的菌落数目应明显 选择培养基上的数 目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，
将样品涂布到鉴别 纤维素分解菌的培 养基上
①鉴别培养基的特点? ②如何鉴别?
实验流程
实验流程 操作中的注意事项
土壤取样 ↓ 选择培养 ↓ 梯度稀释 ↓ 将样品涂 布到鉴别 常用的刚果红染色法有两种：一种是先培 纤维素分 养微生物，再加入刚果红染色；另一种是 解菌的培 在倒平板时就加入刚果红。 养基上挑 经过刚果红鉴别培养基培养后，在产纤维
• 3．微生物的培养与观察 • 将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中 （体积为250mL），充分摇匀，吸取上清液 1mL，转移至盛有9mL无菌水的大试管中， 依次等比稀释至106稀释度，并按照由106～ 0.1 104稀释度的顺序分别吸取______mL进行平 板涂布操作。每个稀释度下需要3个选择培养 基、1个牛肉膏蛋白胨培养基。 • 将涂布好的培养皿放在37℃恒温箱中培养， 及时观察和记录。挑选选择培养基中不同形 30～300 态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察 颜色反应。 平均值 • 4．细菌的计数 • 当菌落数目稳定时，选取菌落数在 的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3
选择培养 1.选择培养的目的：
增加纤维素分解菌的浓度，以确保
能够从样品中分离到所需要的微生物。
2.制备选择培养基
纤维素分解菌的选择培养基 组分 纤维素粉 NaNO3 Na2HPO4〃7H2O KH2PO4 含量 5g 1g 1.2g 0.9g 无机盐 提供的主要营养物 质 碳源、能源
MgSO4〃7H2O KCl 酵母膏
微生物的研究，使人们能够利用秸秆等废 弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。
纤维素的化学组成：只含C、H、O三种 元素，是一种多糖。纤维素产生于植物的光 合作用。纤维素的基本组成单位是葡萄糖， 人体内没有纤维素酶，所以人体不能直接利 用纤维素作为能源物质。但土壤中有分解纤 维素的微生物，最终把纤维素分解成CO2和H2O 释放到无机环境中去。
选择培养基
制备方法：加入某种化学物质 原理：对某物质的抗性 用途：分离微生物
目的要求:
学会将混杂的微生物分离成纯种，掌 握统计 分析样品中微生物的种类和数量的方法。 自然界中不同种类的微生物混杂生活 在一起，要研究某种微生物的特性，必须 从混杂的微生物类群中分离它，使该微生 物处于纯培养状态这种获得纯培养的方法 纯种：是微生物的某一个种或株，培养中 称为微生物的分离与纯化. 的所有细胞有着共同的来源或仅是同一细 胞的后代。
梯度稀释
按照课题1的稀释操作方法，将 选择培养后的培养基进行等比稀释，
稀释最大倍数到106。
将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
鉴别纤维素分解菌的培养基——固体培养基 组分
CMCNa 酵母膏 KH2PO4
含量
5～10g 1g 0.25g
提供的主要营养物质
碳源 碳源、氮源、生长因子 无机盐
百度文库琼脂
土豆汁
显示出的颜色反应基本 优点是操作简便， 优 上是纤维素分解菌的作 不存在菌落混杂问 点 用。 题。
特别提醒:
(1)纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，因培养 基中无凝固剂，利用液体选择培养基以增加纤维素分解 菌的浓度。
(2)能产生纤维素酶的微生物能以纤维素作为碳源和能 源，在培养基中正常生长，其他绝大多数生物不能正常 生长。 (3)鉴别培养基因含有琼脂，为固体培养基，刚果红染 色法就是应用此培养基。 (4)为确定得到的菌是否是纤维素分解菌，还需进行发 酵产纤维素酶的实验。纤维素酶的发酵方法有液体发酵 和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维 素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。
知识点一：纤维素分解菌简介
纤维素分解菌能够产生纤维素酶，利用纤维素。 它的新陈代谢类型为异养需氧型。
知识点二：纤维素酶 纤维素酶是一种复合酶，
它包括C1酶、CX酶和葡萄 糖苷酶，具有催化分解纤 维素的作用，其作用过程 纤维素 纤维二糖 葡萄糖 如下：
知识点三：纤维素分解菌的筛选原理
红色消失，出现 透明圈即可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分 解菌。
刚果红染色法：即在含有纤维素的培养基中，加入刚果
红时，刚果红与培养基中的纤维素形成红色复合物。当
纤维素被分解后，该复合物不能形成，培养基中出现以 纤维素分解菌为中心的透明圈。
知识点四：实验操作
土壤取样
什么样的环 境取样?
选择培养
梯度稀释
①选择培养基的特点? ②培养的目的?
挑选产生透 明圈的菌落
挑选什么样的 菌落?
(2)间接计数法(活菌计数法) ①原理：当样品的稀释度足够高时，培 养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀 释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌 落数，就能推测出样品中大约含有多少活 菌。 ②操作 a．设置重复组，增强实验的说服力与 准确性。
3．细菌分离与计数的实验流程
土壤取样→样品稀释→取样涂布→微 104 105 106 稀释度 生物的培养→观察并记录结果→细菌计数
是否含杂菌。②样品稀释度将直接影响平板上生长的
菌落数。
分解纤维素的微生物的分 离
实验 操作
筛选 原理
纤维素 分解菌的 分离
纤维素分 解菌简介
纤维 素酶
纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质。植物 的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中 棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。
何处寻找 • 现在大力提倡无纸化办公，但是每年仍然 不可避免地产生大量的废纸，其主要成分 纤维素 是木质纤维，人类正努力将其转化为一种 分解菌？ 新的资源——乙醇。 有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些
脲酶
。
（2）选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生
长，同时抑制和阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择 培养基。
2．统计菌落数目的方法 (1)显微镜直接计数法 ①原理：利用特定细菌计数板或血细胞 计数板，在显微镜下计算一定容积的样品 中微生物数量。 ②方法：用计数板计数。 ③缺点：不能区分死菌与活菌。
15g
100mL
凝固剂
碳源
上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000 mL
2.涂布平板 将稀释度为104～106的菌悬液各取 0.1ml 涂布在培养基上，30℃倒置培养。
挑选产生透明圈的菌落
挑取产生明显的透明圈的菌落， 一般即为分解纤维素的菌落。 接种到纤维素分解菌的选择培养 基上，在300C－ 370C培养，可获得纯 培养。
c.你能否设计一个对照实验，说明 选择培养基的作用 用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照。
3.操作方法：
将土样加入装有30ml选择培养基的
锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在
一定温度下振荡培养1～2天，直至培养
液变浑浊。也可重复选择培养。
思考：为什么选择培养能够“浓 缩”所需的微生物？
在选择培养的条件下，可以使那些 能够适应这种营养条件的微生物得到迅 速繁殖，而那些不适应这种营养条件的 微生物的繁殖被抑制，因此可以起到 “浓缩”的作用。
土壤取样 ①取样环境 富含纤维素的环境中。 ②原因
由于生物与环境的相互依存关系， 在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌 的含量相对提高，因此从这种土样中获 得目的微生物的几率要高于普通环境。
土壤取样 ③实例：树林中多年落叶形成的腐殖 土，多年积累的枯枝败叶等。 ④讨论:如果找不到合适的环境，可将 滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什 么作用？你认为滤纸应埋进土壤中多深？ 将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌 相对集中，实际上是人工设置纤维素分解 菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深 约10cm左右的土壤中。
解析 检测土壤中细菌总数，用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨 培养基，经高温、高压灭菌后倒平板，取104、105、106稀释度 的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上，将 实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48小时，在确 定对照组无菌后，选择菌落数在30～300的平板进行计数。 答案 D
（3）对照原则 ①判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的
培养基同时进行培养。②判断选择培养基是否具有筛
选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养， 观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。 （4）①牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基应各有 一个空白对照，即不涂布菌液，目的是验证培养基中
1．尿素：尿素是一种重要的农业氮肥，但是不能直接被农作物
吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成
氨
之后，植
物才能利用其中的氮。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因 为它们体内能合成 2．筛选菌株 （1）实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于 目的菌株 生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他 微生物生长。
纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环 境中，也可以将富含纤维素的物质埋在土 壤中，经过30天左右，再从已腐烂的物质 埋藏处筛选纤维素分解菌。 在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的 培养基上之前，可以用选择培养基增加纤 维素分解菌的浓度。培养时要在摇床上振 荡培养。 可以参照上一课题样品的稀释方法进行。
水解酪素
0.5g 0.5g 0.5g
0.5g 生长因子、碳源、 氮源 氮源、生长因子
a.该配方是液体培养基还是固体培养基？ 为什么？ 是液体培养基，原因是配方中无凝固剂。
b.这个培养基对微生物是否具有选择作用？ 如果具有，是如何进行选择的？
有选择作用，本配方中的碳源是纤维素， 所以能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。
倒掉 NaCl溶液→产生透明圈
①由于纤维素和琼脂、土豆 汁中都含淀粉类物质，可能 使产生淀粉酶的微生物也形 成透明圈，即假阳性反应。 操作繁琐，加入刚果红会使 ②有些微生物具有降解色素 菌落之间发生混杂 的能力，它们在长时间培养
缺 点
两种常用刚果红(CR)染色法的比较
方法一
方法二 在倒平板时就加
操 先培养微生物，再加入 作 刚果红进行颜色反应。
思考：土壤中分解尿素和分解纤维素 的细菌的分离与计数实验流程有 哪些异同？
前者直接稀释涂布在以尿素为唯一N源的选 择培养基上，直接分离得到目的菌落；后者先 进行选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后， 再将菌液稀释涂布到鉴别培养基。
排雷 (1)在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数， 然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细 菌的数目，如果某个平板的菌落数与其他差别甚远，说明该平 板操作过程中出现失误，应舍弃。 (2)统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个 或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此， 统计结果用菌落数而不是活菌数来表示。
刚果红染色法
方法一： 先培养微生物，再加入刚果红 进行颜色反应。 方法二： 在倒平板时就加入刚果红。 思考：这两种方法各有哪些优点 与不足？
两种常用刚果红(CR)染色法的比较
方法一
长出菌落的培养基→覆盖CR 溶液(1mg/mL)
方法二
过 程
倒去CR溶液→加入NaCl溶液 (1mol/L)
配制CR溶液(10mg/mL)→灭 菌→按照1 mLCR溶液/200 mL培养基比例混匀→倒平板 →培养→产生透明圈