植物细胞融合

植物细胞融合

一、细胞融合的目的和意义

细胞融合能实现远缘杂交。其意义在于打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限，有可能形成有性杂交方法无法获得的新型杂种植物，广泛组合各种基因型，扩大了遗传物质的重组范围。

二、细胞融合（cell fusion)概念

在外力（诱导剂或促融合剂）作用下，两个或两个以上的异源细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。

通过细胞培养技术，这个细胞有可能发育成完整的生物个体，这个杂种后代有可能兼有两个上代的一些优良性状。

三、PEG诱导原生质体融合的机理：

带有大量负电荷的PEG与水之间的氢键结合，使溶液中自由水消失，由于高度脱水引起原生质体凝集，形成大小程度不同的凝集物。原生质体发生皱缩并大大扭曲变形，邻近原生质体之间紧密接触。在原生质体细胞膜与膜紧密接触的部位，膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。接着可能是相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的类脂质与类脂质反应。继之，类脂质分子的扰动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合，形成很小的细胞质桥，之后它逐渐扩大，两个原生质体最终融合。使用化学促融剂时，Ca2+是必需的。关于Ca2+的作用机理，有的认为是Ca2+和PO43-形成不溶于水的配合物，成为细胞间的钙桥，由此引起融合。也有解释为Ca2+结合到带负电磷脂的电离基上，使磷脂分子在膜上相互分离，由此引起融合。

四、实验材料、试剂和仪器

1.材料：无菌烟草叶片、洋葱根尖

2.试剂

1）酶混合液，配制分两部进行：

a.将CaCl2.2H2O 7 mmol/L (1.029g/L)

NaH2PO4.2H2O 0.7mmol/L (0.1092g/L)

MES 3 mmol/L (0.585g/L？)

甘露醇0.5 mmol/L(0.0911g/L)

用重蒸馏水溶解，调pH5.6，定容为酶储备液，灭菌备用。

b.使用时再加入：

纤维素酶R-10 0.8%

果胶酶R-10 1%

(因酶制剂经过高压灭菌处理后会失活，故先将酶储液灭菌，待用时再将酶制剂

按比例加入到第一步已灭菌的酶液内。)

2）配制CaCl2.2H2O 0.16mol/L(23.52g/L)（pH5.8-6.2 用于悬浮原生质体）

3）PEG液(用时现配)：

PEG (MW=6000) 30%（w/v) (即300g/L)

CaCl2.2H2O 0.01mol/L

KH2PO4 0.00074mol/L

山梨醇（分子式：C6H14O6）0.1 mol/L

调pH 5.8-6.2。

3.仪器

1）大型仪器：高压灭菌锅，超净工作台，离心机，倒置显微镜。

2）一般器材：

大小培养皿，小烧杯，小滴管，刻度离心管，小漏斗，不锈钢网300目

五.实验步骤

实验路线：烟草叶肉及洋葱根尖原生质体酶解分离→提纯原生质体并调整原生质体密度→PEG法使原生质体融合→倒置显微镜观察并照相

具体步骤：

1.取酶储液10ml，加入纤维素酶0.08g和果胶酶0.1g，制备酶液。

2.取材：烟草、洋葱根尖各0.7g

取洋葱根尖，并将其切成0.5cm长短大小放入小平皿中；取烟草叶片将其剪

成0.5cm2大小放入小平皿中。

3.酶解：将酶液等量加入到存有实验材料的平皿中，放入25℃培养箱酶解。洋葱约

4h，烟草约3h。

4.观察酶解效果

5.原生质体的分离和纯化

○1酶解后，用300目铜网过滤酶液，去除未酶解的杂质，将滤液收集在10ml离心管中。

○21000转/分离心3分钟，用吸管或移液枪弃上清（注意不要把收集的原生质体吸走）。

○3用CaCl2·2H2O（约1ml）悬浮下面的原生质体（PEG法）。

○4显微镜观察提纯后的原生质体，若杂质较多可重复○1～○3操作。

6.原生质体的密度测定

用血细胞记数板记数。每一样品测定3次，根据测定结果，将悬浮原生质体密度调整至5×105个/ml。

7.原生质体的融合

PEG法

1）配制PEG液（5ml）

30%（w/v) PEG(MW=6000) 1.5 g

CaCl2·2H2O 0.0074g

KH2PO40.0005 g

山梨醇0.0911g

调pH 5.8～6.2

2）将两种原生质体悬液等量混合

3）用刻度吸管将混合的原生质体悬液滴在直径为60mm的平皿中，每皿7~8滴，每滴约0.1ml。然后静置10分钟，使原生质体贴在皿底上，形成一薄层（应

有3~5个平皿的重复）。

4）用吸管将等量的PEG溶液缓慢地加在原生质体液滴上，再静置10~15分钟。

此时可取一个平皿在倒置显微镜上观察原生质体间的粘连。