免疫细胞功能的测定(精)
重度免疫缺陷诊断标准
重度免疫缺陷诊断标准
1.临床表现：患者出现反复或慢性感染的症状，包括发热、咳嗽、咳痰、呼吸困难、腹泻、便秘、脓疱等。
这些感染可能是细菌、真菌、病毒
或寄生虫引起的。
2.血象和免疫球蛋白水平：血象检查中，外周血淋巴细胞计数可能明
显减少，免疫球蛋白（Ig）水平（包括IgG,IgA,IgM）可能低于正常范围。
重度免疫缺陷患者常常伴有IgG水平明显降低。
3.体内感染指标：对常见的流行病菌进行培养检查，如肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌和嗜血杆菌等。
血和/或骨髓培养中的细菌或真菌阳性
结果提示存在重度免疫缺陷。
4.免疫功能指标：通过测定免疫细胞的数目和功能来评估患者的免疫
系统功能是否正常。
例如，测定T细胞、B细胞、自然杀伤细胞的数量和
活性。
低于正常范围的结果可能表明存在严重的免疫缺陷。
5.遗传学检查：遗传学检查可以帮助确定免疫缺陷的遗传基础。
对于
一些常见的免疫缺陷如严重联合免疫缺陷（SCID），可以通过遗传学检查
来确定患者是否存在基因突变。
此外，还需要排除非免疫系统缺陷导致的免疫异常，如药物诱导的免
疫抑制、严重营养不良或恶性肿瘤等。
总之，重度免疫缺陷的诊断需要进行临床症状评估、血象和免疫球蛋
白水平检测、体内感染指标评估、免疫功能指标测定和遗传学检查等综合
考虑，以确定患者是否存在免疫系统功能严重受损的情况。
及早诊断与治
疗对于减少感染次数、改善生活质量和提高生存率至关重要。
医学免疫学免疫学检测技术ppt课件
双抗体夹心法、间接法ELISA
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间接法ELISA
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ELISA操作图
可调移液器
8孔道可调移液器 17
3. 放射免疫测定（RIA）
常用 125I，测定微量物质 4. 化学发光免疫分析
常用 鲁米诺，测定超微量物质 5. 免疫印迹法（Western Blotting）
先做凝胶电泳将蛋白质分区 再将蛋白质转移至固相载体 后用酶免疫、放射免疫等技术加以测定
1. 免疫荧光法（IFA ）
荧光素可双色；使免疫复合物呈荧光；可定性、定位
（1）直接荧光法 荧光素一抗 对每种抗体作标记 特异 测Ag
（2）间接荧光法： 荧光素二抗 不必标记每种抗体 敏感 测Ag/Ab
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免疫荧光法
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2. 酶免疫测定（EIA）: ELISA与酶免疫组化
（1）双抗体夹心法ELISA：查抗原
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II ) Precipitation （二）沉淀反应
可溶性抗原 + 相应抗体肉眼可见的沉淀物 使用半固体琼脂凝胶为介质——琼脂扩散/免疫扩散
1. 单向免疫扩散：抗原 的定量（Ig、C3 ）
2. 双向免疫扩散：抗原/抗体的定性、组成及Ag相关性分析 3. 免疫电泳： 电泳 + 双向免疫扩散 （抗原分析）
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3. 细胞因子检测
（1）免疫学检测法—— 夹心法ELISA FCM
（2）生物学检测法—— 细胞增殖（或细胞增殖抑制）试验 细胞毒（或细胞毒抑制）试验
（3） 分子生物学检测法 RT-PCR测定mRNA
4. 皮肤试验： 测试IV型超敏反应能力
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（二）B细胞功能测定
1. B细胞增殖试验 小鼠：LPS 人： SPA；抗IgM
非特异性免疫功能测定中性粒细胞趋化功能
四、巨噬细胞功能： 溶菌酶测定
溶菌酶（lysozyme , LSZ），能与细菌牢固结合， 并使其裂解，主要由单核巨噬细胞释放。
步骤： 1 融化琼脂，和靶细菌混匀，浇注于无菌平皿内 2 打孔，加待检样品和LSZ 3 孵育 4 测量溶菌环直径，制作标准曲线求值 参考值： 血清LSZ：1～2mg/L，尿：1～3mg/L 唾液中：30～70mg/L
结果： 趋化指数 =
A(白细胞向趋化因子孔移动的距离) B(白细胞向阴性对照孔移动的距离)
参考值：新生儿趋化指数为2.0～2.5，成人为3.0～ 3.5。
临床意义：白细胞趋化功能缺陷见于ChediakHigashi综合症、迟钝白细胞综合症、肌动蛋 白功能不全症、类风湿性关节炎、糖尿病等。
二、中性粒细胞吞噬功能测定 1： —— 硝基蓝四氮唑试验
第五部分 非特异性免疫功能测定
一、中性粒细胞趋化功能：
——琼脂糖凝胶板法
原理：中性粒细胞在琼脂糖凝胶内向有趋化因子存 在的方向移动，通过测定其移动距离，判定中性 粒细胞趋化功能。
试剂：趋化因子（酵母多糖活化人血清），白细胞 悬液，培养基（RPMI1640培养基），15.0g/L琼脂 糖。
方法：1.制备琼脂糖凝胶板；2.打孔；3,中央孔加 白细胞悬液，左侧孔加趋化因子，右测孔加阴性 对照；4.孵育；5.固定、染色；6.镜检。
原理：中性粒细胞代谢中产生的氢与吞噬的硝基蓝四 氮唑(nitroblue tetrazolium，NBT)反应，生 成蓝黑色甲攒(formazan)颗粒，沉积胞浆，计 数一定数量的中性粒细胞和含甲攒颗粒细胞 (NBT细胞)所占的百分率。
步骤：① 待检血加入等量的NBT孵育； ② 取一滴推片、染色，计数NBT阳性细胞百分 率。
t细胞效应检测方法
t细胞效应检测方法标题：深入了解T细胞效应检测方法T细胞是人体免疫系统的重要组成部分，负责识别并消灭感染和异常细胞。
在研究和临床实践中，准确检测T细胞的效应功能对于评估免疫状态和疾病进展至关重要。
本文将详细介绍几种常见的T细胞效应检测方法。
一、T细胞增殖实验T细胞增殖实验是检测T细胞功能的一种基础方法。
该实验通常通过以下步骤进行：1.收集待检测的T细胞样本。
2.将T细胞与特异性抗原或刺激剂共同培养。
3.通过细胞计数、放射性标记物摄取或其他检测手段评估T细胞的增殖情况。
二、细胞因子释放实验细胞因子是T细胞活化后分泌的免疫调节蛋白。
通过检测细胞因子的释放，可以评估T细胞的效应功能。
常见的细胞因子释放实验有以下两种：1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：通过特异性抗体捕获细胞因子，然后进行定量分析。
2.流式细胞术：利用荧光标记的抗体检测细胞因子分泌情况。
三、T细胞杀伤实验T细胞杀伤实验是评估T细胞对靶细胞杀伤能力的方法。
常见的方法有：1.51Cr释放实验：将放射性同位素标记的靶细胞与T细胞共培养，通过测定释放的放射性同位素量来评估T细胞的杀伤能力。
2.非放射性细胞毒性实验：利用荧光染料、钙离子指示剂等代替放射性同位素，评估T细胞对靶细胞的杀伤作用。
四、流式细胞术流式细胞术是一种高精度的细胞检测技术，可以评估T细胞的多种功能，如：1.表型分析：通过检测细胞表面的标记物，了解T细胞的亚群分布和活化状态。
2.细胞内细胞因子染色：检测T细胞内特定细胞因子的表达情况。
五、免疫组化技术免疫组化技术是检测组织中T细胞分布和功能的一种方法。
通过特异性抗体与T细胞表面或细胞内分子结合，然后利用染色剂显色，观察T细胞在组织中的分布和活化状态。
总结：T细胞效应检测方法多种多样，研究人员可以根据实验需求和条件选择合适的方法。
临床免疫学检验-第十三章细胞免疫学技术
Ficoll分离法
聚蔗糖-泛影葡胺分层液的制备
6%聚蔗糖溶液 (Ficoll溶液)密度1.020
34%泛影葡胺溶液 (Hypaque溶液)密度1.2
酸性磷酸酶测定 非特异性酶的测定
巨噬细胞功能检测
炭粒廓清试验
正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90% 炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据 此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)， 间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒 的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判 断巨噬细胞的功能。
吞噬功能检测
鸡RBC
l液 密度1.135
细胞混悬液
高速离心 密
度
6小时
梯 度
低速离心 密 度 梯 度
死细胞残片和血小板 富含单核细胞的组分
富含淋巴细胞的组分 红细胞与粒细胞组分
淋巴细胞亚群的分离
T细胞和B细胞的分离
E花环分离法 尼龙棉分离法
E花环分离法
E受体
T
SRBC
B
E花环 T
离心
B
E花环
聚蔗糖-泛影
形成溶血空斑
可以检测致敏红细胞的各种抗原所对应的抗体,临 床应用比较广泛
反向空斑形成试验
反应物: 琼脂凝胶
SPA致敏的SRBC B细胞 补体 抗Ig抗体
形成溶血空斑
体外检测人类Ig分泌细胞的方法,与抗体的特异性 无关
酶联免疫斑点法
反应物:
包被在固相载体上的抗原 B细胞 酶标二抗
加底物显色
计数斑点形成细胞
免疫功能检查及临床意义
免疫功能检查及临床意义一、体液免疫【SIgA(分泌性免疫球蛋白A)】分泌液中的IgA称为分泌性IgA(SIgA)。
SIgA中的分泌片由粘膜上皮细胞合成，是一种糖蛋白，可抵御外分泌液中蛋白水解酶的作用。
SIgA是多种细胞和病菌的中和抗体，主要在粘膜部分起作用。
当呼吸道受到感染或接受气雾疫苗免疫时，呼吸道中的分泌性IgA将显著升高。
[检测方法]：RIA法[参考值]：血清SIgA 13.14±7.60mg/L[临床意义]：血清SIgA增高常见于原发性胆汁性肝硬化，胆道阻塞，急性病毒性肝炎，慢性肝实质病变和酒精性肝硬化。
【IgA(免疫球蛋白A)】免疫球蛋白A的基本结构是由两条重链和两调轻链组成，它可以有不同的聚合形式，从单体到五聚体不等。
[检测方法]：RIA法[参考值]：正常人血清IgA含量2.500±0.752 g/L[临床意义]：1、血清IgA增高IgA骨髓瘤，慢性炎症，结缔组织疾患及肿瘤。
2、血清IgA降低选择性IgA缺乏症。
【IgE(免疫球蛋白E)】正常人血清中IgE含量极低。
[检测方法]：RIA法[参考值]：男性31~535μg/L(631±128U/L)女性31~2000μg/L(337±60U/L)[临床意义]：血清IgE升高主要见于过敏性疾病及免疫性疾病。
常见于特发性喘息，鼻炎，变应性皮炎，寄生虫感染，急、慢性肝炎，肝硬化，原发性肝癌，SLE，IgE骨髓瘤，慢性淋巴细胞性白血病，结节病等。
血清IgE可用于类风湿性关节炎和风湿性关节炎的鉴别诊断，类风湿性关节炎患者血清IgE明显增高，而风湿性关节炎患者血清IgE维持低水平。
【IgM(免疫球蛋白M)】IgM是一种最有效的凝聚抗体，有很强的激活补体的能力。
IgM分子在血清中含量不高，只占Ig总量的6%左右。
在个体发育中IgM是最早合成的抗体，胚胎后期就能合成。
IgM不能通过胎盘，脐血中出现针对某种微生物的IgM，表示胚胎期有相应病原微生物如梅毒螺旋体，风疹病毒或巨细胞病毒感染，称之为胚胎感染或垂直感染。
体液免疫功能的检测
体液免疫功能的检测临床上一个反复发作的化脓感染，常使医生想到患者是否有免疫缺陷病，一般原发免疫缺陷发病年龄很小，而继发免疫缺陷病人多在30岁以上。
绝大多数免疫缺陷病人多表现为体液和细胞免疫同时受损，所以应全面检查这两方面的功能。
遗憾的是，目前应用的检测方法的局限性，其结果常难以得出明确结论。
一、免疫球蛋白的定量检测1．血清免疫球蛋白的测定血清免疫球蛋白（Ig）的测定是检查体液免疫功能最常用的方法。
由于目前还没有发现由IgD和IgE缺陷所致疾病，所以通常检测Ig G、IgM、IgA，这三类Ig就可以代表血清Ig的水平（表20-2）。
检测发现三类Ig水平均明显低下，就可考虑体液免疫缺陷。
但在分析儿童Ig水平时，应注意Ig的水平随年龄而变化。
体液免疫功能缺陷首先考虑患者血清Ig 水平，如果所有类别Ig水平均降低，即称为一般性联低丙种球蛋白血症。
如果免疫球蛋白水平极度低下，或IgG、IgM、IgA,三类Ig总量低于2mg/ml则称为严重低丙种球蛋白血症或无丙种球蛋白血症(agammaglobulinemia)。
如果只一种或两种Ig水平降低，则称为异常丙种球蛋白血症（dysgammaglobulinemia）。
一般性低丙种球蛋白血症多见于继发性免疫缺陷病。
无丙种球蛋白血症常见于原发免疫缺陷病。
但是常有约50%IgA缺陷病人无临床症状，伴有反复感染的IgA缺陷病人常同时有IgG的缺陷。
常规的定量检测血中Ig的方法是单向免疫扩散和免疫比浊法。
表20－2 人类血清免疫球蛋白正常量类别变化较大时期（mg/ml）达到成人水平与均值IgG 1 ～5岁8.0 ～10.04 ～8岁 8.0 ～10.09 ～13岁 10 ～11.0 8岁以后12．0±2.6mg/ml (150±321IU/ml)IgA 1 ～2岁0.54 ～8岁 1～1.59 ～13岁 1.5～2.0 12岁以后2．0±0.5mg/ml (140±36IU)/ml)IgM 1 ～4岁1.04 ～8岁 1.09 ～13岁 1.0 男性1岁女性2岁1.1±0.3mg/ml (130±40IU)/ml)注：IU=国际单位2．分泌型IgA(SIgA)的测定 SIgA是粘膜抗感染的重要因素，但是粘膜抗感染还包括少量渗出的IgM和IgG，还有细胞免疫的作用。
体检对免疫力的评估
体检对免疫力的评估1. 引言免疫力是人体对抗疾病的能力，对于预防和治疗疾病起着关键作用。
体检是评估个体健康状况的重要方法之一，通过体检可以获得很多关于免疫力的相关信息。
本文将介绍体检对免疫力的评估方法和相关指标。
2. 体检项目2.1 血常规血常规检查是体检中常用的检查项目，可以获得各种血细胞的数量和形态信息。
对于血液系统相关的免疫功能具有重要意义。
血常规指标包括白细胞计数、红细胞计数、血小板计数、血红蛋白、红细胞压积等指标。
免疫系统异常常常会导致这些指标的异常变化，通过血常规检查可以初步评估个体的免疫功能是否存在问题。
2.2 免疫球蛋白测定免疫球蛋白是免疫系统中的重要组成部分，可以抵御各种病原体的侵袭。
免疫球蛋白测定可以评估个体的免疫功能，包括总免疫球蛋白和各类免疫球蛋白的浓度。
通过测定免疫球蛋白的水平，可以初步了解个体免疫功能的状态。
2.3 淋巴细胞亚群测定淋巴细胞亚群包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞等。
它们在免疫系统中发挥着重要的作用。
通过测定淋巴细胞亚群的比例和数量，可以进一步评估个体的免疫功能。
例如，CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的比值可以反映免疫系统的活性水平。
2.4 免疫功能检测免疫功能检测可以综合评估个体的免疫力水平。
常用的免疫功能检测项目包括溶血试验、超敏C反应蛋白测定、补体检测等。
通过这些检测可以了解个体的免疫系统是否正常，是否存在免疫力低下的情况。
3. 评估指标3.1 免疫指数免疫指数是一种综合评估个体免疫功能的指标，它综合考虑了多个体检项目的结果。
通过对各项指标的加权计算，可以得到一个综合评估结果。
免疫指数越高，表示个体的免疫功能越好。
3.2 免疫调节细胞比例免疫调节细胞包括调节性T细胞（Treg）、抑制性B细胞（Breg）等。
它们可以帮助调节免疫系统的功能，维持免疫平衡。
通过测定免疫调节细胞的比例，可以了解个体免疫系统的调节功能是否正常。
3.3 炎症指标炎症是免疫系统对抗外界侵袭的一种反应。
免疫缺陷性疾病的细胞性检测方法解析
免疫缺陷性疾病的细胞性检测方法解析免疫缺陷性疾病（Immunodeficiency）是指机体体液免疫和细胞免疫功能异常或缺陷，导致机体对各类病原体的免疫应答受到不同程度的损害。
细胞性免疫缺陷是免疫缺陷性疾病中的重要类型之一。
准确而快速地检测细胞性免疫功能的异常对于疾病的早期诊断和治疗至关重要。
本文将对细胞性检测方法进行详细解析，旨在为研究和临床提供参考依据。
一、细胞性免疫检测方法的分类根据检测目标、原理和操作步骤的不同，细胞性免疫检测方法可以分为直接方法和间接方法。
1. 直接方法直接方法是通过直接观察细胞或其功能状态的变化来进行检测。
常见的直接方法包括淋巴细胞表型分析、流式细胞术、蛋白质芯片分析等。
这些方法能够直接反映细胞的功能状态和表型特征，具有较高的准确性和灵敏性。
然而，直接方法的操作复杂，需较为专业的设备和技术支持。
2. 间接方法间接方法是通过测定与细胞功能相关的因子或代谢产物来间接评估细胞功能状态。
间接方法包括淋巴细胞功能试验、细胞因子检测、外周血细胞数量分析等。
间接方法操作相对简单，通常能够获得较为准确的结果。
但间接方法不能直接观察细胞的变化，因此在一定程度上会受到其他影响因素的干扰。
二、细胞性免疫检测方法的应用细胞性免疫检测方法广泛应用于疾病的早期诊断、治疗效果评估和免疫功能监测等方面。
1. 早期诊断细胞性免疫检测方法能够及早发现细胞免疫功能异常，对于早期诊断免疫缺陷性疾病具有重要意义。
例如，通过检测淋巴细胞表型和外周血细胞数量可以判断是否存在细胞免疫功能缺陷，进一步指导疾病的诊断和治疗。
2. 治疗评估细胞性免疫检测方法可以用于评估免疫治疗的效果。
免疫疗法常常通过增强或调节机体的细胞免疫功能来改善疾病的进程和预后。
检测治疗前后的淋巴细胞功能状态和相关指标的变化，可以直观地评估治疗的有效性。
3. 免疫功能监测细胞性免疫检测方法可以用于长期监测患者的免疫功能变化。
对于已经诊断为免疫缺陷性疾病的患者，监测其细胞免疫功能的变化可以指导疾病的管理和治疗调整。
细胞免疫功能测定在危重症患者中的临床意义
可 作 为 评估 危【 键 词】 细 胞 免疫 ；危 重 症 ；Ｔ淋 巴细 胞 亚 群 ； 杀伤 细 胞 ， 然 ；急 性 病 生 理学 和 长 期健 关 天
康 评价
Ｃｌ ｃ ｓｇｎ ｆｃ ｃ ｏ ｃ ｌｕ ａ ｉ ｍ ｕ ｆ ｃ ｉ ｄ ｔ ｒ ｉ ｔｏｎ ｉ ｉ ａｌ ｉ ｉ ａｎ ｅ ｆ ｅｌ ｌ ｒ ｍ ｎｉ ｉ ｎｅ ｕ ｔｏｎ ｅ ｅ ｍ ｎａ ｉ ｎ ｎ ｃ ｉｉａｌ ｒｔｃ ｐａｔｅ ｓ ＣＨＥＮ ｉ ｎｔ
・
・１ ・ ９
论著 ・
细 胞 免疫 功 能测 定在 危 重 症 患者 中的 临床 意义
陈永 斌 张敏 珍 杨 国辉
探 讨 细 胞 免 疫 功 能 与 危 重 症 患 者病 情严 重程 度 和 预 后 的关 系 。 方 法 选 择
【 摘要 】 目的
资 料 完 整 的危 重症 患者 ４ ３例 ， 据 ２ 存 情 况 ， 患 者 分 为 存 活 组 （ １ 及 死 亡 组 （２例 ） 根 ８ ｄ生 将 ２ 例） ２ ， 并通 过 急 性 病 生 理 学和 长 期 健 康 评 价 （Ｐ Ｃ Ｅ Ａ Ａ Ｈ ）Ⅱ评 分 计算 出分 值 ， 用 流 式 细胞 仪对 Ｔ淋 巴细 采 胞 亚群 及 自然 杀 伤 （ Ｋ 细 胞 进 行 检测 。 结 果 Ｎ ） 与 存 活 组 比较 ， 亡 组 外 周 血 Ｔ淋 巴细 胞 Ｃ 死 Ｄ 、
Ｙ ｎ－ｉ Ｚ Ａ Ｍｉ ｚｅ， Ｙ ＮＧ Ｇ ｏｈ ｉ Ｄ ｐ ｒ ｅ ｔ ｏ Ｒ ｓｉ ｔ ｎ Ｂ ｉ ｎ Ｐｏ ｌ ｏｇｂｎ Ｈ ＮＧ ， ｎ ｈｎ Ａ ｕ —ｕ． ｅ ａｔ ｎ ｆ ｅ ｒ ｉ ， ｅ ｕ ｅｐｅ － ｍ ｐ ａｏ ｌ
Ｈ ｓｉａ ｏ ｉ ｂ， ｉｇ ｏ３ ５ ０，Ｃ ｉａ ｏｐｔ ｌ ｆ ｌ￣ ｏ Ｎ ｎｂ １８ ６ ｈｎ ｉ ｖ ｇ ［ ｂｔａ ｔ Ｏ ｊｃｉｅ Ｔ ｎ ｅｔ ａ ｈ ｅ ｔ ｎ ｂ ｔｅｎ ｃｌ ｌ ｍ ｕ ｅ ｆｎｔ ｎ ａ ｄ Ａ ｓ ｃ］ ｒ ｂｅｔ ｏ ｉｖｓｇｔ ｔｅ ｒｌｉ ｅｗ ｅ ｅｕａ ｉ ｍ ｎ ｕ ｃｉ ｎ ｖ ｉ ｅ ａｏ ｌ ｒ ｏ
实验设计(从影响淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖角度)检测免疫细胞的数目和活性
T细胞转化、增殖试验:H3-TdR掺入
PHA T ConA 母
增殖
TT
加H3-TdR T
PBA:苯硼酸 Hanks液:生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液(Balanced Salt Solution,BSS )，简称H。主要用于配制培养液，稀释剂和细胞清洗 液，而不能单独作为细胞组织培养液。 瑞氏姬姆萨染液：为天青色素、伊红、次甲蓝的混合物，本染色液最适于血 液涂抹标本、血球、疟原虫、立克次体以及骨髓细胞、脊髓细胞等的染色。 染前用蛋白酶等进行处理，然后再用姬姆萨染液染色，在染色体上，可以出 现不同浓淡的横纹样着色。姬姆萨染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞 浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。 环磷酰胺:作为免疫抑制剂 PHA：植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)，是一种有丝分裂原，主 要用于激活免疫细胞――淋巴细胞 香菇多糖：香菇多糖(1entinan，LNT) 香菇多糖是从优质香菇子实体中提 取的有效活性成分，是香菇的主要有效成分，是一种宿主免疫增强剂(host defense potentiator，HDP)，临床与药理研究表明，香菇多糖具有抗病 毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等作用。
【实验任务】
市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用，请设计一 个方案证实之（从影响淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖的 角度考虑）。
【目的要求】
一、学会设计实验，从淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖的角 度证实某产品有免疫增强作用。
免疫学实验设计_证实某产品的免疫增强作用(考虑淋巴细胞活性及功能)
设计思路1
E花环沉降法： 免疫学上用来检测T细胞数量的一种实验方法，T细胞表面具有能与绵羊红细 胞(SRBC)表面糖肽结合的受体，称为E受体(CD2)。CD2 是一种糖蛋白，相 对分子质量为30 000~60 000，已证实E受体是人类T细胞所特有的表面标志。 当T细胞与SRBC混合后，SRBC便粘附于T细胞表面，呈现花环状。通过花 环形成检查T细胞的方法，称为E花环形成试验。根据花环形成的多少，可测 知T细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能状态
中的单核巨噬细胞 ,再分别以脱脂棉柱或尼龙棉柱纯化T淋巴细胞。纯化的T 淋巴细胞经流式细胞仪检测T淋巴细胞纯度 ,台盼蓝排斥实验检测纯化T细胞 活力 • 脱脂棉柱滤过分离法可以代替尼龙棉柱法获得高纯度高活性的T淋巴细胞
Thanks.
箱固定15分钟。 • 5.取出后，轻轻旋转试管，使沉淀细胞重新悬浮;取1滴涂片，自然干燥后，瑞
氏染色，高倍下观察。
设计思路1
• 结果处理 • 凡能结合3个SRBC者即为E花环阳性细胞。计数200个淋巴细胞，算出花环
形成细胞百ห้องสมุดไป่ตู้率。
E-花环
设计思路2
• 尼龙棉分离法 • 密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞 ,通过玻璃器皿黏附的方法去除其
设计思路1
• 操作方法 • 1.用分层液密度梯度离心法分离淋巴细胞，计数后，用Hanks液配成107个/ml
细胞悬液。 • 2.取0.1 ml淋巴细胞悬液，加入0.1 ml 1% SRBC及0.05 ml灭活小牛血清，混匀。 • 3.37℃静置5分钟，500 rpm低速离心5min后，放入冰箱，2小时或过夜。 • 4.取出试管，吸弃上清液，加0.8%戊二醛溶液1 滴，轻轻旋转混匀，置4℃冰
nk细胞检测方法
nk细胞检测方法NK细胞检测方法引言：自然杀伤细胞（Natural Killer cell，NK cell）是一类重要的免疫细胞，具有杀伤肿瘤细胞和感染细胞的能力。
NK细胞检测方法是一种重要的检测手段，可以帮助医生评估患者免疫功能，及时发现异常情况并采取有效的治疗措施。
本文将详细介绍NK细胞检测的常用方法及其原理。
一、流式细胞术流式细胞术（Flow cytometry）是一种常用的NK细胞检测方法。
它通过单细胞悬浮液中细胞表面或细胞内的特定标记物进行定量分析和定性鉴定。
在NK细胞检测中，可以将特定的抗体与细胞表面的CD56和CD16等标记结合，然后通过流式细胞术进行检测和分析。
利用流式细胞仪可以精确计算NK细胞的数量，并评估其功能状态。
二、酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用的免疫学检测方法，也可以用于NK细胞检测。
ELISA方法可以通过特异性抗体与待测样品中的NK细胞结合，然后通过酶标记二抗的作用，产生荧光或颜色反应，从而定量测定NK细胞的含量。
ELISA方法具有灵敏度高、操作简便等优点，被广泛应用于NK细胞的检测与研究。
三、实时荧光定量PCR实时荧光定量聚合酶链反应（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）是一种高灵敏度、高特异性的核酸检测方法，也可以用于NK细胞的检测。
通过选择特异性引物和探针，可以在样品中扩增和定量检测NK细胞特定基因的表达水平。
实时荧光定量PCR方法具有高灵敏度、高准确性和高通量的特点，被广泛用于NK细胞的鉴定和研究。
四、细胞毒性测定细胞毒性测定是一种常用的NK细胞功能检测方法。
该方法通过将待测NK细胞与靶细胞共同培养，观察和测定NK细胞对靶细胞的杀伤作用。
常用的细胞毒性测定包括荧光素钠酸盐释放试验（Lactate Dehydrogenase Release Assay，LDH）和Cr^51释放试验。
第15章-免疫学检测方法及其原理
第2节 免疫细胞及其功能的检测
一、免疫细胞数量的检测
流式细胞术
二、免疫细胞功能的检测
1．T细胞功能的检测 （1）淋巴细胞转化试验 （2）细胞毒试验 2．B细胞功能检测 B细胞增殖试验 抗体形成细胞测定
3．检测细胞免疫功能的皮肤试验 正常机体对特定抗原产生细胞免疫应答后，再用相同抗原 做皮肤试验，即出现以局部红肿为特征的迟发性超敏反应， 细胞免疫正常者呈阳性反应，而细胞免疫低下者则呈阴性 反应。
检测
未知 抗原 抗体
检测
二、特点
1．特异性 是抗原抗体检测的基本原理
2．可逆性 3．可见性
是抗原抗体亲和度大小的体现 是形成可见复合物的关键
三、常见的抗原抗体反应种类
1．凝集反应（agglutination）
颗粒性抗原（细菌或细胞）与相应抗体结合后，在 一定条件下，出现肉眼可见的凝集物，称凝集反应 ①玻片法 直接凝集反应 ②试管法 间接凝集反应 半定量试验，如肥达反应 将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关 的颗粒状载体表面，成为致敏颗粒 （免疫微球），再与相应抗体结合出 现凝集现象称为间接凝集反应。 定性试验，如血型鉴定
2．沉淀反应（precipitation） 可溶性抗原（血清蛋白、外毒素、组织浸出液、细菌 滤液等）与相应抗体结合，在一定条件下，形成肉眼可见的 沉淀物，称沉淀反应。
（1）单向琼脂扩散试验
（2）双向琼脂扩散试验 （3）对流免疫电泳 3．补体参与的反应（complement mediated reactions）
第15章 免疫学检测方法及其原理
学习目标
1．解释血清学反应的概念和特点 2．叙述抗原抗体检测方法及用途 3．简述免疫标记技术的原理和方法 4．简述T细胞功能检测的方法
免疫细胞功能检测在恶性肿瘤患者外周血中的 表达和临床意义
Hans Journal of Biomedicine 生物医学, 2017, 7(3), 54-58Published Online July 2017 in Hans. /journal/hjbm https:///10.12677/hjbm.2017.73009文章引用: 葛琴, 谢国栋, 蔡晶, 赵季忠, 刘继斌, 杨百霞, 崔娟娟, 储春霞. 免疫细胞功能检测在恶性肿瘤患者外周Expression of Immune Cell Function in Peripheral Blood of Patients with Malignant Tumor and Its Clinical SignificanceQin Ge 1, Guodong Xie 1, Jing Cai 1*, Jizhong Zhao 1, Jibin Liu 2, Baixia Yang 1, Juanjuan Cui 1, Chunxia Chu 11Department of Radiotherapy, Tumor Hospital of Nantong, Nantong Jiangsu 2Biotherapy Center, Tumor Hospital of Nantong, Nantong JiangsuReceived: Jun. 22nd , 2017; accepted: Jul. 9th , 2017; published: Jul. 12th , 2017AbstractObjective: To investigate the clinical value of immune cell in peripheral blood of patients with ma-lignant tumor, and to explore its clinical value in the diagnosis and treatment of cancer patients. Methods: 60 cases of cancer patients, including 20 cases of esophageal cancer, lung cancer in 20 cases, 10 cases of nasopharyngeal carcinoma, other tumors (including laryngeal cancer in 1 case, tongue cancer in 1 case, breast cancer in 3 cases, 1 case of skin malignant melanoma, rectal cancer 4 cases) and 20 normal control group peripheral blood T lymphocyte subsets percentage, B lym-phocyte percentage, NK cell percentage, compared with the differences of normal control group. Results: The percentage of total T lymphocytes CD3+, assisted/induced T lymphocyte CD4+ and helped inhibited T lymphocyte ratio CD4+/CD8 in peripheral blood of tumor patients was signifi-cantly lower than that of healthy group (P < 0.05). The percentage of inhibition cytotoxicity T lymphocyte CD8+ was slightly higher than that in the healthy group (P > 0.05). There was no sig-nificant difference between the percentage of total B lymphocytes and the percentage of NK cells in the tumor group and the control group. Conclusions: T lymphocyte subsets are a good method for detecting immune dysfunction in cancer patients, which are of great significance to monitor the disease and judge the prognosis.KeywordsTumor, Immune Cells, Percentage, Immune Function免疫细胞功能检测在恶性肿瘤患者外周血中的表达和临床意义葛 琴1，谢国栋1，蔡 晶1*，赵季忠1，刘继斌2，杨百霞1，崔娟娟1，储春霞1*通讯作者。
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B细胞产生抗体能力的测定
丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定
应用实践
1. 用于确定B细胞活化和分化的信号转导机制，以 及细胞因子和其它银子对B细胞分化的影响。 2. 因为B2细胞产生抗原需要T细胞辅助，所以又可 以用于检测T细胞的辅助功能。 3. 临床上用于研究免疫缺陷病和自身免疫病患者B 细胞分化异常的机制。
B细胞产生抗体能力的测定
丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定
基础理论
人B细胞具有PWM受体，在体外受到PWM刺激 时，发生多克隆激活，产生多克隆抗体。B细胞 产生抗体的能力可以用ELISA测定培养上清中抗 体的量估计，也可以用ELISPOT方法测定产生抗 体的B细胞数量估计。
B细胞产生抗体能力的测定
B细胞产生抗体能力的测定
基础理论
B细胞受到多克隆激活剂或特异性抗原刺激后， 活化、增殖，最后分化成为浆细胞，产生抗体。 抗体可以在血浆和其他体液中检出，检测抗体是 测定B细胞功能的最重要的方法。 B细胞分类：B1细胞和B2细胞。两者发生学不同、 接受刺激的抗原不同，对T细胞的依赖性不同。 由于B2细胞对抗原的应答依赖T细胞，所以， B细胞产生抗体能力的低下，其缺陷也可能起源 于T细胞缺陷。
B细胞产生抗体能力的测定
ELISA测定各类免疫球蛋白
基础理论
B细胞受抗原刺激后，最初产生IgM抗体，然 后在Th细胞产生的各种细胞因子的作用下，可转 类成为IgG、IgA、IgE类抗体。应用不同的单抗， 结合ELISA方法，可以测定B细胞产生的抗体的类 别。
B细胞产生抗体能力的测定
ELISA测定各类免疫球蛋白
T细胞增殖功能测定
抗原诱导的特异性增殖反应
应用实践
1. 丝裂原诱导的增殖反应 临床上用于评估T细胞对多克隆刺激剂的增殖 能力，反映T细胞基本免疫功能，即T细胞群总体 的信息，不能反映个别T细胞克隆的情况 PHA常用于测试人T细胞增殖能力，Con A常 用于测试小鼠T细胞增殖能力。
T细胞增殖功能测定
B细胞产生抗体能力的测定
ELISA测定各类免疫球蛋白
评价
ELISA法灵敏、简单、快速、特异性高、重复 性好，是测定上清和体液中Ig的首选方法。碱性 磷酸酶标记的二抗显色明显，不必用碱中止反应， 尤其适用于测定体外产生的抗体。
应用实践
ELISA可测定各种体液中的抗体，其结果反映 被检个体B细胞功能。测定免疫球蛋白各种亚类 的水平有助于鉴定免疫缺陷病。
丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定
技术方法与评价
1. 分离PBMC96孔板中每孔加入1x105细胞和PWM 终浓度（1：100）。阴性对照孔内不加pWM。每 一实验设2 复本。 2. 37C°5％CO2培养10天（ELISA）或7天 （ELISPOT）。 3. 收集上清，用ELISA法测抗体。收集细胞，用 ELISPOT法测产生抗体的B细胞。
T细胞增殖功能测定
抗原诱导的特异性增殖反应
原理
本试验测定T细胞在体外对某一特定抗原的特 异性免疫应答能力。所用抗原可以是初次接触的 抗原，也可以是曾经免疫过的抗原。常用的测定 回忆反应的抗原有纯化蛋白衍生物（PPD）和破 伤风类毒素（TT）。这2种抗原都被常规列入计 划免疫接种范畴，成人应该对它们有回忆反应。 在某些免疫缺陷病中，对它们的特异性回忆反应 可减弱或消失。
B细胞产生抗体能力的测定
丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定
注意点
采用以抗体为基础的技术（如磁珠法、淘洗 法和流式细胞仪）分离的B细胞，需考虑抗体对B 细胞产生抗体的影响（促进或抑制作用）。
B细胞产生抗体能力的测定
ELISPOT法
基础理论
ELISPOT全称为酶联免疫斑点试验（enzyme －linked immunospot assay），可用于测定产 生IgG和IgM抗体的B细胞。其方法是用抗原包被 固相，然后加入抗原特异性B细胞。如果B细胞产 生抗体，抗体与板上的抗原结合。加入酶标二抗 和显色剂就会显色。一个斑点就代表一个产生抗 体的细胞。
T细胞增殖功能测定
单向混合淋巴细胞培养
5. 计算相对反应（RR）
（实验组cpm－阴性对照组cpm） RR＝ 阳性对照组cpm－阴性对照组cpm
T细胞增殖功能测定
单向混合淋巴细胞培养
注意点
1. 细胞活力：使用冷冻细胞时，复苏后应检查细 胞活力。 2. 培养液中添加的血清：有的血清可能会刺激或 抑制反应。 3. 本底应小于2000 rpm，阳性对照组应大于 20000 rpm。
抗原诱导的特异性增殖反应
应用实践
2. 单向混合淋巴细胞反应 1）本方法主要用于估计器官移植前供体与受者 之间MHC相配程度。 2）如培养时间超过96 小时，可制备细胞毒性T 细胞（CTL）。
T细胞增殖功能测定
抗原诱导的特异性增殖反应
应用实践
3. 抗原诱导的特异性增殖反应 用于估计机体对特异性抗原的应答能力和机体 总体免疫应答能力。
T细胞增殖功能测定
丝裂原诱导的增殖反应
6. 每孔加入50µci 3HTdR，继续培养18h。 7. 用多孔自动收集仪分别收集每孔细胞于一小管中。 溶解细胞，将DNA过滤到滤纸上，洗去未掺入 的3HTdR，最后用100％的甲醇洗涤，以利滤纸 干燥。 8. 将滤纸放入液闪管内，自动计数，打印结果。 9. 扣除本底，计算每一组3个复本的平均数。
方法
1. 包板：96孔板用浓度为10µ g/ml的特异性单抗包被。盖上 盖板，37C°，5％CO2，2h，或4C°过夜。常规洗板， 封闭。 2. 上样：每孔内加入1:10或1:20 稀释的细胞培养上清液 100µ l。阳性对照为标准品，阴性对照为培养液。每试验 设2复本。室温培育2h，或4C°过夜。 3. 加酶标二抗：每孔加100µ l碱性磷酸酶标记的羊抗人IgM或 IgG或IgA二抗。室温培育2h，或4C°过夜。 4. 显色：洗板，每孔加100µ l底物（p－nitrophenyl phosphate）。 5. 自动酶标仪读数，从标准曲线读出抗体浓度。
B细胞产生抗体能力的测定
ELISPOT法
技术方法
1. 抗原包被：37C°2h，或4C°过夜。固相载体可 用聚苯乙烯平皿、亚硝酸纤维膜、96孔板。 2. 抗体生成细胞培育：加入适量抗体生成细胞， 37C°，5％CO2，3～4h，或过夜。洗涤，去除 为与固相结合的细胞。 3. 测定斑点产生细胞：加二抗， 37C°，5％CO2， 2～3h。加辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶和底物 显色。 4 计数：24h后用10～30倍显微镜下计数斑点形成 细胞。
T细胞增殖功能测定
T细胞增殖测定方法 1. 显微镜下观察细胞形态与细胞计数。 2. 放射性核素掺入试验。 细胞增殖时，DNA复制，须从培养液中补充核 苷酸。用放射性核素标记培养液中提供的胸腺嘧 啶（3HTdR），当DNA复制时， 3HTdR掺入正在 分裂的细胞的DNA中。细胞增殖程度与细胞内掺 入的3HTdR的量成正比。通过用液闪仪定量测定 培养细胞中的放射性强度，就可以确定T细胞增殖 的能力与强度。
T细胞增殖功能测定
单向混合淋巴细胞培养反应
原理
T细胞受体能够识别同种异型MHC分子。当把2个不同个 体的单个核细胞在体外混合时，可以相互刺激，引起增殖。 增殖的强度与两者之间MHC的差别的程度成正比。所以 同种异型混合淋巴细胞反应的强度反映2个个体之间MHC 差别的程度，并且因为相互识别与增殖，结果是2个个体 的淋巴细胞增殖能力的总和。这种试验就是双向混合淋巴 细胞培养试验。 将参加反应之一方的单个核细胞用放射性核素照射，使 其失去反应能力，但仍保存刺激能力，成为刺激细胞，则 此时的反应结果仅反映另一方（反应方）的增殖能力。在 实质性器官移植时，只需了解受者淋巴细胞对供者MHC 的反应能力，所以适合采用单向混合淋巴细胞培养反应。
T细胞增殖功能测定
抗原诱导的特异性增殖反应
结果解释
1. 对于接种过破伤风疫苗者来说，本试验结果呈低 反应反映患者对破伤风类毒素特异性应答能力低 下或全身免疫缺陷。 2. HIV感染者反应低下反映CD4+T细胞减少导致的 免疫缺陷。
T细胞增殖பைடு நூலகம்能测定
抗原诱导的特异性增殖反应
注意点
1. 培养液中最好用人AB血清。 2. 此T细胞增殖反应需要APC。如使用纯化T细胞， 需加5％～10％自身APC。
CTL杀伤功能的测定
基础理论
CTL为细胞毒性T淋巴细胞的简称。是CD8＋T 细胞识别APC表面MHC I类分子递呈的肿瘤或病 毒特异性抗原肽后，分化形成的。当CTL遇到相 应的肿瘤细胞或病毒感染细胞时，能够通过细胞 接触机制或裂解机制杀伤靶细胞。
CTL杀伤功能的测定
1. 细胞接触机制 CTL表达FasL，靶细胞表达Fas，FasL与Fas的 配接，通过Fas传入的信号激活靶细胞内细胞凋 亡途径，导致靶细胞死亡。 2. 细胞裂解机制 CTL激活后，胞质内颗粒向2个细胞接触点移 动。颗粒膜与细胞膜融合通过外吐释放颗粒内容 物。穿孔素插入靶细胞膜后聚合，喜爱细胞膜上 形成孔，造成细胞裂解。颗粒酶诱导靶细胞凋亡。
免疫细胞功能的测定
上海交通大学医学院 胡翊群教授
免疫细胞功能的测定
T细胞增殖功能测定
基础理论
本技术用于评估T细胞对各种刺激的增殖能力。 T细胞增殖能力是反映T细胞功能的一个重要指标。
T细胞功能的测定
刺激T细胞增殖的因素及意义
1. 特异性抗原： 引起寡克隆活化增殖。 克用于判断抗原免疫的效果（疫苗接种）和回忆反 应能力，也能反映T细胞总体的功能。 2. 丝裂原：多克隆。 3. 刺激信号转导分子：多克隆。
T细胞增殖功能测定
单向混合淋巴细胞培养试验
方法
1. 分离宿主与供者的PBMC，调整细胞浓度为1 x 106/ml。 2. 刺激细胞灭活：用丝裂霉素（终浓度25µ g，37 °C， 5％C，30min）或放射性核素照射（2000 rad）的方法处理刺激细胞。 3. 96孔板中，每孔加入1x105的刺激细胞和1x105 反应细胞。 37°C，5％CO2，4～6d。加3HTdR， 继续培养18h。阳性对照孔加反应细胞和丝裂原， 不加刺激细胞。阴性对照孔只加照射的自身细胞。 3复本。 4. 收集细胞，液闪仪计数，打印结果。