体外抗体形成细胞
单克隆抗体技术的基本原理
单克隆抗体技术的基本原理
单克隆抗体技术是一种通过体外合成获得具有单一抗体特异性的抗体的方法。
它的基本原理是将目标抗原注射到动物体内，使其免疫系统产生多种抗体。
然后，从动物的脾脏或骨髓中提取免疫细胞，并与癌细胞融合形成杂交瘤。
杂交瘤是一种具有细胞融合能力的免疫细胞，在体外环境中能够不断增殖，并持续产生抗体。
这些杂交瘤细胞称为“克隆”，每个克隆对应一种特定的抗体。
在获得这些抗体的克隆细胞后，科学家使用细胞培养和筛选技术，筛选出能够高效产生目标抗体的克隆细胞。
通过单克隆抗体技术，可以得到高纯度、高特异性的抗体。
这些抗体可以用于检测特定抗原的表达、分析细胞信号传导、研究蛋白质功能等领域。
与传统的多克隆抗体相比，单克隆抗体具有更好的重现性和稳定性，因此在医学诊断和生物学研究中有广泛应用。
溶血空斑实验报告
一、实验目的1. 掌握溶血空斑实验的基本原理和方法。
2. 了解溶血空斑实验在免疫学中的应用。
3. 检测实验动物抗体形成细胞的功能。
二、实验原理溶血空斑实验（Plaque Forming Cell assay, PFC）是一种体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的方法。
其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔或小鼠，取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液，与高浓度绵羊红细胞混合后加入琼脂糖凝胶中。
其中每个释放溶血性抗体的B淋巴细胞在补体的参与下可溶解周围的绵羊红细胞，在周围形成一个可见的空斑。
一个空斑代表一个抗体形成细胞（即B细胞），空斑的数量反映机体的体液免疫功能。
空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。
三、实验材料与试剂1. 器材：平皿、37℃水浴箱、离心机、显微镜、移液器、吸管等。
2. 试剂：（1）SRBC悬液：取无菌脱纤维羊血，用NS或PBS离心洗涤3次，每次以2000rpm，5min，用PH7.2的PBS（含Ca2+、Mg2+）悬成细胞浓度为2.0×10^9个/mL。
（2）Hanks液（含Ca2+、Mg2+）：将琼脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7%两种浓度。
（3）底层基：将琼脂糖用Hanks液配成1.4%浓度。
（4）表层基：将琼脂糖用Hanks液配成0.7%浓度。
（5）补体：新鲜豚鼠血清或小牛血清，56℃灭活30min。
四、实验方法1. 免疫脾细胞悬液的制备（1）小鼠免疫：取10只小鼠，每只小鼠腹腔注射1ml SRBC悬液，免疫3次，每次间隔2周。
（2）脾细胞悬液的制备：无菌取小鼠脾脏，剪碎，用生理盐水洗涤，加入适量生理盐水制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1.0×10^6个/mL。
2. 溶血空斑实验（1）将底层基加入平皿中，置于37℃水浴箱中溶化。
（2）取适量脾细胞悬液加入底层基中，轻轻混匀。
（3）加入适量表层基，轻轻混匀。
（4）加入适量补体，轻轻混匀。
（5）将平皿置于37℃水浴箱中孵育4h。
抗体产生的原理
抗体产生的原理
抗体产生的原理是通过机体的免疫系统来应对外来入侵的病原体。
当病原体进入机体后，机体的免疫系统会识别它们并进行相应的应激反应。
其中，B细胞是主要的抗体产生细胞。
抗体产生的过程可以分成两个阶段：抗原刺激和抗体合成。
首先，当病原体进入机体后，它们的特异抗原会被识别并结合到B细胞上，即抗原刺激。
这个过程受到细胞介导免疫应答
和体液介导免疫应答两种机制的调控。
在接收到抗原刺激后，B细胞会进一步分化为两种形式：浆细
胞和记忆B细胞。
浆细胞是一种专门合成和分泌抗体的细胞，而记忆B细胞则会长期保存在体内，以便在再次遇到相同病
原体时迅速产生抗体。
接下来是抗体合成的过程。
在细胞内，B细胞会通过基因重组
产生特异性的抗体基因，进而合成相应的抗体蛋白。
这些抗体蛋白通过分泌出B细胞表面的免疫球蛋白M（IgM）进入体液循环，并与抗原结合形成抗原-抗体复合物，从而中和或清除
病原体。
值得一提的是，抗体的产生不仅能够应对外来病原体，在疫苗接种后也能够提供免疫保护。
疫苗中的抗原刺激可激活B细
胞并诱导抗体产生，从而让机体在未来遇到相同病原体时能够更快产生抗体，有效预防疾病。
总而言之，抗体产生的原理是通过机体免疫系统的反应，识别并结合到病原体抗原，进而分化为合成抗体的浆细胞和保存在体内的记忆B细胞，最终产生特异性的抗体来应对外来入侵的病原体。
免疫学实验
考试题型：填空题，选择题，名词解释（4题），问答题（3题）《免疫学实验》复习题1、多克隆抗体：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。
所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。
2、免疫血清：将抗原注入机体所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，含有这种特异性抗体的血清。
3、再次应答：免疫系统对感染病原的首次入侵产生记忆作用，在相同病原体再次入侵时，产生更快和更强的应答，称之为再次免疫应答。
4、补体溶血反应:动物接受异种红细胞注射而免疫，于血清中产生特异性抗体（即溶血素），此红细胞与相应特异抗体结合，在电解质存在时能发生凝集，若再有补体参与，红细胞则被溶解，称溶血反应。
5、ELISA：即酶联免疫吸附试验，是一种把抗原抗体反应的特异性和酶的专一高效催化底物的能力通过化学方法两者相结合后，再将可溶性抗原或抗体吸附在固相载体上，使免疫反应在载体上进行，然后借助特异结合的标记抗体上显示的酶活性，通过测定酶催化底物所得的产物来判断抗原或抗体的量。
6、包被：抗原或抗体固定化的过程称为包被(coating)。
7、封板：包被好的固相载体表面常留有少量未吸附位点，可非特异地吸附测定时加入的标本和酶标记物中的蛋白质，导致本底偏高。
因此需用1％～5％牛血清白蛋白或5％～20％小牛血清等包被一次，消除上述干扰，此过程称为封闭。
8、直接凝集反应：细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应。
9、间接凝集反应：将可溶性抗原（或抗体）先吸附或偶联与免疫无关大小适当的颗粒性载体的表面，使之成为致敏载体颗粒，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象，称间接凝集反应。
10、E玫瑰花环试验：正常人的T淋巴细胞表面具有能与绵羊红细胞（SRBC）表面糖肽相结合的受体（E受体），即CD2分子，是T细胞所特有的表面标志，在体外一定条件下T细胞能直接与SRBC结合，形成玫瑰花样细胞团，称为E花环。
医学免疫学实验：溶血空斑形成实验
溶血空斑形成实验一、实验目的学习溶血空斑形成实验的实验原理与步骤，掌握用溶血空斑形成实验检查动物的抗体产生功能。
二、实验原理溶血空斑试验，又称空斑形成细胞（Plague Forming Cel , PFC ）试验，是一种体外检测抗体形成细胞的方法。
将一定量洗涤过的绵羊红细胞注射入小鼠腹腔，四天后将小鼠杀死，取脾脏制成脾细胞悬液，内含抗体形成细胞。
然后将脾细胞、绵羊红细胞，补体混合孵育。
由于脾细胞所分泌的抗体和绵羊红细胞表面抗原结合形成抗原抗体复合物，在补体作用下可使红细胞溶解，于特制的小室内形成肉眼可见的溶血空斑。
一个空斑即代表一个抗体形成细胞。
三、实验材料1.解剖器械、试管、1ml 吸量管2.载玻片、石蜡盘、酒精灯、微量加样器3. BALBC 小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供）4.5％和10％绵羊红血球（SRBC )5.补体（豚鼠血清，经SRBC 吸收，临用时稀释成合适浓度）四、实验步骤1.腹腔注射0.5mlSRBC,4天后拉颈椎处死，取出脾放在已加入6ml Hank液的平皿中，用100目不锈钢网研磨过滤混匀。
2.吸取1ml加入试管中，加满Hank液混匀，离心1000rpm，10min。
3.吸取1ml Hank液加入试管中，重悬脾细胞沉淀，细胞密度约1 ×107/ml。
4.取1 ×107/ml 脾细胞100μl；10%SRBC 200 μl；补体200 μl；Hank液1ml。
5.混匀后，用尖吸管灌小室、封蜡、标记、平放于玻片盘，37 ℃孵育30min。
五、实验结果肉眼观察空斑，计数小室出现的溶血空斑数，对于模糊不清的空斑，可以在低倍镜下观察。
注意区分气泡和溶血空斑，真正的溶血空斑中心必有一个淋巴细胞。
加试管1混合液的小室有多个透明的溶血空斑形成，加试管2混合液的小室（对照）没有。
一个空斑即代表一个空斑形成细胞（抗体形成细胞）。
六、讨论1.在小室注入液体时不要留有气泡。
溶血空斑试验PFC试验PPT课件
4、制备灌注液：
实验组：脾细胞悬液100μl＋15％SRBC 100 μl＋补体 100 μl＋Hank’s液500 μl
对照组：脾细胞悬液100μl＋15％SRBC 100 μl＋Hank’s 液600 μl
5、灌注小室: 2管分别灌注2个小室，石蜡密封小室的两侧 6、 孵育： 37℃培养箱中40min
（三）材料与器材
1、小鼠，5％和15％SRBC，补体，Hank’s液 2、解剖器械，试管，载玻片，石蜡，100目不锈钢
网，双面胶带 3、37℃培养箱
（四）实验方法
1、免疫小鼠：4天前5％SRBC腹腔注射免疫小鼠
2、制备脾细胞悬液：颈椎脱臼处死小鼠，取脾在不锈钢 网上研磨（7 ml Hank’s液），1000 rpm离心6 min，去上 清，加1 ml Hank’s液悬浮脾细胞
溶血空斑试验
PFC实验
（一）实验目的
掌握PFC实验原理、实验操作和结果观察；
（二）实验原理
溶 血 空 斑 试 验 或 空 斑 形 成 细 胞 试 验 （ Plague forming cell, PFC)，体外检测抗体形成细胞。 1、SRBC＋B细胞＝记忆性B细胞（抗体形成细胞） 2、SRBC＋抗体形成细胞＝（抗原＋抗体复合物） 注意事项
（1）小室注入液体时不要留有气泡； （2）小室边缘需用石蜡封严； （3）37℃孵箱孵育时，必须放平，不可倾斜；
（六）实验结果
观察溶血空斑现象 区分： 溶血空斑：比周围颜色浅，折光性差，边缘不整齐。 气泡：比周围亮，折光性好，边缘整齐。
讨论
• 分析溶血空斑形成的原因
抗体生成细胞实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解抗体生成细胞的分离和培养方法。
2. 学习观察和记录抗体生成细胞的形态变化。
3. 掌握抗体生成细胞活性检测的基本技术。
二、实验原理抗体生成细胞是指能够产生抗体的细胞，通常为B淋巴细胞。
在抗原刺激下，B淋巴细胞分化为浆细胞，浆细胞分泌特异性抗体。
本实验通过分离小鼠脾脏中的B淋巴细胞，体外培养并观察其形态变化，以及检测其产生抗体的能力，来研究抗体生成细胞的特性。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠2. 试剂：抗原、抗体、Ficoll分层液、RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、二甲基亚砜（DMSO）、细胞计数板、显微镜等。
四、实验步骤1. 小鼠脾脏细胞分离- 处死小鼠，取出脾脏。
- 将脾脏放入无菌培养皿中，用无菌剪刀剪碎。
- 加入Ficoll分层液，室温静置30分钟。
- 吸取中层细胞，用RPMI-1640培养基洗涤2次。
- 计数细胞，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。
2. 细胞培养- 将细胞悬液加入含10%胎牛血清、青霉素、链霉素的RPMI-1640培养基中。
- 将细胞悬液分装至培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
- 每2天更换一次培养基。
3. 形态观察- 在显微镜下观察细胞形态变化，记录细胞生长情况。
4. 抗体生成细胞活性检测- 收集细胞培养液，离心去上清。
- 将细胞沉淀用RPMI-1640培养基重悬，加入抗原，37℃孵育1小时。
- 加入抗体，37℃孵育30分钟。
- 加入底物，观察颜色变化。
- 记录抗体生成细胞活性。
五、实验结果1. 细胞形态观察- 在培养过程中，细胞逐渐从单层排列变为多层排列，细胞体积增大，形态趋于扁平。
2. 抗体生成细胞活性检测- 加入抗原和抗体后，部分细胞出现颜色变化，说明这些细胞能够产生抗体。
六、实验讨论1. 本实验成功分离和培养了小鼠脾脏中的B淋巴细胞，并观察到了细胞形态的变化。
2. 抗体生成细胞活性检测结果表明，部分细胞能够产生抗体，证实了实验的成功。
人类免疫系统中的T细胞与B细胞
人类免疫系统中的T细胞与B细胞T细胞与B细胞是人类免疫系统中起着至关重要作用的两种免疫细胞。
它们的功能机制不同，但它们都是免疫细胞中的重要组成部分，对于保护人类免受疾病的侵袭起着至关重要的角色。
一、T细胞T细胞是体内第一道反应免疫系统的重要细胞，也是其中相当比例的免疫细胞。
T细胞由骨髓干细胞分化而来，然后经过thymus的成熟，在体内进一步繁殖分化为不同的T细胞亚群，包括Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Treg细胞等。
T细胞是免疫细胞中的"官兵"，在免疫过程中起着举足轻重的作用。
T细胞主要靶向病原体和癌细胞，对这些有免疫识别作用，从而帮助宿主减轻或消灭病原体或癌细胞的侵袭。
不同的T细胞亚群在体内的作用机制、调控方式、效应作用都不同。
例如，Th1细胞主要靶向细胞内病原体，主要通过分泌干扰素-γ等细胞因子来刺激巨噬细胞、NK细胞等进行攻击清除；而Th2细胞主要靶向细胞外病原体，主要通过分泌IL-4，IL-5等细胞因子来诱导过敏反应和抗体产生。
此外，T细胞的另一个重要作用就是通过调节机体的免疫应答，维持免疫平衡。
Treg细胞就是指一类调节性T细胞，这类T细胞能够通过**分泌IL-10，TGF-β等细胞因子，加以控制和抑制其他免疫细胞的激活和功能，以保护机体防止过度免疫反应。
二、B细胞B细胞是免疫系统中的另一个重要的免疫细胞。
B细胞是由骨髓干细胞发育而来，也是由于骨髓中的前体细胞进入循环系统，进入淋巴结进一步分化和繁殖而成。
B细胞在体内的主要作用就是识别并清除入侵机体的外来微生物及其产生的毒素等，在机体产生免疫应答过程中起着重要的角色。
一旦机体侦测到外来病原体，B细胞被刺激产生抗体，然后与病原体结合形成复合物，进而被巨噬细胞、NK细胞、补体系统等清除。
B细胞主要靶向体外病原体产生抗体，以形成机体的体液免疫。
通过能够与抗原特异性结合的B细胞受体（BCR）来识别敌人，这些抗原可以是细胞表面分子、病毒等微生物抗原、过敏原或其它大分子还包括有些药物。
亚急性硒中毒对小鼠巨噬细胞与抗体形成细胞的影响
Ｌ］ 河 北 医 药 ，０ ９ ３ （２ ：４ ０１ ４ ． Ｊ． ２ ０ ，１ １） １４ —４ ２
［］ 李丹 ， ８ 尚红 ， 拥 军 ， 姜 等 香 菇 多 糖 体 外 抗 ＨＩ 的 免 疫 调 Ｖ
染 细 胞 表 达 功 能 影 响 的实 验 研 究 ［ ］ 中 华 实 验 和 临 床 病 毒 学 Ｊ．
杂 志 ，０ ５ Ｉ （ ） ２ ０２ ２ ２ ０ ，９ ３ ：９ —９ ．
Ｇｒ ｏａｆｏ ｄ ｓ Ｊ．Ａｎｉｉ ｌ ｓａｃ ，０ ７ ７ ：５ —５ ． ｉ ｌ ｒｎ ｏ ａＥ］ ｆ ｔ ｒ ｅ ｒｈ ２０ ， ５ ２ ０２ ７ ｖ ａ Ｒｅ
亚 硒 酸 钠 染 毒 使 小 鼠 巨 噬 细 胞 的 吞 噬 功 能 与 抗 体 形 成 细 胞 的 数 量 显 著 降 低 ， 与 染 毒 剂 量 具 有 相 关 性 。表 明 亚 硒 酸 钠 染 毒 且
可抑制小 鼠非特异性免疫 功能 ， 现明显剂量效应关 系。 呈
关 键 词 ： 硒 酸 钠 ； 噬 细 胞 ； 血 空 斑 ； 特 异 性 免 疫 亚 巨 溶 非 中 图分 类 号 ： ８ ９ ８ ￥ ５ ． 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ５ ９ ６ ０ （ ０ ２ ０ — ０ ３０ ０ ２ — ０ ５ ２ １ ） ９０ １ － ３
ｄ ｎ ｉ ｃ ｔｏ ｎ ｕ ｃ ｉ ｎ ｏ ｏ ｅ ｎ ｉＨ Ｓ １ ｒ ｔ ｉ ｒ ｍ ｅ ｔｆ ａ ｉ ｎ ａ ｄ ｆ ｎ ｔ ｆａ ｎ ｖ ｌａ ｔ— ｉ ｏ Ｖ－ ｐ ｏ ｅｎ ｆｏ
［ ］ 段 会 平 ， 安 继 ， 付 耳 ， ．羧 甲基 茯 苓 多 糖 对 ＨＢ 转 ７ 侯 陆 等 Ｖ
使用手册
国家一类新兽药--羊胎盘转移因子注射液使用手册内容1，产品介绍（P2）2，药理作用（P2）3，作用机理（P4）4，作用与用途（P4）5，工艺研究与质量控制（P6）6，安全性评价（P8）7，临床疗效应用研究（P8）8，临床应用方案（P9）9，名词解释与答疑（P9）一，产品介绍1，定义：转移因子也称小分子肽或低分子肽，现代的研究认为转移因子是低分子肽- 核苷酸复合物，因为能够被动转移免疫能力而得名。
转移因子非免疫细胞所特有，机体的其它组织与细胞也可生成转移因子。
羊胎盘转移因子注射液系用怀孕100日以上的健康绵（山）羊胎盘经低温高压超声波蛋白裂解法制备而成，本品具有广泛的免疫学活性和抗菌、抗病毒、抗炎、抗应急、解毒、促愈合和营养等功能，可显著增强机体的特异性、非特异性免疫力，从而提高防病抗病的能力。
临床用于动物免疫调节、疫病防治、免疫增效和临床辅助治疗，并显著提高动物生产性能。
2，产品特性：羊胎盘转移因子注射液是一种新型免疫激发剂。
制剂不含蛋白质，可溶、可透析、可超滤的小分子物质，分子量≤6000dt。
转移因子不被胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和DNA （脱氧核糖核酸）酶分解，不耐热。
体内外均有转移免疫致敏的作用。
本品无公害、无污染、无残留，该产品的应用不仅能保证兽医防治的质量，而且，可减少各种化学药物的使用，提高畜产品质量，保障食品安全。
①本品是一种白色或灰白色的半透明组织乳液，静脉或肌肉注射无过敏性。
②非特异性和无种间特异性：转移因子的免疫调节和免疫信息传递作用具有非特异性，且不仅发生在同种动物之间，也可在不同种动物之间产生，动物的种间差异越大，作用效果越好。
③生产工艺先进、完善，产品质量稳定，活性高，不会被蛋白酶和各种消化酶所破坏，注射、口服均可，使用方便。
④用量小，见效快，使用后24 小时内即可发挥作用，作用效果可持续四周以上。
⑤使用安全：本品主要成分来自于动物本身，属天然生物因子，无毒副作用，无药物残留之担忧，可确保用药安全。
第十二章免疫检测原理及方法
第十二章 免疫检测原理(yuánlǐ)及 方法
免疫检测技术对于基础和临床兽医学发展以及在疾病诊断、 预防和治疗以及研究疾病起因、发生和发展的方面都有着极其 重要的意义。
免疫学技术的改进和发展，是建立在许多其他生物科学的 技术之上，如用生化和蛋白分离技术分离抗原和抗体、用分于 遗传学技术闸明免疫学上重要分子的基因序列。另一方面，免 疫学又形成了许多本学科的技术，尤其是依据于抗原-抗体反 应有高度(gāodù)特异性，作为检测手段胜过任何其他方法在这 方面的优势。
(hùnhé)，再使两者与定量的相应抗体(Ab)发生竞争性结合，也即 竞争抑制反应。
第八页，共十五页。
第二节 免疫细胞(xìbāo)的检测
参与免疫应答的细胞有多种，如负责体液免疫的B细胞， 执行细胞免疫的T细胞和沟通(gōutōng)体液免疫和细胞免疫的 其他细胞等。
T细胞、B细胞表面具有特异性抗原和多种受体，据此建立了 相应的检测方法，以鉴定和计数动物外周血液和淋巴样组织中的 T细胞、B细胞及其功能。
主要有两种方法：一是形态学检查法，即将加有PHA培 养淋巴细胞后涂片、染色、镜检以观察形态学变化，计算 淋巴细胞转化率；另一种(yī zhǒnɡ)是同位素标记物掺入法， 即当淋巴细胞受分裂原刺激发生转化时，将具有放射性的 3H-TdR(胸腺嘧啶核苷)加到培养液内，被DNA的原料摄入转 化中的细胞内，测定细胞内放射性物质的相对数量(以脉冲 数表示)，进而测定淋巴细胞的转化程度。
近年来，在上述基本反应基础上，采用荧光素、同位 素和酶标记技术，使抗原-抗体反应敏感度增加1,000倍以 上。这种免疫标记方法已广泛应用到医学、兽医学以及其 他生物学许多领域中。
第五页，共十五页。
二、抗原-抗体反应的基本(jīběn)类 型
抗体生成细胞检测.
试剂与器材
1. 小鼠；
2. 绵羊红细胞悬液（2.5%）；
3. 指示细胞悬液： 含10% 绵羊红细胞悬液
0.5ml，补体0.3ml，Hank’s液2.0ml；
4. 细胞裂解液0.17mol的NH4Cl； 5. Hank’s 液（pH7.2）、凡士林油；
6. 动物解剖器械、注射器（5ml）、平皿、试管、 吸管、载玻片、盖玻片、双面胶；
溶血空斑试验
制作反应板 加样：30ul 温箱10分钟
双面胶 盖玻片
Department of Immunology
Department of Immunology
定量溶血分光光度法（quantitative hemolysis spectrophotometry，QHS）
该法又称B细胞介导的红细胞定量溶血分光光 度法，是根据溶血空斑试验的原理衍化而来， 可用以测定由B细胞产生和分泌的抗体裂解红 细胞所释放的血红蛋白(以吸光值表示)，从而 反映机体的体液免疫功能。试验时，将免疫的 脾细胞与SRBC及新鲜豚鼠血清等体积混合，于 37℃水浴1小时，离心后测上清吸光值，其与 产生抗体的量成正比。
将SRBC免疫过的小鼠脾细胞制成细胞悬液， 与一定量的SRBC在琼脂凝胶内混合，在补 体参与下，使抗体产生细胞周围的SRBC溶 解，形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要 用于测定B细胞抗体产生能力。
Department of Immunology
Department of Immunology
实验原理
ELISPOT不仅可应用于B细胞分泌抗体功 能的测定，也能检测分泌细胞因子的T细 胞和巨噬细胞。
Department of Immunology
Department of Immunology
溶血空斑实验..
（四）加补体 • 从温箱中取出平皿，每皿加入1:5稀 释的新鲜豚鼠血清1ml，继续放37℃ 温箱中温育30min后取出，观察溶血 空斑。也可在室温下放置1h，4℃冰 箱过夜，次日观察结果。
结果判定
观察时，将平皿对着光亮处， 用肉眼或放大镜观察每个溶血空斑 的溶血状况，并记录整个平皿中的 空斑数，同时求出每百万个脾细胞 内含空斑形成细胞的平均数。
●一个空斑代表一个抗体形成细胞（即B
细胞 ），空斑的数量反映机体的体液 免疫功能。 ●空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的 多少。由于溶血空斑试验具有特异性高， 筛选力强，可直接观察等优点，故可用 做判定免疫功能的指标，观察免疫应答 的动力学变化，并可进行抗体种类及亚 类的研究。
实验材料与试剂
• 器材：平皿、37℃水浴箱、离心机、显微 镜 • 试剂： ①SRBC悬液：取无菌脱纤维羊血，用NS或PBS 离心洗涤3次，每次以2000rpm，5min，用 PH7.2的PBS（含Ca2+、Mg2+）悬成细胞浓度 为2.00×109个/mL
②Hanks液（含Ca2+、Mg2+ ） ③底层基（1.4%）和表层基（0.7% ）： 将琼脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7%两种 浓度。将表层基分装于小试管中，每管 2ml ④补体：新鲜豚鼠血清 ⑤小牛血清：56℃灭活 30min
实验步骤
㈠免疫脾细胞悬液的制备 ①小鼠免疫：每只小鼠经尾静脉注入上述SRBC悬 液2.00×104个/0.2ml或者腹腔注射4.00×108 个 /1ml。 ②单个脾细胞悬液的制备：将免疫后第四天的小 鼠拉颈处死，解剖取出脾脏，放入PH7.2的PBS 中漂洗，去掉结缔组织，加入适量的PBS，用镊 子挤压脾脏，稍静置，吸上清液至离心管中， 2500r/min离心5min，弃上清后，定量加入PBS 液1ml，混匀，再用PBS液稀释10倍（浓度约为 5×106个/ml）
医学免疫学实验课讲义
实验一、免疫器官 (Organs of the Immune System)免疫器官包括中枢免疫器官和外周免疫器官。
在哺乳类动物，中枢免疫器官包括胸腺和骨髓；在禽类，中枢免疫器官包括胸腺和法氏囊。
外周免疫器官有淋巴结、脾脏等。
（本实验属于示教内容）1、胸腺（Thymus）胸腺位于胸腔纵隔上部，胸骨后方。
人类胸腺在胚胎期及出生后2岁内生长很快，体积较大；2岁后到青春期发育仍很快；但青春期后开始萎缩，逐渐由脂肪组织所代替，它在机体免疫功能的建立上占有重要地位。
骨髓内有部分淋巴细胞迁移到胸腺内，在胸腺素的影响下，增殖分化成为具有免疫功能的T细胞，再经血流输送到淋巴结和脾等周围免疫器官发挥免疫功能。
若新生期切除胸腺或胸腺生长肿瘤，可导致细胞免疫功能显著下降，常因感染而死亡。
胸腺的组织结构：胸腺分左右两叶，表面覆盖有一层结缔组织被膜，被膜深入实质将实质分割成若干小叶。
胸腺小叶的外层为皮质，内层为髓质。
胸腺皮质区分为浅皮质区和深皮质区。
皮质区内85%-90%的细胞为未成熟的T细胞。
髓质区内有大量的胸腺上皮细胞和稀疏分散的较成熟的胸腺细胞、单核-巨噬细胞和树突状细胞。
标本：胎儿胸腺、胸腺组织切片图1.不同年龄期的胸腺示意图2、骨髓(Bone marrow)骨髓位于骨髓腔中，分为红骨髓和黄骨髓。
红骨髓有造血功能，由造血组织和血窦构成。
造血组织主要由基质细胞和造血细胞组成。
基质细胞包括网状细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞等。
骨髓是各类血细胞和免疫细胞发生的场所。
骨髓又是B细胞分化成熟的场所和体液免疫应答发生的场所。
因此骨髓既是中枢免疫器官又是外周免疫器官。
标本：骨髓组织切片法氏囊（Bursa of Fabricius）在禽类，法氏囊是位于泄殖腔上方的一个囊状物，内充满着淋巴组织，其中淋巴细胞不断受囊素的影响，发育成B淋巴细胞。
若新生期切除法氏囊，抗体的形成将受影响，而细胞免疫功能不受影响。
对于B淋巴细胞发育而言，禽类的法氏囊具有哺乳类动物骨髓相似的作用。
体外抗体形成细胞检查法(溶血空斑实验 PFC)(Plaque forming ce
体外抗体形成细胞检查法（溶血空斑实验 PFC）(Plaque forming cePFC测定技术又称溶血空斑试验。
是一种体外检测单个抗体形成细胞（浆细胞）的方法。
自从1963年 Jerne和Nordin首先建立PFC测定技术以来,使免疫学方法得到很大的发展。
特别是间接溶血空斑测定法的建立，更扩大了本实验的应用范围。
它不仅可以测定产生 IgM 类的抗体产生细胞，而且还可以检测产生其他各类免疫蛋白及其亚类的抗体形成细胞。
它不仅可以作为免疫基本理论研究的有力工具，而且还可以作为临床筛检抗肿瘤新药以及研究中药对机体免疫功能的影响（免疫增强剂和免疫抑制剂）的特异指标。
溶血空斑试验分直接溶血空斑试验和间接溶血空斑试验。
前者是为测定产生 IgM 型抗体的细胞。
因为活化补体的能力强，可以不必另加抗Ig 试剂（显斑剂），也就是只加细胞和补体即可出现空斑，故称直接溶血空斑测定。
至于产生其他类型抗体的（如 IgG 或 IgA 等）细胞检测，就需要在试验系统中另加显斑剂（因为这些类别的抗体活化补体的能力弱）也就是加靶细胞和抗各类 Ig 高纯度的抗血清（系指用高浓度的抗原制备的抗血清）再加补体才能出现可见的空斑，故称间接溶血空斑测定。
小鼠脾PFC测定方法，经多次改进使本法的敏感度不断提高。
目前所用的方法分为：琼脂固相法和小室液相法。
其基本原理是将经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞（靶细胞）混合，在补体参与下，使抗体形成细胞周围结合了抗体分子的羊红细胞溶解形成肉眼可见的溶血空斑。
一琼脂固相法[实验材料]（1）玻璃器皿（7X1.5 厘米）（2）1毫升注射器和青霉素小瓶（3）水浴(47-49℃ )（4）Hanks'液（5）胎牛血清(56℃30分钟灭活,并经羊红细胞吸收)（6）琼脂或琼脂糖(表层基0.7%;底层基1.4%;用Hanks'液配制 ) （7）右旋糖酐(DEAE-dxtran分子量50万,用蒸馏水配置10毫克/毫升). （8）抗-Ig血清(测定间接空斑用)（9）20%绵羊红细胞悬液(Hanks'液配制)（10）补体:新鲜豚鼠血清(用前经绵羊红细胞吸收)[试验方法]（1）将溶化的底层琼脂倾注平皿形成一薄层, 将其凝固,备用。
体外抗体形成细胞的检测
• Complement制备 豚鼠血清 (5) + SRBC (1) 4℃吸收 30 min
3000rpm离心15min，上清 1:10 稀释备用
• 脾细胞制备
2×107/ml 脾细胞 (见步骤)
Procedure
• 脾细胞的制备
SRBC免疫小鼠 4天后拉颈处死，取脾 200目铜网上研磨脾脏，收集脾细胞悬液 2000rpm离心5min，弃上清
Principle
SRBC免疫小鼠 获取小鼠脾细胞
SRBC (Ag) + spleen cell (Ab) +Complement
MAC 裂解SRBC
释放出血红蛋白 分光光度计定量测定
SRBC B
anti-SRBC Ab
SRBC
COMPLEMENT
Procedure
• SRBC制备
以NS洗涤防凝SRBC两次
细胞数/ml = 4个大格的细胞总数/4 x104 （WBC计数法）
对照管
脾细胞1 ml1 来自l Hank’s 液SRBC
1 ml
1 ml
Complement
1 ml
1 ml
• 混匀，37℃ 孵育 1 h
• 3000rpm 离心 5 min，取上清
• 721分光光度计测413nm处OD值（Hb量）
W
W
1mm
W
W
W
W
1mm
W
W
1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=0.1×10-3ml =10-4ml 细胞浓度: 细胞数/ml =5个中格的细胞数 x 5x 104（RBC计数法）
加4.5 ml DDW，振荡45秒,加入0.5ml 9%NaCL, 2000rpm 离心 5min,弃上清
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1. 取出脾脏，用1支5mL和1支2mL注射器在含有2mL PBS的小平皿中刮出脾细胞。
2. 用2mL注射器抽吸刮出的脾细胞3-5次，使脾细 胞尽量分散。
3. 用约8mLPBS洗涤脾细胞3次；每次1000转，10分 钟。
4. 最后将沉淀细胞悬浮于1mL1640液中。 5. 细胞计数，配成2-3×107/mL，备用。
是机体免疫状态的指标。特异性高，简单，好 观察。
实验材料
载玻片、双面胶制备的小室。 绵羊红细胞 补体（豚鼠血清） 细胞营养液（1640） 微量加样器 PH=7.2的PBS 小平皿
实验方法——免疫小鼠
5%的SRBC0.1mL注射小鼠腹腔，4天后处死。
实验方法——制备脾细胞悬液：
体外抗体形成细胞检查
医学免疫学教研室
实验目的
掌握小鼠脾细胞的制备方法。 了解体外抗体形成细胞的检查。
实验原理
将一定量洗涤过的绵羊红细胞静脉或腹腔注射 小鼠，注射后4天将小鼠杀死，制成脾细胞悬 液，内含抗体形成细胞（PFC）.
将脾细胞、绵羊红细胞及补体混合孵育，由于 PFC分泌的抗体与绵羊红细胞（抗原）结合形 成IC，激活补体，可形成肉眼可见的空斑。
实验方法——补体制备
豚鼠心脏取血，分离血清。稀释成1：8，备 用。实验方法——S NhomakorabeaBC制备
取羊颈静脉血，生理盐水洗涤3次，制备成25% 的羊血备用。
试验方法——制备PFC
取脾细胞50μL，SRBC 50μL，补体50μL混合， 用1640补充到500μL，混合均匀。
微量加样器将混合液注入事先制备好的小室中。 每室约100μL，37°C的温箱中1-2小时，观察 结果。可借助显微镜观察。