普通PCR设计引物应遵循以下原则

一设计引物应遵循以下原则

1、 引物长度：15-30bp ，常用为

2、 引物扩增跨度： 以200-500bP

3、 引物碱基：G C 含量以40-60%

异条带。ATGC 最好随机分布，避免 的GC 含量不能相差太大。附加序列 值时不算，但在检测互补和二级结构是要加

上它们

温度和GC 含量是个主要的参数，做复合扩增时更要设计成相近的温度，

响不大。但要切记BLAST ,包括查阅文献的引物.如果两个引物Tm 不同，将退火温度设定 为比最低的Tm 低5 C ,或者为了提高特异性， 可以在根据较高Tm 设计的退火温度先进行 5个循环，然后在根据较低 Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。

4、 避免引物内部出现二级结构， 避免两条引物间互补， 特别是3'端的互补， 物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，

似性较高的序列， 否则容易导致错配。 引物二聚体及发夹结构的能值过高 4.5keal/mol ）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 进行。 5、引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，

应严格要求配对， 以避免因末端碱基 不配对而导致PCR 失败。

6 、引物中有或能加上合适的酶切位点，

被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点, 酶切分析或分子克隆很有好处。引物 5端引入酶切位点得黏性末端，随意加入 基，但是要注意不要形成引物二聚体，而且以 A 或G 开头为好。

7 、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 物

的浓度0.1〜1umol 或10〜100pmol ，以最低引物量产生所需要的结果为好, 偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

8、引物酶切：除非产物非常特异，直接酶切 PCR 产物效果有时不是很好，还有一般 PCR 体系里过量的dNTPs 会影响酶切效果。酶切后，可以用标准得乙醇沉淀法沉淀酶切产物， 获得高纯度得酶切产物，也即是你的黏性目断片断供后边得试验。

9、设计软件： 最好学会使用一种

design software. PP5,Oligo6,DNAstar On li ne desg in et al.

二引物保存

定制引物以干粉形式运输。最好在 TE 重溶引物，使其最终浓度为 100凶。TE 比去离子水

好，因为水的pH 经常偏酸，会引起寡核苷的水解。

引物的稳定性依赖于储存条件。应将 干粉和溶解的引物储存在 -20 C 。以大于10凶 浓度溶于TE 的引物在-20 C 可以稳定保存 6个月，但在室温（15 C 到30 C ）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20 C 保存至少1年, 在室温（15 C 到30 C ）最多可以保存2个月。

三各种PCR 的引物设计

20bp 左右。 为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。

为宜，G C 太少扩增效果不佳， G C 过多易出现非特 5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。上下游引物 （RT site, Promoter sequenee ） 力口至U 5'端, 在算

Tm .引物对的Tm 差异不超过5 C,设计时 否则会形成引

尤其是3 '端相 （超过

PCR 反应不能正常

这对 3个保护性碱 每条引 引物浓度 ,Vector NTI,

1、长距离PCR:

标准PCR的扩增长度在1〜2kb间，不能满足中大型基因的扩增。在此背景下产生了长距

离PCR 。其引物设计原则在标准 PCR 的基础上还要注意一下几点 a 、长度一般在25〜30bp 间；b 、两条引物的解链温度趋向相等是非常重要的。如果两条 引物的解链温度的差异大于 1度，就可能造成错误引导以及一条链的优势扩增等问题。

2、反相PCR :

标准PCR 应用于已知片断的扩增。 而反相PCR 应用于扩增已知片断相邻的未知片断， 主要 应用于a ，产生探针；b ，从总RNA 中克隆未知cDNA 序列；c 、研究病毒序列、转基因和 转座子的整合点位区域的序列。

其引物设计除了要注意在模板分子上的设置方向外，其它同标准原则。

3、差异显示 PCR ( DD-PCR ):

次技术的应用在于显示细胞的全部 mRNA ，通过比较两种细胞或者不同环境中的同种细胞

的cDNA 扩增产物的电泳条带谱来鉴定基因表达图谱的差异。

4、多重PCR:

多重PCR 就是在PCR 中使用一对以上的引物同时扩增目的

DNA 的几个片断，以节省模板、 PCR 引物设计的规则外还要保证反应中所有的

引物有相近的熔解温度， 引物之间不会发生相互作用， 扩增产物大小相近但又能通过电泳分 开。

5、热启动PCR

6、降落PCR

这两种PCR 只是为了满足特别要求, 引物没有什么特殊的要求，按照标准 其引物有两套，一为锚定引物， 列是 5'TTTTTTTTTTTTXY3'其中 X 可以是 随机引物是由15个不同的，长度为10mer 改包含几乎相等的四种单核苷酸， G 与C 构的

倾向。

为随机引物。 12个不同引物组成的库，序 AGC 中的任一个，丫可以是ATGC 中的任一个。 的引物组成。它们的序列都是随机形成的，都应 碱基的平衡分布以及具有低自发形成稳定二级结

锚定引物是由

节约时间和减少费用。引物设计在遵守标准 在标准PCR 的基础上进行了一些方法上的改进，

而对

PCR 的引物设计原则即可。