体外抗体形成细胞
溶血空斑试验
溶血空斑试验溶血空斑试验一、原理溶血空斑试验是体外检测单个抗体形成细胞(B淋巴细胞)的一种方法，即将经绵羊红细胞(SRBC)免疫过的家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的SRBC结合，于37℃作用图3131琼脂平板溶血空斑溶血空斑试验溶血空斑试验试验原理示意图下，免疫活性淋巴细胞能释放出溶血素，在补体的参与下，使抗体形成细胞周围的SRBC溶解，从而在每一个抗体形成细胞周围，形成肉眼可见的溶血空斑。
每个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。
由于溶血空斑试验具有特异性高，筛检力强，并可直接观察等优点，故可用作判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。
溶血空斑试验溶血空斑试验目前有关溶血空斑试验的具体方法很多，现仅将琼脂平板溶血空斑试验的操作方法简介如图3131。
溶血空斑试验溶血空斑试验二、材料和方法(一) 材料平皿(直径55×15cm)，温箱(37℃)，水浴箱(45℃)，离心机，显微镜及白细胞计数器，18～25g昆明系小鼠等。
溶血空斑试验溶血空斑试验(二) 试剂1．SRBC悬液取无菌脱纤绵羊血(或阿氏液保存的血液)，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗3次，每次 2 000r/min离心5min，最后取压积红细胞，悬于灭菌pH值7 2 P BS(含Ca2+、Mg2+)中，使成为20%浓度，经细胞计数后，调整细胞浓度为2×10 9/ml。
溶血空斑试验溶血空斑试验2．01mol/L pH值7 2 PBS(含Ca2+、Mg2+)。
3．底层和顶层琼脂取抗补体作用小的琼脂(日本琼脂粉或旅大水产制品厂的产品)用PBS配成14%和07%两种浓度。
将07%的琼脂分装小试管，每管15ml备用。
4．DEAE右旋糖酐分子量5万，用蒸馏水配成1%浓度备用。
5．补体采集3只以上豚鼠血清，应用时用PBS稀释成1:30浓度(如不加DEAE右旋糖酐，可采用原补体或作1:5稀释)。
单克隆抗体技术的基本原理
单克隆抗体技术的基本原理
单克隆抗体技术是一种通过体外合成获得具有单一抗体特异性的抗体的方法。
它的基本原理是将目标抗原注射到动物体内，使其免疫系统产生多种抗体。
然后，从动物的脾脏或骨髓中提取免疫细胞，并与癌细胞融合形成杂交瘤。
杂交瘤是一种具有细胞融合能力的免疫细胞，在体外环境中能够不断增殖，并持续产生抗体。
这些杂交瘤细胞称为“克隆”，每个克隆对应一种特定的抗体。
在获得这些抗体的克隆细胞后，科学家使用细胞培养和筛选技术，筛选出能够高效产生目标抗体的克隆细胞。
通过单克隆抗体技术，可以得到高纯度、高特异性的抗体。
这些抗体可以用于检测特定抗原的表达、分析细胞信号传导、研究蛋白质功能等领域。
与传统的多克隆抗体相比，单克隆抗体具有更好的重现性和稳定性，因此在医学诊断和生物学研究中有广泛应用。
抗体产生的过程
抗体产生的过程抗体是机体免疫系统中一类重要的蛋白质分子，它们能够识别并结合外来的抗原，从而帮助机体抵御病原体的入侵。
抗体的产生是一个复杂而精确的过程，涉及到多种免疫细胞的相互作用与调控。
本文将从免疫细胞的活化、抗原的识别、抗体的合成等方面，详细介绍抗体产生的过程。
免疫细胞的活化是抗体产生的第一步。
当机体遭遇外来抗原时，免疫系统中的抗原递呈细胞（如树突状细胞）会摄取并陈列抗原碎片，将其展示在细胞表面的MHC分子上。
这些抗原递呈细胞会迁移至淋巴器官，与免疫系统中的淋巴细胞相互作用。
若抗原递呈细胞激活了T细胞，就会启动免疫反应的第一道防线。
激活的T细胞会分化为不同的亚群，其中一部分T细胞成为辅助T细胞（Th细胞），它们与B细胞发生相互作用，促进抗体的产生。
抗原的识别是抗体产生的关键步骤之一。
在免疫细胞的活化过程中，B细胞也会与抗原发生结合。
B细胞表面的抗原受体（BCR）通过与抗原结合，使B细胞得以识别与特定抗原相对应的免疫刺激。
一旦B细胞与抗原发生结合，就会激活B细胞并启动抗体产生的过程。
抗体的合成是抗体产生的核心环节。
激活的B细胞会分化为浆细胞，这些浆细胞具有合成和分泌抗体的能力。
在浆细胞的内质网中，抗体的基因已经被转录和翻译，形成了完整的抗体分子。
这些抗体分子会被包裹在细胞质内的囊泡中，然后通过分泌途径释放到细胞外。
一旦抗体进入体液中，它们就会与抗原结合，并参与到机体的免疫反应中。
抗体通过结合抗原，可以中和病原体、促进病原体被巨噬细胞吞噬、激活补体系统等，从而协助机体清除病原体。
除了浆细胞外，激活的B细胞还可以分化为记忆B细胞。
记忆B细胞具有长时间存活的能力，并且能够迅速应对再次遭遇相同抗原的情况。
当机体再次遭遇相同抗原时，记忆B细胞会迅速分化为浆细胞，合成大量抗体，从而迅速启动抗原特异性免疫反应。
这就是机体具有免疫记忆的原因，也是疫苗接种等免疫策略的基础。
总结起来，抗体产生的过程可以分为免疫细胞的活化、抗原的识别和抗体的合成三个关键步骤。
体外抗体形成细胞检测—定量溶血分光光度计法(QHS)
脾脏B细胞 ＋SRBC＋ 补体
成抗原抗体复合物，激活补 体系统，裂解SRBC而释放
补体经典激活途径
出血红蛋白，以分光光度计 定量测定。所测值反映了抗
SRBC裂解
体形成细胞产生抗体的功能。
分光光度计检测
2
实验步骤
❖ SRBC及其制备 脱纤维防凝处理的SRBC，以NS洗涤二次，
每次2000rpm 离心5min。弃上清，制成 SRBC悬液，然后用血细胞计数板计数细胞， 最后稀释成1.5×108 sRBC/ml。
时间也要严格控制。
7
细胞计数法
WBC
1mm WBC 1mm
WBC
WBC
细胞浓度/ml
= 4个大方格中的细胞总数/4 × 104
RBC
细胞浓度/ml
= 5个中方格中的细胞总数 ×5 ×1804
W
W
1mm
W
W
1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=0.1×10-3ml =10-4ml
细胞浓度: 细胞数/ml =5个中格的细胞数 ×5×104（RBC计数法）
细胞数/ml = 4个大格的细胞总数/4 ×104 （WBC计数法） 9
抗体制备
原理： 抗原免疫小鼠，激活免疫系统，B细
胞活化并分化为浆细胞，产生针对特定 抗原的特异性抗体。
10
方法
❖ 1.用移液管吸取脱纤维防凝处理的绵羊血适量
❖ 2.加2-3倍体积生理盐水，混匀，2000rpm离 心5分钟，小心吸尽上清。
实验管 1ml
1ml
1ml
—
3ml
3. 混匀，37℃水浴1小时。 4. 3000rpm 离心 5 min，取上清 5.721分光光度计测413nm处OD值（Hb 量）
抗体产生的原理
抗体产生的原理
抗体产生的原理是通过机体的免疫系统来应对外来入侵的病原体。
当病原体进入机体后，机体的免疫系统会识别它们并进行相应的应激反应。
其中，B细胞是主要的抗体产生细胞。
抗体产生的过程可以分成两个阶段：抗原刺激和抗体合成。
首先，当病原体进入机体后，它们的特异抗原会被识别并结合到B细胞上，即抗原刺激。
这个过程受到细胞介导免疫应答
和体液介导免疫应答两种机制的调控。
在接收到抗原刺激后，B细胞会进一步分化为两种形式：浆细
胞和记忆B细胞。
浆细胞是一种专门合成和分泌抗体的细胞，而记忆B细胞则会长期保存在体内，以便在再次遇到相同病
原体时迅速产生抗体。
接下来是抗体合成的过程。
在细胞内，B细胞会通过基因重组
产生特异性的抗体基因，进而合成相应的抗体蛋白。
这些抗体蛋白通过分泌出B细胞表面的免疫球蛋白M（IgM）进入体液循环，并与抗原结合形成抗原-抗体复合物，从而中和或清除
病原体。
值得一提的是，抗体的产生不仅能够应对外来病原体，在疫苗接种后也能够提供免疫保护。
疫苗中的抗原刺激可激活B细
胞并诱导抗体产生，从而让机体在未来遇到相同病原体时能够更快产生抗体，有效预防疾病。
总而言之，抗体产生的原理是通过机体免疫系统的反应，识别并结合到病原体抗原，进而分化为合成抗体的浆细胞和保存在体内的记忆B细胞，最终产生特异性的抗体来应对外来入侵的病原体。
医学免疫学实验：溶血空斑形成实验
溶血空斑形成实验一、实验目的学习溶血空斑形成实验的实验原理与步骤，掌握用溶血空斑形成实验检查动物的抗体产生功能。
二、实验原理溶血空斑试验，又称空斑形成细胞（Plague Forming Cel , PFC ）试验，是一种体外检测抗体形成细胞的方法。
将一定量洗涤过的绵羊红细胞注射入小鼠腹腔，四天后将小鼠杀死，取脾脏制成脾细胞悬液，内含抗体形成细胞。
然后将脾细胞、绵羊红细胞，补体混合孵育。
由于脾细胞所分泌的抗体和绵羊红细胞表面抗原结合形成抗原抗体复合物，在补体作用下可使红细胞溶解，于特制的小室内形成肉眼可见的溶血空斑。
一个空斑即代表一个抗体形成细胞。
三、实验材料1.解剖器械、试管、1ml 吸量管2.载玻片、石蜡盘、酒精灯、微量加样器3. BALBC 小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供）4.5％和10％绵羊红血球（SRBC )5.补体（豚鼠血清，经SRBC 吸收，临用时稀释成合适浓度）四、实验步骤1.腹腔注射0.5mlSRBC,4天后拉颈椎处死，取出脾放在已加入6ml Hank液的平皿中，用100目不锈钢网研磨过滤混匀。
2.吸取1ml加入试管中，加满Hank液混匀，离心1000rpm，10min。
3.吸取1ml Hank液加入试管中，重悬脾细胞沉淀，细胞密度约1 ×107/ml。
4.取1 ×107/ml 脾细胞100μl；10%SRBC 200 μl；补体200 μl；Hank液1ml。
5.混匀后，用尖吸管灌小室、封蜡、标记、平放于玻片盘，37 ℃孵育30min。
五、实验结果肉眼观察空斑，计数小室出现的溶血空斑数，对于模糊不清的空斑，可以在低倍镜下观察。
注意区分气泡和溶血空斑，真正的溶血空斑中心必有一个淋巴细胞。
加试管1混合液的小室有多个透明的溶血空斑形成，加试管2混合液的小室（对照）没有。
一个空斑即代表一个空斑形成细胞（抗体形成细胞）。
六、讨论1.在小室注入液体时不要留有气泡。
溶血空斑试验PFC试验PPT课件
4、制备灌注液：
实验组：脾细胞悬液100μl＋15％SRBC 100 μl＋补体 100 μl＋Hank’s液500 μl
对照组：脾细胞悬液100μl＋15％SRBC 100 μl＋Hank’s 液600 μl
5、灌注小室: 2管分别灌注2个小室，石蜡密封小室的两侧 6、 孵育： 37℃培养箱中40min
（三）材料与器材
1、小鼠，5％和15％SRBC，补体，Hank’s液 2、解剖器械，试管，载玻片，石蜡，100目不锈钢
网，双面胶带 3、37℃培养箱
（四）实验方法
1、免疫小鼠：4天前5％SRBC腹腔注射免疫小鼠
2、制备脾细胞悬液：颈椎脱臼处死小鼠，取脾在不锈钢 网上研磨（7 ml Hank’s液），1000 rpm离心6 min，去上 清，加1 ml Hank’s液悬浮脾细胞
溶血空斑试验
PFC实验
（一）实验目的
掌握PFC实验原理、实验操作和结果观察；
（二）实验原理
溶 血 空 斑 试 验 或 空 斑 形 成 细 胞 试 验 （ Plague forming cell, PFC)，体外检测抗体形成细胞。 1、SRBC＋B细胞＝记忆性B细胞（抗体形成细胞） 2、SRBC＋抗体形成细胞＝（抗原＋抗体复合物） 注意事项
（1）小室注入液体时不要留有气泡； （2）小室边缘需用石蜡封严； （3）37℃孵箱孵育时，必须放平，不可倾斜；
（六）实验结果
观察溶血空斑现象 区分： 溶血空斑：比周围颜色浅，折光性差，边缘不整齐。 气泡：比周围亮，折光性好，边缘整齐。
讨论
• 分析溶血空斑形成的原因
免疫系统的抗体产生
免疫系统的抗体产生免疫系统是人体的自我保护系统，在遭受外界病原体侵害时起到至关重要的作用。
其中，抗体是免疫系统中的重要组成部分，可以有效地抵御病原体的侵袭。
本文将详细介绍免疫系统中抗体的产生过程，包括抗原刺激、B细胞的活化和分化、抗体的合成和分泌等。
1. 抗原的识别与激活免疫系统的抗体产生始于抗原的识别与激活过程。
当外部病原体侵入人体后，其表面的特定分子被免疫系统识别为抗原。
这些抗原能够与人体免疫系统中的特定抗原受体结合，进而激活免疫系统的应激反应。
2. B细胞的活化和分化一旦抗原与抗原受体结合，B细胞被激活并开始分化。
激活的B细胞将经历克隆扩增，产生大量功能相似的B细胞克隆群体。
这些克隆细胞中，部分将发展成为抗体分泌细胞，而另一部分则将作为记忆细胞储备在体内，以备后续感染的再次出现。
3. 抗体的合成和分泌活化分化的B细胞进一步发育成为抗体分泌细胞，也就是我们常说的浆细胞。
这些浆细胞能够合成和分泌大量的抗体，以对抗感染源。
抗体主要由两个基本结构单元组成：重链和轻链。
它们通过特定的氨基酸序列连结在一起，形成完整的抗体分子。
合成的抗体分子随后被积累在免疫系统的不同组织中，包括淋巴结、脾脏和黏膜等。
4. 抗体的功能与作用机制抗体在免疫系统中起到多种功能与作用机制。
首先，抗体可以直接与病原体结合，防止其进一步侵入人体细胞，从而起到阻断感染的作用。
其次，抗体能够激活免疫系统中的其他细胞，如巨噬细胞和NK细胞，促进它们对病原体的清除。
此外，抗体还能够参与药物的清除和控制炎症反应等。
总结起来，免疫系统的抗体产生是一个复杂而精确的过程。
从抗原的识别与激活开始，到B细胞的活化分化，再到抗体的合成和分泌，每个环节都与特定的分子相互作用，以确保抗体的产生和功能的发挥。
通过这些过程，免疫系统能够有效地应对外部病原体的威胁，维护人体的免疫健康。
抗体生成细胞实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解抗体生成细胞的分离和培养方法。
2. 学习观察和记录抗体生成细胞的形态变化。
3. 掌握抗体生成细胞活性检测的基本技术。
二、实验原理抗体生成细胞是指能够产生抗体的细胞，通常为B淋巴细胞。
在抗原刺激下，B淋巴细胞分化为浆细胞，浆细胞分泌特异性抗体。
本实验通过分离小鼠脾脏中的B淋巴细胞，体外培养并观察其形态变化，以及检测其产生抗体的能力，来研究抗体生成细胞的特性。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠2. 试剂：抗原、抗体、Ficoll分层液、RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、二甲基亚砜（DMSO）、细胞计数板、显微镜等。
四、实验步骤1. 小鼠脾脏细胞分离- 处死小鼠，取出脾脏。
- 将脾脏放入无菌培养皿中，用无菌剪刀剪碎。
- 加入Ficoll分层液，室温静置30分钟。
- 吸取中层细胞，用RPMI-1640培养基洗涤2次。
- 计数细胞，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。
2. 细胞培养- 将细胞悬液加入含10%胎牛血清、青霉素、链霉素的RPMI-1640培养基中。
- 将细胞悬液分装至培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
- 每2天更换一次培养基。
3. 形态观察- 在显微镜下观察细胞形态变化，记录细胞生长情况。
4. 抗体生成细胞活性检测- 收集细胞培养液，离心去上清。
- 将细胞沉淀用RPMI-1640培养基重悬，加入抗原，37℃孵育1小时。
- 加入抗体，37℃孵育30分钟。
- 加入底物，观察颜色变化。
- 记录抗体生成细胞活性。
五、实验结果1. 细胞形态观察- 在培养过程中，细胞逐渐从单层排列变为多层排列，细胞体积增大，形态趋于扁平。
2. 抗体生成细胞活性检测- 加入抗原和抗体后，部分细胞出现颜色变化，说明这些细胞能够产生抗体。
六、实验讨论1. 本实验成功分离和培养了小鼠脾脏中的B淋巴细胞，并观察到了细胞形态的变化。
2. 抗体生成细胞活性检测结果表明，部分细胞能够产生抗体，证实了实验的成功。
溶血空斑试验
溶血空斑试验溶血空斑试验一、原理溶血空斑试验是体外检测单个抗体形成细胞(B淋巴细胞)的一种方法，即将经绵羊红细胞(SRBC)免疫过的家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的SRBC结合，于37℃作用图3131琼脂平板溶血空斑溶血空斑试验溶血空斑试验试验原理示意图下，免疫活性淋巴细胞能释放出溶血素，在补体的参与下，使抗体形成细胞周围的SRBC溶解，从而在每一个抗体形成细胞周围，形成肉眼可见的溶血空斑。
每个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。
由于溶血空斑试验具有特异性高，筛检力强，并可直接观察等优点，故可用作判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。
溶血空斑试验溶血空斑试验目前有关溶血空斑试验的具体方法很多，现仅将琼脂平板溶血空斑试验的操作方法简介如图3131。
溶血空斑试验溶血空斑试验二、材料和方法(一) 材料平皿(直径55×15cm)，温箱(37℃)，水浴箱(45℃)，离心机，显微镜及白细胞计数器，18～25g昆明系小鼠等。
溶血空斑试验溶血空斑试验(二) 试剂1．SRBC悬液取无菌脱纤绵羊血(或阿氏液保存的血液)，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗3次，每次 2 000r/min离心5min，最后取压积红细胞，悬于灭菌pH值7 2 P BS(含Ca2+、Mg2+)中，使成为20%浓度，经细胞计数后，调整细胞浓度为2×10 9/ml。
溶血空斑试验溶血空斑试验2．01mol/L pH值7 2 PBS(含Ca2+、Mg2+)。
3．底层和顶层琼脂取抗补体作用小的琼脂(日本琼脂粉或旅大水产制品厂的产品)用PBS配成14%和07%两种浓度。
将07%的琼脂分装小试管，每管15ml备用。
4．DEAE右旋糖酐分子量5万，用蒸馏水配成1%浓度备用。
5．补体采集3只以上豚鼠血清，应用时用PBS稀释成1:30浓度(如不加DEAE右旋糖酐，可采用原补体或作1:5稀释)。
第十二章免疫检测原理及方法
第十二章 免疫检测原理(yuánlǐ)及 方法
免疫检测技术对于基础和临床兽医学发展以及在疾病诊断、 预防和治疗以及研究疾病起因、发生和发展的方面都有着极其 重要的意义。
免疫学技术的改进和发展，是建立在许多其他生物科学的 技术之上，如用生化和蛋白分离技术分离抗原和抗体、用分于 遗传学技术闸明免疫学上重要分子的基因序列。另一方面，免 疫学又形成了许多本学科的技术，尤其是依据于抗原-抗体反 应有高度(gāodù)特异性，作为检测手段胜过任何其他方法在这 方面的优势。
(hùnhé)，再使两者与定量的相应抗体(Ab)发生竞争性结合，也即 竞争抑制反应。
第八页，共十五页。
第二节 免疫细胞(xìbāo)的检测
参与免疫应答的细胞有多种，如负责体液免疫的B细胞， 执行细胞免疫的T细胞和沟通(gōutōng)体液免疫和细胞免疫的 其他细胞等。
T细胞、B细胞表面具有特异性抗原和多种受体，据此建立了 相应的检测方法，以鉴定和计数动物外周血液和淋巴样组织中的 T细胞、B细胞及其功能。
主要有两种方法：一是形态学检查法，即将加有PHA培 养淋巴细胞后涂片、染色、镜检以观察形态学变化，计算 淋巴细胞转化率；另一种(yī zhǒnɡ)是同位素标记物掺入法， 即当淋巴细胞受分裂原刺激发生转化时，将具有放射性的 3H-TdR(胸腺嘧啶核苷)加到培养液内，被DNA的原料摄入转 化中的细胞内，测定细胞内放射性物质的相对数量(以脉冲 数表示)，进而测定淋巴细胞的转化程度。
近年来，在上述基本反应基础上，采用荧光素、同位 素和酶标记技术，使抗原-抗体反应敏感度增加1,000倍以 上。这种免疫标记方法已广泛应用到医学、兽医学以及其 他生物学许多领域中。
第五页，共十五页。
二、抗原-抗体反应的基本(jīběn)类 型
抗体产生的基本过程
抗体产生的基本过程抗体产生的基本过程是免疫系统对外来抗原（如细菌、病毒等）的识别并生成抗体以进行免疫应答。
这个过程主要涉及到B淋巴细胞的活化、分化和抗体的合成。
以下是抗体产生的详细解释：1. 抗原识别：当外来抗原侵入机体后，免疫系统中的特定细胞，称为抗原递呈细胞（APC），会摄取、分解并呈递抗原片段给T淋巴细胞。
2. T淋巴细胞活化：抗原片段被呈递给T淋巴细胞上的特异性T细胞受体（TCR），若TCR与抗原片段相匹配，T细胞就会被激活。
激活过程中，T细胞接收来自抗原递呈细胞的信号，并与辅助T细胞互相作用，进而产生活化的辅助T细胞。
3. 辅助T细胞刺激B细胞：活化的辅助T细胞产生并释放细胞因子（例如细胞因子IL-4和IL-21），这些细胞因子刺激B细胞。
4. B细胞活化：被刺激的B细胞接收来自辅助T细胞的信号，并在淋巴结内增殖和分化成为浆细胞或记忆B细胞。
浆细胞是产生抗体的主要细胞类型。
5. 抗体合成：浆细胞合成和分泌抗体（也称为免疫球蛋白），抗体可以特异性地结合抗原，从而中和或清除抗原。
抗体有多种类别（IgM、IgG、IgA、IgE和IgD），不同类别的抗体在抗原结合和免疫反应中扮演不同的角色。
6. 免疫应答：抗体与抗原结合形成免疫复合物，激活其他免疫细胞，如巨噬细胞和自然杀伤细胞，来清除抗原。
同时，记忆B细胞会保留对抗原的记忆，以便在再次暴露于相同抗原时，能够更快地产生更强的免疫应答。
7. 免疫记忆：除了产生浆细胞来合成抗体，部分B细胞还会分化成为记忆B细胞。
记忆B细胞具有长寿命并保留对特定抗原的记忆。
如果再次暴露于相同抗原，记忆B细胞能够迅速活化并快速增殖，从而产生更多的浆细胞和新的记忆B细胞，以加强免疫应答并提供更持久的保护。
8. 类切换：在免疫应答的过程中，B细胞可以通过基因重组和改变抗体的等价区域，从而在抗体的类别之间进行切换。
这被称为类切换（class switching），使得产生的抗体在功能上具有不同的特点，例如IgM主要参与初次感染，而IgG则在体内保持较长时间并提供持久的免疫保护。
溶血空斑实验..
（四）加补体 • 从温箱中取出平皿，每皿加入1:5稀 释的新鲜豚鼠血清1ml，继续放37℃ 温箱中温育30min后取出，观察溶血 空斑。也可在室温下放置1h，4℃冰 箱过夜，次日观察结果。
结果判定
观察时，将平皿对着光亮处， 用肉眼或放大镜观察每个溶血空斑 的溶血状况，并记录整个平皿中的 空斑数，同时求出每百万个脾细胞 内含空斑形成细胞的平均数。
●一个空斑代表一个抗体形成细胞（即B
细胞 ），空斑的数量反映机体的体液 免疫功能。 ●空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的 多少。由于溶血空斑试验具有特异性高， 筛选力强，可直接观察等优点，故可用 做判定免疫功能的指标，观察免疫应答 的动力学变化，并可进行抗体种类及亚 类的研究。
实验材料与试剂
• 器材：平皿、37℃水浴箱、离心机、显微 镜 • 试剂： ①SRBC悬液：取无菌脱纤维羊血，用NS或PBS 离心洗涤3次，每次以2000rpm，5min，用 PH7.2的PBS（含Ca2+、Mg2+）悬成细胞浓度 为2.00×109个/mL
②Hanks液（含Ca2+、Mg2+ ） ③底层基（1.4%）和表层基（0.7% ）： 将琼脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7%两种 浓度。将表层基分装于小试管中，每管 2ml ④补体：新鲜豚鼠血清 ⑤小牛血清：56℃灭活 30min
实验步骤
㈠免疫脾细胞悬液的制备 ①小鼠免疫：每只小鼠经尾静脉注入上述SRBC悬 液2.00×104个/0.2ml或者腹腔注射4.00×108 个 /1ml。 ②单个脾细胞悬液的制备：将免疫后第四天的小 鼠拉颈处死，解剖取出脾脏，放入PH7.2的PBS 中漂洗，去掉结缔组织，加入适量的PBS，用镊 子挤压脾脏，稍静置，吸上清液至离心管中， 2500r/min离心5min，弃上清后，定量加入PBS 液1ml，混匀，再用PBS液稀释10倍（浓度约为 5×106个/ml）
医学免疫学实验课讲义
实验一、免疫器官 (Organs of the Immune System)免疫器官包括中枢免疫器官和外周免疫器官。
在哺乳类动物，中枢免疫器官包括胸腺和骨髓；在禽类，中枢免疫器官包括胸腺和法氏囊。
外周免疫器官有淋巴结、脾脏等。
（本实验属于示教内容）1、胸腺（Thymus）胸腺位于胸腔纵隔上部，胸骨后方。
人类胸腺在胚胎期及出生后2岁内生长很快，体积较大；2岁后到青春期发育仍很快；但青春期后开始萎缩，逐渐由脂肪组织所代替，它在机体免疫功能的建立上占有重要地位。
骨髓内有部分淋巴细胞迁移到胸腺内，在胸腺素的影响下，增殖分化成为具有免疫功能的T细胞，再经血流输送到淋巴结和脾等周围免疫器官发挥免疫功能。
若新生期切除胸腺或胸腺生长肿瘤，可导致细胞免疫功能显著下降，常因感染而死亡。
胸腺的组织结构：胸腺分左右两叶，表面覆盖有一层结缔组织被膜，被膜深入实质将实质分割成若干小叶。
胸腺小叶的外层为皮质，内层为髓质。
胸腺皮质区分为浅皮质区和深皮质区。
皮质区内85%-90%的细胞为未成熟的T细胞。
髓质区内有大量的胸腺上皮细胞和稀疏分散的较成熟的胸腺细胞、单核-巨噬细胞和树突状细胞。
标本：胎儿胸腺、胸腺组织切片图1.不同年龄期的胸腺示意图2、骨髓(Bone marrow)骨髓位于骨髓腔中，分为红骨髓和黄骨髓。
红骨髓有造血功能，由造血组织和血窦构成。
造血组织主要由基质细胞和造血细胞组成。
基质细胞包括网状细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞等。
骨髓是各类血细胞和免疫细胞发生的场所。
骨髓又是B细胞分化成熟的场所和体液免疫应答发生的场所。
因此骨髓既是中枢免疫器官又是外周免疫器官。
标本：骨髓组织切片法氏囊（Bursa of Fabricius）在禽类，法氏囊是位于泄殖腔上方的一个囊状物，内充满着淋巴组织，其中淋巴细胞不断受囊素的影响，发育成B淋巴细胞。
若新生期切除法氏囊，抗体的形成将受影响，而细胞免疫功能不受影响。
对于B淋巴细胞发育而言，禽类的法氏囊具有哺乳类动物骨髓相似的作用。
抗体生成细胞检测.
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识别阶段
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活化阶段
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膜攻击阶段
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实验二 抗体生成细胞检测
免疫学教研室 李宗喜 5346
脾脏
第二大免疫器官 捕获血源性抗原 储存血液
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小鼠B细胞溶血空斑形成试验
溶血空斑形成试验是基于抗原抗体反应可 活化补体，溶解细胞的原理来检测抗体形 成细胞的一种体外试验方法，是用于检查 动物的抗体产生功能的经典的试验。
7. 微量进样器和离心机等。
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操作步骤
免疫小鼠 血清分离 脾细胞分离、计数 溶血空斑试验
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血清分离
眼球取血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻 压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽 量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突 出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒 立，用1.5mlEp管接住流出的血液。每 次采血量1－2ml。
ELISPOT不仅可应用于B细胞分泌抗体功 能的测定，也能检测分泌细胞因子的T细 胞和巨噬细胞。
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结束
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体外抗体形成细胞检查法(溶血空斑实验 PFC)(Plaque forming ce
体外抗体形成细胞检查法（溶血空斑实验 PFC）(Plaque forming cePFC测定技术又称溶血空斑试验。
是一种体外检测单个抗体形成细胞（浆细胞）的方法。
自从1963年 Jerne和Nordin首先建立PFC测定技术以来,使免疫学方法得到很大的发展。
特别是间接溶血空斑测定法的建立，更扩大了本实验的应用范围。
它不仅可以测定产生 IgM 类的抗体产生细胞，而且还可以检测产生其他各类免疫蛋白及其亚类的抗体形成细胞。
它不仅可以作为免疫基本理论研究的有力工具，而且还可以作为临床筛检抗肿瘤新药以及研究中药对机体免疫功能的影响（免疫增强剂和免疫抑制剂）的特异指标。
溶血空斑试验分直接溶血空斑试验和间接溶血空斑试验。
前者是为测定产生 IgM 型抗体的细胞。
因为活化补体的能力强，可以不必另加抗Ig 试剂（显斑剂），也就是只加细胞和补体即可出现空斑，故称直接溶血空斑测定。
至于产生其他类型抗体的（如 IgG 或 IgA 等）细胞检测，就需要在试验系统中另加显斑剂（因为这些类别的抗体活化补体的能力弱）也就是加靶细胞和抗各类 Ig 高纯度的抗血清（系指用高浓度的抗原制备的抗血清）再加补体才能出现可见的空斑，故称间接溶血空斑测定。
小鼠脾PFC测定方法，经多次改进使本法的敏感度不断提高。
目前所用的方法分为：琼脂固相法和小室液相法。
其基本原理是将经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞（靶细胞）混合，在补体参与下，使抗体形成细胞周围结合了抗体分子的羊红细胞溶解形成肉眼可见的溶血空斑。
一琼脂固相法[实验材料]（1）玻璃器皿（7X1.5 厘米）（2）1毫升注射器和青霉素小瓶（3）水浴(47-49℃ )（4）Hanks'液（5）胎牛血清(56℃30分钟灭活,并经羊红细胞吸收)（6）琼脂或琼脂糖(表层基0.7%;底层基1.4%;用Hanks'液配制 ) （7）右旋糖酐(DEAE-dxtran分子量50万,用蒸馏水配置10毫克/毫升). （8）抗-Ig血清(测定间接空斑用)（9）20%绵羊红细胞悬液(Hanks'液配制)（10）补体:新鲜豚鼠血清(用前经绵羊红细胞吸收)[试验方法]（1）将溶化的底层琼脂倾注平皿形成一薄层, 将其凝固,备用。
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实验方法——补体制备
豚鼠心脏取血，分离血清。稀释成1：8，备 用。
实验方法——SRBC制备
取羊颈静脉血，生理盐水洗涤3次，制备成25% 的羊血备用。
试验方法——制备PFC
取脾细胞50μL，SRBC 50μL，补体50μL混合， 用1640补充到500μL，混合均匀。 微量加样器将混合液注入事先制备好的小室中。 每室约100μL，37°C的温箱中1-2小时，观察 结果。可借助显微镜观察。
体外抗体形成细胞检查
医学免疫学教研室
实验目的
掌握小鼠脾细胞的制备方法。 了解体外抗体形成细胞的检查。
实验原理
将一定量洗涤过的绵羊红细胞静脉或腹腔注射 小鼠，注射后4天将小鼠杀死，制成脾细胞悬 液，内含抗体形成细胞（PFC）. 将脾细胞、绵羊红细胞及补体混合孵育，由于 PFC分泌的抗体与绵羊红细胞（抗原）结合形 成IC，激活补体，可形成肉眼可见的空斑。 是机体免疫状态的指标。特异性高，简单，好胶制备的小室。 绵羊红细胞 补体（豚鼠血清） 细胞营养液（1640） 微量加样器 PH=7.2的PBS 小平皿
实验方法——免疫小鼠
5%的SRBC0.1mL注射小鼠腹腔，4天后处死。
实验方法——制备脾细胞悬液：
1.
2.
3. 4. 5.
取出脾脏，用1支5mL和1支2mL注射器在含有2mL PBS的小平皿中刮出脾细胞。 用2mL注射器抽吸刮出的脾细胞3-5次，使脾细 胞尽量分散。 用约8mLPBS洗涤脾细胞3次；每次1000转，10分 钟。 最后将沉淀细胞悬浮于1mL1640液中。 细胞计数，配成2-3×107/mL，备用。