实验三 抗体形成细胞能力的检测——QHS和第3次免疫

C
T
3. 方法： 方法：
2）抗原-抗体-补体反应： 抗原-抗体-补体反应：
1ml
Hank’s 脾细胞
加1ml SRBC 溶液 加1ml补体 1ml补体 彻底混匀 37℃孵育1h 37℃孵育1h 离心，3000rpm， 离心，3000rpm，5min 分光光度计检测上清液 413nm波长下的吸光值 413nm波长下的吸光值
1. 原理： 原理：
抗原 脾脏
IgM
4 days later
SRBC
免疫小鼠
+ SRBC 补体
浆细胞
分光光度计 定量分析
Hb
2. 材料： 材料：
SRBC免疫小鼠 SRBC免疫小鼠 新鲜SRBC溶液 (1.5× 新鲜SRBC溶液 (1.5×108/ml) SRBC 经SRBC吸收的补体溶液 SRBC吸收的补体溶液
3. 方法： 方法：
1mm WBC WBC
1mm
RBC
WBC WBC
细胞浓度/ml 细胞浓度/ml 5个中方格中的细胞总数 = 5个中方格中的细胞总数 x 5 x 104
细胞浓度/ml 细胞浓度/ml 4个大方格中的细胞总数 个大方格中的细胞总数/4 = 4个大方格中的细胞总数/4 x 104
4. 注意事项： 注意事项：
新鲜SRBC溶液， 新鲜SRBC溶液，用前晃匀 SRBC溶液 保持脾细胞活性
TLeabharlann Baidust 2
第三次免疫
方法: 2. 方法:
脱纤维绵羊红细胞（SRBC） 脱纤维绵羊红细胞（SRBC） 加入3ml 生理盐水， 加入3ml 生理盐水，混匀 2000rpm, 离心，5min 离心， 弃上清 加入3ml 生理盐水， 加入3ml 生理盐水，混匀 2000rpm, 离心，5min 离心， 弃上清 制备绵羊红细胞溶液20%、 制备绵羊红细胞溶液20%、 25%、30%、 25%、30%、40% 取0.1ml 皮下注射 免疫小鼠
抗原+ 抗原+抗体
结合补体
抗原+抗体+ 抗原+抗体+补体
补体活化，形成MAC 补体活化，形成MAC
靶细胞裂解
定量溶血分光光度计法体外检测 细胞产生抗体的能力
( QHS——Quantitative Hemolytic QHS—— ——Q Spectrophotometric determination )
来自豚鼠血清 经SRBC吸收去除非特异性抗体 SRBC吸收去除非特异性抗体
断颈处死SRBC免疫的小鼠 断颈处死SRBC免疫的小鼠 SRBC
3. 方法： 方法：
1） 制备脾细胞
取脾， 取脾，以Hank’s 液漂洗 经200钼铜网，以针拴研磨脾脏成单细胞悬液 200钼铜网， 钼铜网 收集细胞悬液，加适量Hank’s 收集细胞悬液，加适量Hank’s 洗涤 离心1500rpm, 离心1500rpm, 5min 弃上清 细胞沉淀中加入4.5ml蒸馏水， 细胞沉淀中加入4.5ml蒸馏水，用力混匀 40s 4.5ml蒸馏水 迅速加入0.5ml 迅速加入0.5ml 9%NaCl 加入 离心 1500rpm, 5min 弃上清，加入1.2ml Hank’s溶液 弃上清，加入1.2ml Hank’s溶液
实验三 体外检测细胞产生抗体的能力 ——QHS法 ——QHS法 QHS &第三次免疫
ComplementComplementbinding site
结合抗原之前
结合抗原之后
CH1 CH2
Fc段 段
C1q 结合 位点被屏 障
暴露的 C1q结 结 合位点
IgM CH3区，IgG CH2区 区 区