2.高效液相色谱仪和固定相、流动相
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作用原理：被分析试样组分对特定波长紫外 光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关 系遵守比尔定律。
特点：
灵敏度高，可达10-9g.mL-1； 线性范围高； 可用梯度洗脱； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 不适用于对紫外不吸收的试样； 紫外光不透过的溶剂不能用（苯等）。
2. 光电二极管阵列检测器
紫外可见光度检测 器的重要进展； 1021个二极管阵列， 各检测某一特定波 长，无需停流扫描 而观察色谱柱流出 物的各个瞬间的动 态光谱吸收图
3. 在液相色谱法中，梯度淋洗适用于分离何种 试样？
2）离子交换色谱流动相 组分保留值可通过流动相中盐浓度及pH来调节
人干扰素-γ等电点8.5 底剂：50mmol/L 磷酸盐缓冲液，pH8.0 洗脱剂： 50mmol/L 磷酸盐缓冲液，pH8.5，1mol/L NaCl
七、高效液相色谱的应用
1. 环境中有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50 m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药残留量进 行分析。
2. 稠环芳烃的分析
稠环芳烃多为致癌物质 反相液-液色谱法 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 ～100%甲醇
六、液相色谱法流动相
1. 流动相特性 2. （1）流动相的种类、配比可显著改变组
分分离状况； 3. （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相
， 称为正相液液色谱法; 4. （3）流动相的极性大于固定液的极性，
则称为反相液液色谱 。
组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。
2. 流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗
高压泵按其性质可分为恒压泵、恒流泵两类
1）往复式柱塞泵： 恒流 泵； 易于更换溶剂，适用于梯 度洗脱但有脉冲波动，可 以加一阻尼器抑制脉冲。
2）气动放大泵： 恒压泵 液缸体积大，更换流动相 不方便，不便于梯度洗脱， 无脉冲、稳定流量的输出, 现多用于装柱。
二、进样装置
a. 停留进样装置：
b. 缺点：不能承受高压，须停流进样； 无法取得精确的保留时间
线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 ºC 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器
正相和反相色谱的区别
比较项目
正相色谱
反相色谱
固定相
极性
非（弱）极性
流动相
非（弱）极性 极性
流出次序
极性组分k大 极性组分k 小
流动相极性的影 极性增加，k减 极性增加，k增
响
小
大
a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
化学键合固定相的特点 （1）传质快，表面无深凹陷; （2）寿命长， 无固定液流失，耐流动相冲 击； （3）选择性好，可键合不同官能团 ； （4）有利于梯度洗脱；
b. 高压定量进样阀：（六 通阀进样装置）
c. 优点：进样准确，重 现性好，适于定量分析
d. c.自动进样器：计算机 控制，适合大量进样。
三、高效分离柱 色谱柱是实现分离的核心部件。发展趋 势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
常规液相色谱柱 1～6 mm，10～50 cm。 微孔填充柱 0.5-1mm 毛细管柱 30-50µm
外梯度: 两台高压泵， 将两种不同极性的溶剂 按一定的比例送入梯度 混合室，混合后进入色 谱柱。
内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两 种或多种不同极性的溶 剂按一定的比例抽入高 压泵中混合。
讨论1
用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品， 以某一比例甲醇-水为流动相时，样品容 量因子较小，若想使容量因子增加，较 好的办法是 A 增加流动相中甲醇的比例 B增加流动相中水的比例 C流动相中加入少量HAc D流动相中加入少量的氨水
3. 流动相的选择
常用溶剂的极性顺序：水、酰胺、腈、醇、酮、 酯、醚、烃类, etc. 流动相可分为：底剂及洗脱剂 底剂：决定基本的色谱分离情况； 洗脱剂：调节试样组分的滞留并对几个组分具 有选择性的分离作用。
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
广泛应用于生物化工、制药、食品和环境 监测中.
5. 电导检测器（electrical conductivity detector）
属电化学检测器，是离子色谱法中应用最 为广泛的检测器
作用原理：根据物质在某些介质中电离后 所产生的电导变化来测定电离物质的含 量。
五、液相色谱法固定相
1. 固定相的形状 （1）全多孔型
在分离过程中按照一定的程序连续改变载 液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的 变化来改变被分离组分的分离因素。
通过梯度洗脱，可缩短分离时间、 提高分辨能力、改善峰形，还可 提高分析精度。
溶剂的组成在15min内，从10％（V/V） CH3CN-H2O随时间改变至50％CH3CN-H2O
梯度淋洗装置
骂 道 ： “ 这 小子， 今天疯 了，哈 怂货！ ”
李 金 柱 是 这个 村子———李 平 台村 里的人 。在李 平台最 有名的 东西有 两件： 第 一 是 利 平 台的金 菊花。 李平台 的后山 坡上常 年长着 一片金 黄色的 野菊花 。每逢 秋 天 ， 金 黄 金黄的 花朵在 阳光下 能折射 太阳的 亮；漫 山遍野 的香能 遮挡住 秋风的 寒 。 第 二 就 是这“ 名人” 李金柱 了。李 金柱的 名气大 到成为 了家家 户户教 育孩子 的 典 范 。 谁 家的小 孩子不 成材， 不好学 ，就会 被家长 狠狠的 教育： “再不 好好学 习 ， 以 后 长 大了也 想李金 柱一样 没有出 息！” 谁家的 小孩子 办了个 蠢事， 那就成 了 典 型 的 “ 李金柱 第二” 了。李 金柱的 名气来 头还得 从他的 经历说 起。李 平台村 本 来 是 个 用 当地人 来说， 是个鸟 不拉屎 的穷村 子。在 当地有 个歌谣 ：“夏 天光着 腚 ， 冬 天 打 补丁， 问谁一 穷二白 ，那是 李平台 ”。孩 子们到 了成家 的年龄 ，李平
物包裹固定相。 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：5～10 μm；
3.液-液色谱固定相
惰性载体：硅胶，无机氧化物、高分子 聚合物、脲醛树脂等，多为3—10um的全 多孔微球。
固定液：正相： 氰基柱、胺基柱等 反相 : 烷基柱、苯基柱。
4. 化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定 相，一般用硅胶作为基体。
仪器分析课程讲义
第四节 高效液相色谱仪
目录
高效液相色谱仪 高效液相色谱的固定相和流动相
太 阳 还 有 一竿 子高的 时候， 李金柱 就骑着 他那辆 除了铃 不响， 什么都 响的 “ 二 八 ” 破 驴吱吱 扭扭地 从夕阳 的方向 飞奔过 来了。 路边闲 坐着下 棋的老 头们也 被 这 车 子 刺 耳的嚎 叫从楚 河汉界 的厮杀 中回过 神来。 看到夕 阳下热 的湿透 了整个 后 背 ， 白 色 的的良 布衬衫 紧紧的 粘在后 背上的 ，阳光 下反光 的背影 ，老头 们齐声
4. 荧光检测器（fluorescence detector）
许多有机化合物，特别是芳 香族化合物、受紫外光激发 后能够辐射出荧光。
高灵敏度(比紫外检测器高两个数量级，达 10-11g.ml-1)
高选择性; 线性范围窄； 测量中不能使用抑制、吸收荧光的溶剂；
对不产生荧光的物质，可使其转变成荧光 物质；
滤膜过滤。
2．脱气装置
作用：脱去流动相中的溶解气体。
(1)吹氮脱气法 (2)加热回流法 (3)抽真空脱气法 (4)超声波脱气法 (5)在线真空脱气法(on—1ine degasser)
3、 高压输液泵
输送流动相
压力：150～350×105 Pa 作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到
色谱系统。 输液泵的稳定性直接关系到分析结果 的重复性和准确性。
光电二极管阵列检测器
3. 差示折光检测器（differential refractive index detector） 除紫外检测器之外应用最多的检测器；
可连续检测参比池和样品池中溶液的折光 指数差值。差值与浓度呈正比；
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
特点：
通用型检测器 ; 灵敏度低（10-7g.mL-1），不能用于痕量分 析; 对温度敏感，要求使用温度恒定; 对流动相流量变化敏感，不能用于梯度洗脱。
装柱方法：有干法和湿法，按粒度20μm 划分。
柱温控制
下列几种情况需要控制柱温： 法定标准分析方法中，要求保留时间具
有再现性； 必须通过改变柱温来提高分离效率； 对高分子化合物或黏度大的样品； 对一些具有生物活性的生物分子； 对一些组成复杂的样品，使用二维色谱
技术。
四、液相色谱检测器
1.紫外检测器: 应用最广，对大部分有机化合 物有响应。
最初由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多 孔球体 100μm的大颗粒，表面涂渍固定液。 传质速度慢，柱效低。 现采用10μm以下的小颗粒 。
（2）表面多孔型(薄壳型微珠)
30～40μm的玻璃微球，表面附着一 层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，传质速度快，但柱容量低；
2.液-固吸附固定相 极性：硅胶、氧化镁、分子筛 等； 非极型：高聚物微球、石墨化碳黑、聚合
台 的 男 孩 都 想娶个 外村的 媳妇， 李平台 的女孩 都想嫁 到别
6.2 高效液相色谱仪
输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统
一、输液系统
1．贮液器 贮液罐的材料应耐腐蚀，对溶剂呈惰性，
容积约为0．5—2．0L； 贮液罐放置要高于泵体； 使用过程贮液罐应密闭； 溶剂在放入贮液罐之前必须经过0．45um
讨论2
在反相色谱法中，若以甲醇-水为流动相， 增加甲醇的比例时，组分的容量因子k与 保留时间tR如何变化？
作业
1.在ODS柱上，以甲醇为流动相，某组分的分配 容量k=1.2,如以乙腈为流动相，其k值是增加 还是减少，为什么？
2.在硅胶柱上，用甲苯为流动相，某组分的保留 时间是30min，如果改用四氯化碳或乙醚为流 动相，试分析该组分的保留时间如何变化？
正相液-液分配分离（液固色谱极性固定相）： 底剂：低极性的溶剂，如正己烷、苯、氯仿等， 洗脱剂：根据试样的性质选取中等极性溶剂如醚、 酮、醇等。 反相色谱（液固色谱非极性固定相）： 底剂： 水。 洗脱剂： 有机溶剂作为极性调节剂。
4 梯度洗脱
梯度洗脱，与气相色谱中的程序升温一样， 可极大地改善分离效果
特点：
灵敏度高，可达10-9g.mL-1； 线性范围高； 可用梯度洗脱； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 不适用于对紫外不吸收的试样； 紫外光不透过的溶剂不能用（苯等）。
2. 光电二极管阵列检测器
紫外可见光度检测 器的重要进展； 1021个二极管阵列， 各检测某一特定波 长，无需停流扫描 而观察色谱柱流出 物的各个瞬间的动 态光谱吸收图
3. 在液相色谱法中，梯度淋洗适用于分离何种 试样？
2）离子交换色谱流动相 组分保留值可通过流动相中盐浓度及pH来调节
人干扰素-γ等电点8.5 底剂：50mmol/L 磷酸盐缓冲液，pH8.0 洗脱剂： 50mmol/L 磷酸盐缓冲液，pH8.5，1mol/L NaCl
七、高效液相色谱的应用
1. 环境中有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50 m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药残留量进 行分析。
2. 稠环芳烃的分析
稠环芳烃多为致癌物质 反相液-液色谱法 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 ～100%甲醇
六、液相色谱法流动相
1. 流动相特性 2. （1）流动相的种类、配比可显著改变组
分分离状况； 3. （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相
， 称为正相液液色谱法; 4. （3）流动相的极性大于固定液的极性，
则称为反相液液色谱 。
组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。
2. 流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗
高压泵按其性质可分为恒压泵、恒流泵两类
1）往复式柱塞泵： 恒流 泵； 易于更换溶剂，适用于梯 度洗脱但有脉冲波动，可 以加一阻尼器抑制脉冲。
2）气动放大泵： 恒压泵 液缸体积大，更换流动相 不方便，不便于梯度洗脱， 无脉冲、稳定流量的输出, 现多用于装柱。
二、进样装置
a. 停留进样装置：
b. 缺点：不能承受高压，须停流进样； 无法取得精确的保留时间
线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 ºC 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器
正相和反相色谱的区别
比较项目
正相色谱
反相色谱
固定相
极性
非（弱）极性
流动相
非（弱）极性 极性
流出次序
极性组分k大 极性组分k 小
流动相极性的影 极性增加，k减 极性增加，k增
响
小
大
a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
化学键合固定相的特点 （1）传质快，表面无深凹陷; （2）寿命长， 无固定液流失，耐流动相冲 击； （3）选择性好，可键合不同官能团 ； （4）有利于梯度洗脱；
b. 高压定量进样阀：（六 通阀进样装置）
c. 优点：进样准确，重 现性好，适于定量分析
d. c.自动进样器：计算机 控制，适合大量进样。
三、高效分离柱 色谱柱是实现分离的核心部件。发展趋 势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
常规液相色谱柱 1～6 mm，10～50 cm。 微孔填充柱 0.5-1mm 毛细管柱 30-50µm
外梯度: 两台高压泵， 将两种不同极性的溶剂 按一定的比例送入梯度 混合室，混合后进入色 谱柱。
内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两 种或多种不同极性的溶 剂按一定的比例抽入高 压泵中混合。
讨论1
用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品， 以某一比例甲醇-水为流动相时，样品容 量因子较小，若想使容量因子增加，较 好的办法是 A 增加流动相中甲醇的比例 B增加流动相中水的比例 C流动相中加入少量HAc D流动相中加入少量的氨水
3. 流动相的选择
常用溶剂的极性顺序：水、酰胺、腈、醇、酮、 酯、醚、烃类, etc. 流动相可分为：底剂及洗脱剂 底剂：决定基本的色谱分离情况； 洗脱剂：调节试样组分的滞留并对几个组分具 有选择性的分离作用。
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
广泛应用于生物化工、制药、食品和环境 监测中.
5. 电导检测器（electrical conductivity detector）
属电化学检测器，是离子色谱法中应用最 为广泛的检测器
作用原理：根据物质在某些介质中电离后 所产生的电导变化来测定电离物质的含 量。
五、液相色谱法固定相
1. 固定相的形状 （1）全多孔型
在分离过程中按照一定的程序连续改变载 液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的 变化来改变被分离组分的分离因素。
通过梯度洗脱，可缩短分离时间、 提高分辨能力、改善峰形，还可 提高分析精度。
溶剂的组成在15min内，从10％（V/V） CH3CN-H2O随时间改变至50％CH3CN-H2O
梯度淋洗装置
骂 道 ： “ 这 小子， 今天疯 了，哈 怂货！ ”
李 金 柱 是 这个 村子———李 平 台村 里的人 。在李 平台最 有名的 东西有 两件： 第 一 是 利 平 台的金 菊花。 李平台 的后山 坡上常 年长着 一片金 黄色的 野菊花 。每逢 秋 天 ， 金 黄 金黄的 花朵在 阳光下 能折射 太阳的 亮；漫 山遍野 的香能 遮挡住 秋风的 寒 。 第 二 就 是这“ 名人” 李金柱 了。李 金柱的 名气大 到成为 了家家 户户教 育孩子 的 典 范 。 谁 家的小 孩子不 成材， 不好学 ，就会 被家长 狠狠的 教育： “再不 好好学 习 ， 以 后 长 大了也 想李金 柱一样 没有出 息！” 谁家的 小孩子 办了个 蠢事， 那就成 了 典 型 的 “ 李金柱 第二” 了。李 金柱的 名气来 头还得 从他的 经历说 起。李 平台村 本 来 是 个 用 当地人 来说， 是个鸟 不拉屎 的穷村 子。在 当地有 个歌谣 ：“夏 天光着 腚 ， 冬 天 打 补丁， 问谁一 穷二白 ，那是 李平台 ”。孩 子们到 了成家 的年龄 ，李平
物包裹固定相。 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：5～10 μm；
3.液-液色谱固定相
惰性载体：硅胶，无机氧化物、高分子 聚合物、脲醛树脂等，多为3—10um的全 多孔微球。
固定液：正相： 氰基柱、胺基柱等 反相 : 烷基柱、苯基柱。
4. 化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定 相，一般用硅胶作为基体。
仪器分析课程讲义
第四节 高效液相色谱仪
目录
高效液相色谱仪 高效液相色谱的固定相和流动相
太 阳 还 有 一竿 子高的 时候， 李金柱 就骑着 他那辆 除了铃 不响， 什么都 响的 “ 二 八 ” 破 驴吱吱 扭扭地 从夕阳 的方向 飞奔过 来了。 路边闲 坐着下 棋的老 头们也 被 这 车 子 刺 耳的嚎 叫从楚 河汉界 的厮杀 中回过 神来。 看到夕 阳下热 的湿透 了整个 后 背 ， 白 色 的的良 布衬衫 紧紧的 粘在后 背上的 ，阳光 下反光 的背影 ，老头 们齐声
4. 荧光检测器（fluorescence detector）
许多有机化合物，特别是芳 香族化合物、受紫外光激发 后能够辐射出荧光。
高灵敏度(比紫外检测器高两个数量级，达 10-11g.ml-1)
高选择性; 线性范围窄； 测量中不能使用抑制、吸收荧光的溶剂；
对不产生荧光的物质，可使其转变成荧光 物质；
滤膜过滤。
2．脱气装置
作用：脱去流动相中的溶解气体。
(1)吹氮脱气法 (2)加热回流法 (3)抽真空脱气法 (4)超声波脱气法 (5)在线真空脱气法(on—1ine degasser)
3、 高压输液泵
输送流动相
压力：150～350×105 Pa 作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到
色谱系统。 输液泵的稳定性直接关系到分析结果 的重复性和准确性。
光电二极管阵列检测器
3. 差示折光检测器（differential refractive index detector） 除紫外检测器之外应用最多的检测器；
可连续检测参比池和样品池中溶液的折光 指数差值。差值与浓度呈正比；
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
特点：
通用型检测器 ; 灵敏度低（10-7g.mL-1），不能用于痕量分 析; 对温度敏感，要求使用温度恒定; 对流动相流量变化敏感，不能用于梯度洗脱。
装柱方法：有干法和湿法，按粒度20μm 划分。
柱温控制
下列几种情况需要控制柱温： 法定标准分析方法中，要求保留时间具
有再现性； 必须通过改变柱温来提高分离效率； 对高分子化合物或黏度大的样品； 对一些具有生物活性的生物分子； 对一些组成复杂的样品，使用二维色谱
技术。
四、液相色谱检测器
1.紫外检测器: 应用最广，对大部分有机化合 物有响应。
最初由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多 孔球体 100μm的大颗粒，表面涂渍固定液。 传质速度慢，柱效低。 现采用10μm以下的小颗粒 。
（2）表面多孔型(薄壳型微珠)
30～40μm的玻璃微球，表面附着一 层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，传质速度快，但柱容量低；
2.液-固吸附固定相 极性：硅胶、氧化镁、分子筛 等； 非极型：高聚物微球、石墨化碳黑、聚合
台 的 男 孩 都 想娶个 外村的 媳妇， 李平台 的女孩 都想嫁 到别
6.2 高效液相色谱仪
输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统
一、输液系统
1．贮液器 贮液罐的材料应耐腐蚀，对溶剂呈惰性，
容积约为0．5—2．0L； 贮液罐放置要高于泵体； 使用过程贮液罐应密闭； 溶剂在放入贮液罐之前必须经过0．45um
讨论2
在反相色谱法中，若以甲醇-水为流动相， 增加甲醇的比例时，组分的容量因子k与 保留时间tR如何变化？
作业
1.在ODS柱上，以甲醇为流动相，某组分的分配 容量k=1.2,如以乙腈为流动相，其k值是增加 还是减少，为什么？
2.在硅胶柱上，用甲苯为流动相，某组分的保留 时间是30min，如果改用四氯化碳或乙醚为流 动相，试分析该组分的保留时间如何变化？
正相液-液分配分离（液固色谱极性固定相）： 底剂：低极性的溶剂，如正己烷、苯、氯仿等， 洗脱剂：根据试样的性质选取中等极性溶剂如醚、 酮、醇等。 反相色谱（液固色谱非极性固定相）： 底剂： 水。 洗脱剂： 有机溶剂作为极性调节剂。
4 梯度洗脱
梯度洗脱，与气相色谱中的程序升温一样， 可极大地改善分离效果