2.高效液相色谱仪和固定相、流动相
液相篇
液相色谱复习题填空：1．高效液相色谱法按分离机理的不同可分为液固吸附色谱、液液分配色谱、键合相色谱、凝胶色谱。
2．反相键合相色谱法常用的固定相是C18 ，流动相主体是水。
3．高效液相色谱仪的工作流程是：当试样进入进样器时，经进样器的流动相将试样带入色谱柱进行分离，被分离后的试样按先后顺序进入检测器，它将物质的浓度信号变成电信号，由记录仪记录下来，即得到一张液相色谱图。
4．依据分子尺寸大小的顺序来进行分离的液相色谱成为凝胶色谱，主要用来分析高分子物质的相对分子量分布。
5．反相键合相色谱法的分离机理是疏溶剂作用。
6．正相分配色谱可用于分析极性样品，被分离组分分子极性越强，在柱中停留的时间越长，流出越晚。
7．反相分配色谱固定相为非极性或弱极性固定液，流动相为以水为主体的极性（较强）溶剂。
8．折光指数检测器又称示差折光检测器，是通过连续检测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定试样浓度的检测器。
9．蒸发光散射检测器与RI和UV比较，它消除了溶剂干扰和温度变化而引起的基线漂移，即使使用梯度洗脱也不会产生基线漂移。
10．按衍生反应在整个色谱流程中所处时间的不同，可分为柱前衍生和柱后衍生，按衍生后的产物可检测性的不同，可分为紫外衍生和荧光衍生。
选择：1．欲测定聚乙烯的分子量及分子量分布，应选用下列哪种色谱？DA、液液分配色谱B、液固吸附色谱C、键合相色谱D、凝胶色谱2．下列哪些溶剂可作为反相键合相色谱的极性改性剂？BA、正己烷B、乙腈C、氯仿D、水3．一般反相烷基键合固定相要求在pH为多少之间使用，pH值过大会引起基体硅胶的溶解？DA、2～10B、3～6C、1～9D、2～84．流动相过滤必须使用何种粒径的过滤膜？BA、0.5μmB、0.45μmC、0.6μmD、0.55μm5．在液相色谱中，为了改变色谱柱的选择性，可以进行如下哪些操作？CA、改变流动相的种类或柱子B、改变固定相的种类或柱长C、改变固定相的种类和流动相的种类D、改变填料的粒度和柱长6．一般评价烷基键合相色谱柱时所用的流动相为AA、甲醇/水（83/17）B、甲醇/水（57/43）C、正庚烷/异丙醇（93/7）D、乙腈/水（1.5/98.5）7．一般评价烷基键合相色谱柱时所用的样品为BA、苯、萘、联苯、尿嘧啶B、苯、萘、联苯、菲C、苯、甲苯、二甲苯、三甲苯D、苯、甲苯、二甲苯、联苯8．下列检测器中，哪两种属于通用型检测器？BA、PDA、RIB、RI 、ELSDC、UV-Vis 、PDAD、FD、UV-Vis9．在分离条件下，药物中间体吲哚羧酸产品中所有主、副产品及杂质都能分离，且在254nm 下都出峰，使用下列何种定量方法最简便？AA、归一化法B、外标法C、内标法D、标准加入法10．使用20uL的定量管（LOOP）实现20uL的精确进样，最好使用_____的进样器？D A、20uL B、25uL C、50uL D、100uL11．下列用于高效液相色谱的检测器，______检测器不能使用梯度洗脱。
高效液相色谱仪的原理及应用
高效液相色谱仪的原理及应用
高效液相色谱仪（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分析仪器，根据物质在固定相和流动相
间的相互作用差异来实现物质分离和测定的方法。
高效液相色谱的主要原理如下：
1. 样品进样：样品通过进样器注入到流动相中。
2. 流动相泵：流动相泵将流动相以一定的压力送入进样阀。
3. 进样阀：进样阀控制样品的进入量，并通过连接固定相柱。
4. 固定相柱：固定相在柱中，对流动相和待分离的样品进行分离。
5. 检测器：根据样品的特性和分离程度选择合适的检测器进行检测。
6. 数据处理器：将检测的信号转化为柱温度、流量和检测器信号等数据。
高效液相色谱仪的主要应用包括：
1. 分析化学：用于定性和定量分析化学样品中的成分。
2. 生物化学：用于分析蛋白质、核酸、多肽等生物大分子。
3. 药学：用于分析药物中的活性成分、控制药品的质量。
4. 环境分析：用于监测环境中的有机污染物和无机物质。
5. 食品分析：用于检测食品中的添加剂、残留农药和毒性物质。
高效液相色谱仪的优点包括分离效率高、分析速度快、样品容量小、样品制备简单等。
然而，高效液相色谱仪的操作要求严格，仪器费用较高，且需要使用高纯度的溶剂和试剂。
高效液相色谱法简介
高效液相色谱的特点
高压——压力可达150～300 kg/cm2。色谱
柱每米降压为75 kg/cm2以上。
高速——流速为0.1～10.0 mL/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中
同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
第二节
塑料块 Teflon
1 cm
工作电极 (Pt, Au, 碳糊)
e.电导检测器
电导检测器主要用于离子色谱的检测。 原理： 根据待测物在一些介质中电离后所产 生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质 的含量。 电导检测器的主要部件是电导池。其响应 受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温 箱中。另外，当 pH>7时，该检测器不够灵敏。 电导检测器不能用于梯度洗脱。
◆恒流泵
注射型泵------输出精确，无脉动，需更换溶剂而中断工作。
往复型泵------造价低廉，溶剂更换方便，但存在脉动。 （使用较多） 对流量变化敏感的检测器会有噪声 干扰，此时可连接一脉动阻尼器。
◆恒压泵--------压力恒定，但流量不恒定（现在已经较少使用）。
输液泵操作注意事项：
防止固体微粒进入泵体 流动相不应含有腐蚀性物质 防止溶剂瓶内的流动相被用完 不超过规定的最高压力 流动相一般应该先脱气
F=2.3QKI0εCl
Q为量子产率，K为荧光效率，ε为摩尔吸光系 数，l为光径长度。
F=KC
特点：选择性好，
专属型检测器，灵敏 度比紫外检测器高 （检测限10-10 g/ml） 对多环芳烃，维 生素 B 、黄曲霉素、 卟啉类化合物、农药 、药物、氨基酸、甾 类化合物等有响应；
c. 示差折光检测器
高效液相色谱仪的工作原理
高效液相色谱仪的工作原理
1.色谱柱的工作原理:高效液相色谱仪是利用高压液体(主要为水)流过被分离物质,在固定相和流动相两相间进行非均相分配,使各组分分离并获得所需目标化合物。
2.高效液相色谱仪工作流程:在样品前处理部分完成色谱柱填充、脱气及预饱和等操作后,经进样口进入色谱柱;在载气输送系统中将待测组分从流动相进入固定相,与载气一起通过毛细管喷嘴到达检测器,由检测器检测出样品峰面积大小,并按组分保留时间对组分进行排序,然后在计算机上显示其峰面积大小和相应组分含量,即可得到该组分的浓度值。
液相色谱的固定相与流动相
不同固定相的选择与优势
C18
适用于中极性非极性化合物，适用于医药化 学等领域。
手性
可以实现大量手性化合物的分离，广泛应用 于制药、医药等领域。
芳香族
由于分子间的π-π堆积作坊，固定相表面可 以容纳一定分子体积。主要用于分离芳香族 或含芳香族结构物质。
离子交换
适用于分离具有离子性的化合物和混合物。
常见的流动相
液相色谱的固定相与流动 相
液相色谱（Liquid Chromatography）是一种高效、分辨率较高、适用于大多 数分子的分离技术。本文将介绍液相色谱的固定相和流动相。
固定相的介绍
作用
固定相是固定在色谱柱中的一种材料。它的 主要作用是提供一个分离的平台。
种类
常见的固定相有C18、C8、芳香族、离子交 换、手性等，不同的固定相分离作用不一样。
选择因素
在选择固定相时需要考虑分离物的化学性质 和分子结构，以及分离柱的长度和直径等。
优势
固定相具有高分离效率、高分离分辨率、操 作简单、时间短、试剂消耗小等优点。
流动相的 按一定比例调配而成。
种类
常见的流动相种类有水、有机 溶剂、盐酸等，不同种类的流 动相适用于不同的分离柱。
3 环境领域
4 化工领域
适用于环境污染物分析、有机化合物测定、 微量元素测定等。
分离和纯化有机化学品、研究石油化工原 料和煤化学反应机理等。
总结与展望
液相色谱是一种高效、分辨率较高的分离技术，应用领域较广。未来液相色谱技术将更好地结合质谱， 等离子体及纳米技术，应用的领域将更加广泛和深入。
作用
流动相可以作为分离物在色谱 柱中移动的载体，通过改变流 动相的性质，对分离物产生分 离作用。
高效液相色谱固定相和流动相
高压液相色谱HPLC培训教程(六)IV．固定相和流动相在色谱分析中，如何选择最佳的色谱条件以实现最理想分离，是色谱工作者的重要工作，也是用计算机实现HPLC分析方法建立和优化的任务之一。
本章着重讨论填料基质、化学键合固定相和流动相的性质及其选择。
一、基质（担体）HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质，也可以是有机聚合物基质。
无机物基质主要是硅胶和氧化铝。
无机物基质刚性大，在溶剂中不容易膨胀。
有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。
有机聚合物基质刚性小、易压缩，溶剂或溶质容易渗入有机基质中，导致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最终使柱效降低。
1．基质的种类1）硅胶硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。
除具有高强度外，还提供一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。
硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。
缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。
通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2~8。
硅胶的主要性能参数有：①平均粒度及其分布。
②平均孔径及其分布。
与比表面积成反比。
③比表面积。
在液固吸附色谱法中，硅胶的比表面积越大，溶质的k值越大。
④含碳量及表面覆盖度（率）。
在反相色谱法中，含碳量越大，溶质的k值越大。
⑤含水量及表面活性。
在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小，其表面硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大。
⑥端基封尾。
在反相色谱法中，主要影响碱性化合物的峰形。
⑦几何形状。
硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶，前者价格较便宜，缺点是涡流扩散项及柱渗透性差；后者无此缺点。
⑧硅胶纯度。
对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱性成份不拖尾。
2）氧化铝具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围。
它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。
但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。
不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的pH稳定性。
2高效液相色谱仪及固定相、流动相
内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两 种或多种不同极性的溶 剂按一定的比例抽入高 压泵中混合。
讨论1
用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品， 以某一比例甲醇-水为流动相时，样品容 量因子较小，若想使容量因子增加，较 好的办法是 A 增加流动相中甲醇的比例 B增加流动相中水的比例 C流动相中加入少量HAc D流动相中加入少量的氨水
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50 m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药残留量进 行分析。
2. 稠环芳烃的分析
稠环芳烃多为致癌物质 反相液-液色谱法 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 ～100%甲醇
广泛应用于生物化工、制药、食品和环境 监测中.
5. 电导检测器（electrical conductivity detector）
属电化学检测器，是离子色谱法中应用最 为广泛的检测器
作用原理：根据物质在某些介质中电离后 所产生的电导变化来测定电离物质的含 量。
五、液相色谱法固定相
1. 固定相的形状 （1）全多孔型
讨论2
在反相色谱法中，若以甲醇-水为流动相， 增加甲醇的比例时，组分的容量因子k与 保留时间tR如何变化？
作业
1.在ODS柱上，以甲醇为流动相，某组分的分配 容量k=1.2,如以乙腈为流动相，其k值是增加 还是减少，为什么？
2.在硅胶柱上，用甲苯为流动相，某组分的保留 时间是30min，如果改用四氯化碳或乙醚为流 动相，试分析该组分的保留时间如何变化？
高效液相色谱仪实验原理
高效液相色谱仪实验原理咱就说这个高效液相色谱仪呀，那可老神奇啦。
它的原理呢，就是利用不同物质在固定相和流动相之间的分配系数差异来进行分离的。
你想啊，就像一群小伙伴在两条不同的路上走，有的小伙伴喜欢在这条路上待着，有的就更喜欢另一条路，这样慢慢的，他们就分开啦。
在高效液相色谱仪里呢，这个固定相就像是一条比较特殊的路，流动相就像带着小伙伴们走的一股力量。
这个流动相带着样品在柱子里跑，柱子里装着固定相。
样品里的各种成分呢，就会根据自己和固定相、流动相的“亲疏关系”，有的跑得快，有的跑得慢。
这样，不同的成分就会在不同的时间从柱子里出来啦。
比如说，有一些物质和固定相的相互作用比较强，那它在柱子里就会待得久一点，出来得就慢；而那些和固定相相互作用弱的物质呢，就会比较快地被流动相带着跑出来。
而且呀，高效液相色谱仪还可以通过检测这些物质从柱子里出来的时间和量，来确定样品里都有啥东西，有多少东西。
这就像是给每个小伙伴都做了个标记，然后看看有多少个这样的小伙伴。
它的原理还涉及到好多好多小知识呢。
比如说这个流动相的选择就很有讲究，不同的流动相可以影响物质的分离效果。
就像不同的交通工具会影响小伙伴们到达目的地的速度和顺序一样。
如果流动相选得不合适，那可能就会导致有些物质分不开，就像小伙伴们挤在一块儿，分不出谁是谁了。
再比如说这个柱子的类型也很重要。
不同的柱子有不同的固定相，就像不同的路有不同的特点一样。
有的柱子适合分离大分子的物质，有的柱子就更擅长分离小分子的物质。
这就像是有的路适合大车走，有的路适合小车走一样。
反正这个高效液相色谱仪的实验原理就是通过这些复杂又有趣的过程，来达到分离和检测样品成分的目的啦。
感觉就像是一场微观世界里的超级马拉松比赛，每个物质都在自己的跑道上奋力奔跑，而我们就在终点等着看谁先到，谁后到，这样就能知道这个样品里都有些啥啦。
高效液相色谱分析法(仪器+组成+分离类型+流动相选择)
2、主 要 部 件
(1) 高压输液泵
主要部件之一，压力：30MPa以上。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ <10μm），液体的流动相高速通过时，将产生 很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱 的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、 流量稳定可调、耐腐蚀等特性
(2)梯度淋洗装置
3.离子交换色谱分离固定相
结构类别： （1）薄壳型离子交换树脂
薄壳玻璃珠为担体，表 面涂约1%的离子交换树脂； （2）离子交换键合固定相
薄壳键合型；微粒硅胶 键合型（键合离子交换基团）
树脂类别： （1） 阳离子交换树脂（强酸 性、弱酸性） （2） 阴离子交换树脂（强碱 性、弱碱性）
4. 空间排阻分离固定相
liquid-solid adsorption chromatography 固定相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝等，较
常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：利用溶质分子占据固定相表面吸 附活性中心能力的差异；适用于分离相对分子 质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合 物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
GC：H = A + B / u + C • u （填充柱）
A = 2λ • dp
A ∝ λ • dp
B = 2γ • Dm = 2γ • Dg B ∝ t R ，B ∝ Dg
Dg
∝
T η
或Dg
∝
T M
B = 2γ • Dm
Dm
∝
T η
柱温T ↓低，流动相η ↑大 ⇒B相忽略
在高效液相色谱中, 液体的扩散系数
(4) 高效分离柱
液相色谱仪的工作原理
液相色谱仪的工作原理液相色谱仪（HPLC）是一种高效分离和分析化学物质的仪器，广泛应用于制药、生物化学、环境监测等领域。
其工作原理基于化学物质在液相流动中的分配和分离特性，通过不同化学物质在固定相和流动相之间的相互作用来实现分离和检测。
1. 流动相在液相色谱仪中，流动相是指用于将样品输送到色谱柱中的溶剂。
流动相通常是由溶剂混合而成的，常用的溶剂包括水、甲醇、乙腈等。
流动相的选择取决于待分离的化合物的特性，如极性、溶解度等。
流动相的选择对色谱分离的效果有重要影响。
2. 固定相固定相是色谱柱中的填料，其作用是将化合物分离开来。
固定相通常是由多孔硅胶或者聚合物制成的微小颗粒，颗粒的大小和化学性质对分离效果起着重要作用。
固定相的选择也取决于待分离的化合物的特性，如分子大小、极性等。
3. 样品注入样品注入是将待分析的化合物引入色谱系统的过程。
通常情况下，样品会被溶解在流动相中，然后通过进样器注入色谱柱。
进样器可以采用不同的方式，如手动注射、自动进样器等。
4. 色谱柱色谱柱是液相色谱仪中最关键的部件之一，其内部填充有固定相。
当样品进入色谱柱后，不同化合物会因为与固定相的相互作用而发生分离，从而实现对化合物的分析和检测。
5. 检测器色谱柱中分离的化合物会通过检测器进行检测和定量分析。
常用的检测器包括紫外-可见吸收检测器（UV-Vis）和荧光检测器等。
检测器会根据化合物的特性产生相应的信号，然后通过数据采集系统进行记录和分析。
6. 数据分析最后，液相色谱仪通过数据采集系统将检测到的信号转化为图谱或者色谱图，进而进行数据分析和定量分析。
数据分析可以帮助人们快速准确地获得化合物的信息，如浓度、纯度等。
总的来说，液相色谱仪的工作原理是基于化学物质在固定相和流动相之间的相互作用来实现分离和检测。
通过流动相、固定相、样品注入、色谱柱、检测器和数据分析等步骤，液相色谱仪能够快速准确地分离和分析化合物，为化学分析提供了重要的技术手段。
液相色谱的固定相与流动相
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4. 选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定 相等。
（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
第三节 固定相与流动相
stationary phase and mobile phase
第四节 影响分离的因素与操作条件选择
factors influenced separation and choice of operation condition
第五节 离子色谱法
ion chromatograph
（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
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化学键合固定相的特点
第六节 超临界流体色谱
supercritical fluid chromatograph
结束
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感谢您的观看！
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（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正 相柱。
（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液 液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上 的出峰顺序相反。
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高效液相色谱仪原理
高效液相色谱仪原理高效液相色谱仪（HPLC）是一种分离和分析化合物的重要仪器，它在化学、生物化学、药学、环境监测等领域有着广泛的应用。
其原理是利用高压将溶液通过填充有固定相的色谱柱，利用不同化合物在固定相上的分配系数差异来实现分离。
下面将详细介绍高效液相色谱仪的原理。
首先，高效液相色谱仪的工作原理是基于溶液在固定相上的分配与再分配。
当溶液通过色谱柱时，固定相会对溶质进行吸附或排斥，从而使得不同化合物在色谱柱中停留的时间不同，最终实现分离。
而高压泵则是为了提供足够的压力，使得溶液能够快速通过色谱柱，从而提高分离效率。
其次，色谱柱是高效液相色谱仪中至关重要的部件。
色谱柱通常由不同的填料组成，如疏水性填料、离子交换填料等。
这些填料能够与溶质发生相互作用，从而实现分离。
此外，色谱柱的尺寸和形状也会影响分离效果，因此选择合适的色谱柱对于获得良好的分离效果至关重要。
另外，检测器是高效液相色谱仪中另一个重要的组成部分。
常见的检测器包括紫外-可见吸收检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
这些检测器能够对色谱柱中分离出的化合物进行检测和定量分析，从而得到样品的浓度和纯度等信息。
最后，高效液相色谱仪的工作原理还涉及流动相和固定相的选择。
流动相的选择可以影响分离的速度和效果，而固定相的选择则直接影响到溶质在色谱柱中的分配行为。
因此，在实际应用中，需要根据样品的特性和分离的要求来选择合适的流动相和固定相。
综上所述，高效液相色谱仪的原理是基于溶质在固定相上的分配与再分配实现的。
通过合理选择色谱柱、检测器、流动相和固定相，可以实现对化合物的高效分离和分析。
这些原理的理解对于高效液相色谱仪的正确操作和数据解释至关重要，也为其在科学研究和工业生产中的应用提供了理论基础。
高效液相色谱法常用的流动相
高效液相色谱法常用的流动相
高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的分离和分析技术，其流动相的选择对分离效果至关重要。
常用的流动相分为以下几种：
1. 甲醇：甲醇是一种常用的有机溶剂，具有良好的溶解性和极性。
在反相色谱中，甲醇常与水混合作为流动相，以实现对极性物质的分离。
2. 乙腈：乙腈是一种有机溶剂，具有较高的极性。
与甲醇类似，乙腈也可以与水混合作为流动相，用于反相色谱中对极性物质的分离。
3. 水：水是一种无机溶剂，具有良好的极性。
在正相色谱中，水常与有机溶剂（如甲醇、乙腈等）混合作为流动相，以实现对极性物质的分离。
4. 乙酸乙酯：乙酸乙酯是一种有机溶剂，具有较弱的极性。
在正相色谱中，乙酸乙酯可以与水混合作为流动相，用于分离弱极性物质。
5. 庚烷：庚烷是一种非极性有机溶剂，适用于分离非极性物质。
在反相色谱中，庚烷可以与甲醇或乙腈混合作为流动相。
6. 混合溶剂：根据被测物的极性和分离需求，可以选用两种或多种溶剂混合作为流动相。
例如，甲醇与水混合用于反相色谱，乙腈与水混合用于正相色谱等。
流动相的选择应考虑以下因素：
1. 被测物的极性：根据被测物的极性选择相应的流动相，以实现良好的分离效果。
2. 固定相的选择：根据固定相的极性，选择与之匹配的流动相。
3. 检测器的要求：某些检测器对流动相的极性有要求，需根据检测器类型选择合适的流动相。
4. 实验条件：如流速、柱温等实验条件，也会影响流动相的选择。
在高效液相色谱法中，常用的流动相包括甲醇、乙腈、水、乙酸乙酯、庚烷等，具体选择需根据被测物的极性、固定相、检测器要求等因素综合考虑。
第十八章 高效液相色谱法
5 10 72.1
( P2' 8.7 ) / 2
P2' 8.7 1.16 2
6.38 5.1 (1 ) 10.2
= 0.75
即调整溶剂比例为 75%甲醇和25%水可使该组分的 k 值为5。
四、正相键合相色谱法
固定相：极性键合相
如－CN、－NH2或二羟基键合硅胶
）。
A 样品的k降低，tR降低 B 样品的k增加，tR增加 C 相邻组分的增加 D 对基本无影响
2．用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品，以某一比例甲醇一水为 流动相时，样品容量因子较小，若想使容量因子适当增加，较好 的办法是（ ）。 A 增加流动相中甲醇的比例 C 流动相中加人少量HAc B 增加流动相中的水的比例 D 流动相中加人少量的氨水
五、反相键合相色谱法
1. 固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶
流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等
应用：非极性至中等极性的组分，还有有机酸、碱及盐等
2. 保留机制：疏溶剂理论
溶质的保留主要是溶质分子与
极性溶剂分子间的排斥力，促
P
' mix
i Pi
i 1
n
'
式中i 为混合溶剂中各溶剂的体积百分数。 二元混合溶剂的则为
P P B P
' AB ' A A
式中A， B分别为二元混合溶剂中溶剂A和溶剂B的体积百分数。
溶剂的选择性
溶剂可分为八组而分别位于图中不同区。 I 组的 xe值较大， 属质子受体溶剂； VII 组的 xd 值较大，属质子给于体溶剂； V 组
关于高效液相色谱色谱柱、流动相以及检测器的选择
关于高效液相色谱色谱柱、流动相以及检测器的选择1.概述高效液相色谱已成为化学、医学、工业和法学等学科领域中一项十分重要的分离分析技术。
近年来，我国对食品安全有了更高的关注度，越来越多的研究人员将高效液相色谱应用于食品安全检测中，获得了良好的效果。
高效液相色谱是色谱法中十分重要的一个分支，这项技术采用高压输液系统将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂作为流动相，由流动相携带需测定的混合物液体泵入有固定相的色谱柱中，而在色谱柱中各成分能够得到有效的分离，分离完成后将其输送到检测器中进行检测，能帮助工作人员对样本进行有效的分析，了解其中存在的不同物质。
高效液相色谱在应用过程中可通过选择固定相和流动相以及调节流动相比例达到最优的分离效果，不仅速度较快且重复性较高，检测时间能控制在十几分钟至几十分钟。
同时高效液相色谱柱能反复使用，在进样分离测定时为仪器自动化处理，具有较高的分析精度，可减少人为干扰及误差。
2.高效液相色谱色谱柱的选择童优芸[1]等人使用高效液相色谱法同时检测液体食品中6种人工合成色素，该研究选择的色谱柱为美国安捷伦XDB-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)。
色谱柱是分离的核心，选择色谱柱的要求是柱效高、选择性好、分析速度快等。
市售的用于HPLC的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、多孔碳等，其粒度一般为3、5、7、10 μm等。
C18和C8色谱柱的应用较为广泛，都属于反相色谱柱。
C8适合分析大分子类的物质，其对同一个物质的保留能力比C18柱弱，保留时间比C18柱早，一些物质出峰过于靠前时使用C8柱很难实现分离。
C18柱对中等极性化合物保留最强，主要应用于羧基、脂肪酸、苯胺、甘油酯等物质的测定，对分子量较小的物质有较好的分离效果。
因此，考虑合成色素的保留时间和分离度，选用C18柱作为此次试验的色谱分析柱。
刘艳荣[2]等人在保健食品中叶黄素总量的高效液相色谱分析测定中选择的色谱柱为C18色谱柱，5μm,250 mm×4.6 mm（内径），在该研究中比较了C18和C30这两种色谱柱的分离效果，结果表明，叶黄素都能很好的出峰。
第十章高效液相色谱分析法第三节高效液相色谱固定相与流动相
第十章高效液相色谱分析法第三节高效液相色谱固定相与流动相高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种使用高压泵将样品溶液通过固定相柱进行分离和分析的方法。
在HPLC中，固定相和流动相是非常重要的组成部分，对于分离和分析的效果起着决定性的作用。
1.高效液相色谱固定相高效液相色谱固定相是指填充在色谱柱中的材料，它起到分离样品的作用。
常见的固定相有：（1）硅胶固定相：硅胶是一种多孔材料，具有较大的比表面积，能够有效地吸附样品分子，是一种通用的固定相材料。
（2）反相固定相：反相色谱是基于样品中非极性化合物与反相固定相之间的亲水作用力不强而进一步分离的一种方法。
常见的反相固定相有碳链固定相（如C18、C8等）和脂肪酸链固定相（如ODS、ODPS等）。
（3）离子交换固定相：离子交换色谱是通过固定相中的离子交换基团与样品中的离子之间的相互作用来实现分离的一种方法。
常见的离子交换固定相有阴离子交换基团和阳离子交换基团。
（4）亲和层析固定相：亲和层析是一种根据样品中分子与固定相中的特殊结构之间的亲和作用力来实现分离的方法。
常见的亲和层析固定相有金属离子螯合固定相、抗体亲和固定相等。
2.高效液相色谱流动相高效液相色谱流动相是指用于输送样品溶液的溶剂。
它在分离和分析过程中起到溶解和移动样品分子的作用。
根据溶剂的极性不同，可以分为非极性溶剂、极性溶剂和离子对溶剂。
（1）非极性溶剂：如正己烷、甲苯，主要用于非极性物质的分离。
（2）极性溶剂：如乙醇、乙酸乙酯，主要用于极性物质的分离。
（3）离子对溶剂：如甲酸和甲醇的混合物，主要用于离子性物质的分离。
离子对溶剂一般用于反相色谱中，可以增加色谱的选择性。
高效液相色谱固定相和流动相的选择主要根据被分离物的性质、分析的需求和设备的特点来确定。
对于样品中多种成分的分离，可以采用多种固定相和流动相的组合，以达到最佳的分离和分析效果。
安捷伦高效液相色谱仪原理
安捷伦高效液相色谱仪原理
安捷伦高效液相色谱仪的原理主要是基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的。
在色谱过程中，样品中的各组分在固定相中的滞留时间不同，因此会按一定顺序从固定相中流出。
这个过程也称为色层法或层析法。
具体来说，安捷伦高效液相色谱仪的工作流程如下：
1.输液泵将流动相（经过在线过滤器）以稳定的流速（或压力）输送至分析体系。
2.在进入色谱柱之前，通过自动进样器将样品导入。
3.流动相将样品带入色谱柱。
4.在色谱柱中，各组分因在固定相中的分配系数不同而被分离，并依次随流动相流至检测器。
5.检测器检测到的信号被送至数据系统记录、处理或保存。
这就是安捷伦高效液相色谱仪的原理和基本工作流程，它是一种非常有效的分离和分析方法，在科学研究和工业生产中有着广泛的应用。
高效液相色谱对流动相的要求
高效液相色谱对流动相的要求是什么呢对于高效液相色谱来说，流动相的选择是非常重要的。
以下是一些对于流动相的基本要求：
1、流动相应与固定相相容，即不会与固定相发生化学反应或物理吸附。
2、流动相应具有合适的极性和沸点，以便在色谱柱中进行分离。
3、流动相应具有足够的纯度，以保证在色谱柱中不会产生背景杂质或干扰峰。
4、流动相应具有合适的pH值，以保护色谱柱和检测器，同时保证样品的完全分离。
5、流动相应具有合适的缓冲能力，以保持分离峰的稳定性和分离效果。
6、流动相应具有合适的流速和流量，以保证分离效果和分离速度。
7、流动相应易于更换和再生，以保持色谱柱的性能和延长其使用寿命。
因此，在选择流动相时，需要根据具体的实验条件和样品特点进行综合考虑，选择最适合的流动相，以确保高效液相色谱分析的准确性和可靠性。
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光电二极管阵列检测器
3. 差示折光检测器（differential refractive index detector） 除紫外检测器之外应用最多的检测器；
可连续检测参比池和样品池中溶液的折光 指数差值。差值与浓度呈正比；
特点：
通用型检测器 ; 灵敏度低（10-7g.mL-1），不能用于痕量分 析; 对温度敏感，要求使用温度恒定; 对流动相流量变化敏感，不能用于梯度洗脱。
六、液相色谱法流动相
1. 流动相特性 2. （1）流动相的种类、配比可显著改变组
分分离状况； 3. （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相
， 称为正相液液色谱法; 4. （3）流动相的极性大于固定液的极性，
则称为反相液液色谱 。
组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。
2. 流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗
外梯度: 两台高压泵， 将两种不同极性的溶剂 按一定的比例送入梯度 混合室，混合后进入色 谱柱。
内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两 种或多种不同极性的溶 剂按一定的比例抽入高 压泵中混合。
讨论1
用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品， 以某一比例甲醇-水为流动相时，样品容 量因子较小，若想使容量因子增加，较 好的办法是 A 增加流动相中甲醇的比例 B增加流动相中水的比例 C流动相中加入少量HAc D流动相中加入少量的氨水
高压泵按其性质可分为恒压泵、恒流泵两类
1）往复式柱塞泵： 恒流 泵； 易于更换溶剂，适用于梯 度洗脱但有脉冲波动，可 以加一阻尼器抑制脉冲。
2）气动放大泵： 恒压泵 液缸体积大，更换流动相 不方便，不便于梯度洗脱， 无脉冲、稳定流量的输出, 现多用于装柱。
二、进样装置
a. 停留进样装置：
b. 缺点：不能承受高压，须停流进样； 无法取得精确的保留时间
a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
化学键合固定相的特点 （1）传质快，表面无深凹陷; （2）寿命长， 无固定液流失，耐流动相冲 击； （3）选择性好，可键合不同官能团 ； （4）有利于梯度洗脱；
装柱方法：有干法和湿法，按粒度20μm 划分。
柱温控制
下列几种情况需要控制柱温： 法定标准分析方法中，要求保留时间具
有再现性； 必须通过改变柱温来提高分离效率； 对高分子化合物或黏度大的样品； 对一些具有生物活性的生物分子； 对一些组成复杂的样品，使用二维色谱
技术。
四、液相色谱检测器
1.紫外检测器: 应用最广，对大部分有机化合 物有响应。
滤膜过滤。
2．脱气装置
作用：脱去流动相中的溶解气体。
(1)吹氮脱气法 (2)加热回流法 (3)抽真空脱气法 (4)超声波脱气法 (5)在线真空脱气法(on—1ine degasser)
3、 高压输液泵
输送流动相
压力：150～350×105 P 输液泵的稳定性直接关系到分析结果 的重复性和准确性。
讨论2
在反相色谱法中，若以甲醇-水为流动相， 增加甲醇的比例时，组分的容量因子k与 保留时间tR如何变化？
作业
1.在ODS柱上，以甲醇为流动相，某组分的分配 容量k=1.2,如以乙腈为流动相，其k值是增加 还是减少，为什么？
2.在硅胶柱上，用甲苯为流动相，某组分的保留 时间是30min，如果改用四氯化碳或乙醚为流 动相，试分析该组分的保留时间如何变化？
骂 道 ： “ 这 小子， 今天疯 了，哈 怂货！ ”
李 金 柱 是 这个 村子———李 平 台村 里的人 。在李 平台最 有名的 东西有 两件： 第 一 是 利 平 台的金 菊花。 李平台 的后山 坡上常 年长着 一片金 黄色的 野菊花 。每逢 秋 天 ， 金 黄 金黄的 花朵在 阳光下 能折射 太阳的 亮；漫 山遍野 的香能 遮挡住 秋风的 寒 。 第 二 就 是这“ 名人” 李金柱 了。李 金柱的 名气大 到成为 了家家 户户教 育孩子 的 典 范 。 谁 家的小 孩子不 成材， 不好学 ，就会 被家长 狠狠的 教育： “再不 好好学 习 ， 以 后 长 大了也 想李金 柱一样 没有出 息！” 谁家的 小孩子 办了个 蠢事， 那就成 了 典 型 的 “ 李金柱 第二” 了。李 金柱的 名气来 头还得 从他的 经历说 起。李 平台村 本 来 是 个 用 当地人 来说， 是个鸟 不拉屎 的穷村 子。在 当地有 个歌谣 ：“夏 天光着 腚 ， 冬 天 打 补丁， 问谁一 穷二白 ，那是 李平台 ”。孩 子们到 了成家 的年龄 ，李平
3. 流动相的选择
常用溶剂的极性顺序：水、酰胺、腈、醇、酮、 酯、醚、烃类, etc. 流动相可分为：底剂及洗脱剂 底剂：决定基本的色谱分离情况； 洗脱剂：调节试样组分的滞留并对几个组分具 有选择性的分离作用。
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
4. 荧光检测器（fluorescence detector）
许多有机化合物，特别是芳 香族化合物、受紫外光激发 后能够辐射出荧光。
高灵敏度(比紫外检测器高两个数量级，达 10-11g.ml-1)
高选择性; 线性范围窄； 测量中不能使用抑制、吸收荧光的溶剂；
对不产生荧光的物质，可使其转变成荧光 物质；
作用原理：被分析试样组分对特定波长紫外 光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关 系遵守比尔定律。
特点：
灵敏度高，可达10-9g.mL-1； 线性范围高； 可用梯度洗脱； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 不适用于对紫外不吸收的试样； 紫外光不透过的溶剂不能用（苯等）。
2. 光电二极管阵列检测器
紫外可见光度检测 器的重要进展； 1021个二极管阵列， 各检测某一特定波 长，无需停流扫描 而观察色谱柱流出 物的各个瞬间的动 态光谱吸收图
3. 在液相色谱法中，梯度淋洗适用于分离何种 试样？
2）离子交换色谱流动相 组分保留值可通过流动相中盐浓度及pH来调节
人干扰素-γ等电点8.5 底剂：50mmol/L 磷酸盐缓冲液，pH8.0 洗脱剂： 50mmol/L 磷酸盐缓冲液，pH8.5，1mol/L NaCl
七、高效液相色谱的应用
1. 环境中有机氯农药残留量分析
b. 高压定量进样阀：（六 通阀进样装置）
c. 优点：进样准确，重 现性好，适于定量分析
d. c.自动进样器：计算机 控制，适合大量进样。
三、高效分离柱 色谱柱是实现分离的核心部件。发展趋 势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
常规液相色谱柱 1～6 mm，10～50 cm。 微孔填充柱 0.5-1mm 毛细管柱 30-50µm
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50 m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药残留量进 行分析。
2. 稠环芳烃的分析
稠环芳烃多为致癌物质 反相液-液色谱法 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 ～100%甲醇
仪器分析课程讲义
第四节 高效液相色谱仪
目录
高效液相色谱仪 高效液相色谱的固定相和流动相
太 阳 还 有 一竿 子高的 时候， 李金柱 就骑着 他那辆 除了铃 不响， 什么都 响的 “ 二 八 ” 破 驴吱吱 扭扭地 从夕阳 的方向 飞奔过 来了。 路边闲 坐着下 棋的老 头们也 被 这 车 子 刺 耳的嚎 叫从楚 河汉界 的厮杀 中回过 神来。 看到夕 阳下热 的湿透 了整个 后 背 ， 白 色 的的良 布衬衫 紧紧的 粘在后 背上的 ，阳光 下反光 的背影 ，老头 们齐声
线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 ºC 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器
正相和反相色谱的区别
比较项目
正相色谱
反相色谱
固定相
极性
非（弱）极性
流动相
非（弱）极性 极性
流出次序
极性组分k大 极性组分k 小
流动相极性的影 极性增加，k减 极性增加，k增
响
小
大
广泛应用于生物化工、制药、食品和环境 监测中.
5. 电导检测器（electrical conductivity detector）
属电化学检测器，是离子色谱法中应用最 为广泛的检测器
作用原理：根据物质在某些介质中电离后 所产生的电导变化来测定电离物质的含 量。
五、液相色谱法固定相
1. 固定相的形状 （1）全多孔型
最初由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多 孔球体 100μm的大颗粒，表面涂渍固定液。 传质速度慢，柱效低。 现采用10μm以下的小颗粒 。
（2）表面多孔型(薄壳型微珠)
30～40μm的玻璃微球，表面附着一 层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，传质速度快，但柱容量低；
2.液-固吸附固定相 极性：硅胶、氧化镁、分子筛 等； 非极型：高聚物微球、石墨化碳黑、聚合
台 的 男 孩 都 想娶个 外村的 媳妇， 李平台 的女孩 都想嫁 到别
6.2 高效液相色谱仪
输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统
一、输液系统
1．贮液器 贮液罐的材料应耐腐蚀，对溶剂呈惰性，
容积约为0．5—2．0L； 贮液罐放置要高于泵体； 使用过程贮液罐应密闭； 溶剂在放入贮液罐之前必须经过0．45um
正相液-液分配分离（液固色谱极性固定相）： 底剂：低极性的溶剂，如正己烷、苯、氯仿等， 洗脱剂：根据试样的性质选取中等极性溶剂如醚、 酮、醇等。 反相色谱（液固色谱非极性固定相）： 底剂： 水。 洗脱剂： 有机溶剂作为极性调节剂。
4 梯度洗脱
梯度洗脱，与气相色谱中的程序升温一样， 可极大地改善分离效果