Western Blot相关试剂配方及详细实验步骤

Western Blot详细实验步骤及试剂配方

1. 溶液配置

1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）

药品用量

1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mL

SDS 0.5 g

BPB（溴酚蓝，有毒）25 mg

甘油 2.5 mL

去离子水up to 5 mL

分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。

1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）

药品用量

Tris 30.3 g

Glycine (甘氨酸) 144.2 g

SDS 10 g

ddH2O up to 1 L

室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。

1.3 Tris-HCl缓冲液

（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶

Tris (MW: 121.14) 45.43 g

H2O up to 250 mL

浓盐酸调PH 8.8

（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶

Tris (MW: 121.14) 30.29 g

H2O up to 250 mL

浓盐酸调PH 6.8

二者高压灭菌后，置于室温保存即可。

1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)

SDS 10 g

ddH2O up to 100 mL

室温保存即可。

1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制

过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g

超纯水up to 1 mL

混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。

1.6 30% 丙烯酰胺溶液

丙烯酰胺 150 g

甲叉双丙烯酰胺 4 g

Milli-Q水 30 mL

滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。

1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)

Tris (MW: 121.14) 30.3 g

Glycine (甘氨酸) 144 g

去离子水 up to 1 L

室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。

1.8 脱色液（蛋白胶考染后脱色）

甲醇 30 mL

冰醋酸 10 mL

ddH2O up to 100 mL

注意：甲醇具有挥发性，对人体的神经系统和血液系统影响最大，它经消化道、呼吸道或皮肤摄入都会产生毒性反应，甲醇蒸气能损害人的呼吸道粘膜和视力，使用过程中最好戴口罩。脱色液常温放置即可。

1.9 考马斯亮蓝染色液（100 mL）

考马斯亮蓝R-250 0.25 g

甲醇 45 mL

ddH2O 45 mL

冰醋酸 10 mL

过滤除去颗粒状物质。

1.10 10×TBS缓冲液

Tris (MW: 121.14) 12.11 g

NaCl 87.66 g

H2O up to 1 L

调PH 7.4~8.0

高压灭菌后，室温保存即可。

1.11 洗脱液(TBS-T)

10×TBS 100 mL

H2O up to 1 L

Tween 20/80 0.5 mL

加了Tween 20/80后的洗脱液，需要置于4℃保存。

1.12 10×PBS缓冲液

NaCl 80 g

Na2HPO4 28.8 g

KH2PO4 2 g

H2O up to 1 L

高压灭菌后，室温保存即可。

1.13 洗脱液(PBS-T)

10×PBS 100 mL

H2O up to 1 L

Tween 20/80 0.5 mL

加了Tween 20/80后的洗脱液，需要置于4℃保存；PBS-T与TBS-T同功。

1.14 封闭液（现配）

脱脂奶粉 5 g

1×T/PBS-T up to 100 mL

混匀后，与4℃可保存一周，若加了防腐剂，一抗可以回收循环使用直到杂不出蛋白为止。

1.15 一抗孵育液（鼠源His抗体为例）

封闭液 15 mL

鼠源His抗体 2 μL

冰上操作，于4℃保存即可，可回收使用。

1.16 二抗孵育液（鼠抗为例）

封闭液 10 mL

鼠抗 2 μL

现配现用，不用回收。

1.17 100 mM PMSF (苯甲基磺酰氟)

PMSF 0.174 g

异丙醇 up to 10 mL

混匀后分装到1.5 mL离心管中，每管1 mL，置于-20℃保存，其工作液一般为1 mM，我们实验室使用的是2 mM的工作液，有剧毒，使用时注意安全，吸入、误服或通过皮肤吸收，都可致命。

2. 实验步骤（原核表达为例）

2.1 菌种培养

将原核表达载体转化BL21感受态细胞，之后涂板（含抗生素的培养基，一般是卡纳或氯霉素），过夜培养后，挑选单克隆到装有2 mL LB培养基（Kan+）的10 mL离心管中，在摇床中（37℃，225 rpm）过夜活化（12 h左右）。

2.2 原核表达菌扩大培养

按1:100的比例稀释（如在装有25 mL抗性LB培养基的50 mL离心管中加入250 μL菌种培养液），在摇床中（37℃，225 rpm）培养2 h。

2.3 OD值测量

提前开好超净工作台的紫外，将扩大培养的菌在超净工作台中吸取1 mL放入1.5 mL的EP管中，待检测，记得吸取无菌的LB培养基去调零。大肠杆菌菌液OD值为0.5~0.6时为对数期最佳，此时的细胞活性最佳。以A732的分光光度计为例，说明OD值测量的详细过程。

（1）开机：实验室的分光光度计有些问题，需要提前40 min打开，第一次打开，程序会卡在检查步骤四，需经过5 min后关掉，再打开，静候35 min。

（2）吸收光设置：按1（光度）→GOTO WL→输入“600”→ENTER→F1 (T% / ABS) →F3（测量屏幕）。

（3）调零：用1 mL移液枪吸取800 μL无菌的LB培养基（空白对照）加入比色皿中（应素平提供，若是全空的比色皿可能需要3 mL），放入测量位置→AUTO ZERO（稍等片刻，听到有跳闸声）→START→测得到LB培养基的OD值为0左右。

（4）菌液OD值测量：在超净工作台中量取1 mL菌液至1.5或2 mL PE管中，然后量取其中的800 μL至比色皿中（菌液换取应倒入固定的锥形瓶中，稍后高压灭菌，使抗生素失活），比色皿放入卡槽，点击START测量其OD值，将OD值调为0.6左右为佳（比如测到OD值为0.45，则再培养10 min继续测，OD 值为0.5~0.6最佳）。

（5）关机：RETURN→MODE→F3（是）→关闭电源，清洗比色皿。