鸡卵类粘蛋白的制备
鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定
鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定摘要：鸡卵类粘蛋白(chicken ovomucoid，简称CHOM)是由鸡卵清中制成的一种糖蛋白，它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用。
采用有机溶剂沉淀法将鸡蛋清经三氯乙酸（TCA）—丙酮溶液处理，除去沉淀物，经丙酮分级沉淀活的粗品，再经过DEAE纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）柱层析纯化而得合格产品，然后用Folin-酚法测定卵类粘蛋白的抑制活力测得纯蛋白的抑制活力大于粗蛋白的抑制活力，最后通过SDS-聚丙烯酰胺凝焦电泳测定蛋白质分子量测得粗蛋白的相对分子量为34311纯蛋白的相对分子量为32924与理论值有一定差距。
关键词：鸡卵类粘蛋白; 胰蛋白酶; 有机溶剂 ;层析; 电泳中图分类号：Q文献标识码：AIsolation and purification of CHOM and its activity 、 molecular weight determinationAbstract:Chicken ovomucoid (CHOM) is a glycoprotein made from chicken egg white, it has a strong role in inhibiting trypsin. Organic solvent precipitation method using egg white by trichloroacetic acid (TCA) - acetone solution was to remove sediment by acetone precipitation of live crude, through the DEAE cellulose (diethylaminoethyl cellulose) column layer Analysis of purified products derived from qualified, then Folin-phenol method ovomucoid inhibited activity, and finally by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis determination of protein molecular weight of coke.Key words:CHOM ;Trypsin ; organic solvent ; chromatogram ; electrophoresis.鸡卵类粘蛋白(chicken ovomucoid 简称CHOM)是由鸡卵清中制成的一种糖蛋白，它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用[1]，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究。
从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白的方法
从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白的方法
1卵类黏蛋白
卵类黏蛋白是一类可以在动物卵液中发现的蛋白质。
它们可以将鸡胚募集到一起，增强鸡蛋的结构稳定性，并提供保护。
一般而言，卵类黏蛋白的结构和特性决定着卵的物理机能性。
2从鸡蛋清中提取卵类黏蛋白
从鸡蛋清中提取卵类黏蛋白的常见方法是复合膜离心法。
根据有机化合物数量不同，可采取不同的柱装置进行构建有机化合物，包括反相层析柱、正相层析柱、活性柱和离子交换柱。
事先采用离心法将鸡蛋清分离出来，得到洁净的蛋清液；然后使用复合膜离心法将卵类黏蛋白从洁净的蛋清中纯化出来。
3复合膜离心法的利用
复合膜离心法可将卵类黏蛋白从洁净的蛋清液中快速分离出来，具有较高的效率和稳定性。
它主要包括两个步骤：沉淀膜分离与浓缩离心分离。
首先，有机溶液中的粒子和蛋白质被沉淀膜分离出来；然后，经过浓缩离心分离，可快速净化出洁净的卵类黏蛋白。
此外，通过可调节的pH值，正确地控制溶液的离子强度，可有效提取卵类黏蛋白。
4结论
从鸡蛋清中提取卵类黏蛋白的最佳方法是采用复合膜离心法，该方法具有较高的效率和稳定性。
通过正确控制pH值和溶液离子强度，还可以有效地提取卵类黏蛋白。
因此，复合膜离心法应该成为从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白的理想方法。
高级生化技术实验
实验一鸡卵类黏蛋白的分离与纯化【目的要求】1、掌握从鸡蛋清中提取鸡卵类黏蛋白的原理及方法。
2、了解凝胶过滤层析、离子交换层析的工作原理，掌握基本操作技术。
3、掌握消光系数法测定蛋白质含量的原理及计算方法。
【实验原理】鸡卵类黏蛋白是由鸡蛋清中提取的一种糖蛋白，可强烈地抑制胰蛋白酶，常用于胰蛋白酶学性质的研究，也可将其制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效的分离与纯化胰蛋白酶。
鸡卵类黏蛋白在中性或酸性溶液中对热及高浓度的脲、有机溶剂都相当稳定，而在碱性溶液中不稳定，尤其是当温度较高时会迅速失活。
它在10%三氯乙酸或50%丙酮溶液中有较好的溶解度。
选择合适的pH值及适当浓度的三氯乙酸或丙酮，可以从蛋清中除去大量的非卵类黏蛋白，或得鸡卵类黏蛋白的粗提液。
含盐或其他小分子的蛋白质混合溶液，在经过凝胶层析柱时，大分子蛋白质不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙以较快的速速最先流出柱外，而相对分子量较低的盐或其他小分子物质则可以进入凝胶内部的微孔中，所以向下移动的速度较慢而最后流出柱外。
这样鸡卵类黏蛋白粗提液经过凝胶柱层析后可以除去小分子物质（盐）而得到初步纯化。
初步纯化的鸡卵类黏蛋白，经过DEAE-纤维素离子交换柱进一步纯化，可除去少量的杂蛋白，得到鸡卵类黏蛋白的纯溶液。
本实验先将鸡蛋清先用三氯乙酸溶液处理，离心后去除沉淀物，然后由丙酮分级沉淀获得粗品，经SephadexG-25柱层析脱盐，DEAE-纤维素离子交换柱层析纯化，再经透析及丙酮沉淀进一步纯化，最后真空干燥可得到鸡卵类黏蛋白合格产品。
鸡卵类黏蛋白在280nm处得消光系数A 1%1cm=4.13，即蛋白质浓度为1mg/mL时溶液的吸光度A280=0.413,据此可以测定鸡卵类黏蛋白的含量。
【试剂与器材】1、试剂（1）丙酮（2）新鲜鸡蛋（3）0.5mol/L HCL溶液（4）Sephadex G-25 (5) DEAE-纤维素粉（6）10% pH 1.15三氯乙酸（TCA）：将称取的三氯乙酸置烧杯中，加入2/3体积的蒸馏水溶解，用6mol/L的NaOH调至约pH 1.15，静置约1h，然后在pH计上校正至pH 1.15，最后补充水到所配体积。
鸡卵粘蛋白实验报告
一、实验目的1. 了解鸡卵粘蛋白的提取方法；2. 掌握鸡卵粘蛋白的鉴定方法；3. 熟悉糖蛋白的性质和特点。
二、实验原理鸡卵粘蛋白是一种糖蛋白，具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究和胰蛋白酶的亲和层析纯化制备。
本实验通过提取鸡卵粘蛋白，观察其物理性质和化学性质，从而了解鸡卵粘蛋白的组成和特性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜鸡蛋、蒸馏水、NaCl、TCA、丙酮、铅盐溶液、pH试纸等；2. 实验仪器：离心机、移液器、烧杯、试管、显微镜、电泳仪、凝胶成像系统等。
四、实验方法1. 鸡卵粘蛋白的提取（1）将新鲜鸡蛋打入烧杯中，加入适量的蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀；（2）将混合液用离心机离心，取上清液；（3）向离心后的上清液中加入适量的NaCl，观察蛋白质的沉淀情况；（4）将沉淀物用蒸馏水洗涤，直至洗涤液无色；（5）将洗涤后的沉淀物用丙酮溶液溶解，得到鸡卵粘蛋白溶液。
2. 鸡卵粘蛋白的鉴定（1）观察鸡卵粘蛋白溶液的颜色、透明度等物理性质；（2）用pH试纸测定鸡卵粘蛋白溶液的pH值；（3）将鸡卵粘蛋白溶液与铅盐溶液混合，观察蛋白质的变性情况；（4）用电泳法检测鸡卵粘蛋白的分子量；（5）观察鸡卵粘蛋白在不同pH值溶液中的稳定性。
五、实验结果与分析1. 鸡卵粘蛋白溶液为淡黄色，透明度较高；2. pH值为3.9-4.5，说明鸡卵粘蛋白在酸性条件下稳定；3. 与铅盐溶液混合后，蛋白质发生变性，出现白色沉淀；4. 电泳结果显示，鸡卵粘蛋白的分子量为28000Da；5. 在pH值为3.0的溶液中，鸡卵粘蛋白稳定；在pH值为8.0的溶液中，鸡卵粘蛋白容易分解。
六、实验结论1. 成功提取了鸡卵粘蛋白，并对其进行了鉴定；2. 鸡卵粘蛋白是一种糖蛋白，具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用；3. 鸡卵粘蛋白在酸性条件下稳定，在碱性条件下容易分解；4. 本实验为鸡卵粘蛋白的研究提供了实验依据。
七、实验注意事项1. 实验过程中，注意无菌操作，避免污染；2. 使用移液器时，注意准确计量，避免误差；3. 实验过程中，注意观察现象，做好记录；4. 实验结束后，妥善处理废弃物，保持实验室环境卫生。
鸡蛋中卵类粘蛋白的研究进展
甚至运用淀粉凝胶电泳法分离得到了卵类粘蛋白，
但此法由于造价较高，而无法得到推广使用。１９７５ 年，Ｗａｈｅｅｄ和Ｓａｌａｈｕｄｄｉｎｔｌ４１运用盐沉淀和离子交换
健科技公司进行了一项研究，他们针对９６种亚洲人最常 吃的食物，在６３３名年龄介于８个月至８８岁的普通人群
层析相结合的方法制得了纯度较高的卵类粘蛋白。
ｍａｍｅｉｈｕｈｎ＠ｙａｈｏｏ．ＣＯＩｎ．∞
．卵类粘蛋白是一种糖蛋白，包含２０％～２５％的糖基
组分，这些糖基组分在卵类粘蛋白的胰蛋白酶抑制活性 和过敏原性中发挥着重要作用ｐ’５】。Ｂａｙａｒｄ和Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌ［６１
２．２成熟的卵类粘蛋白的分离纯化技术 现在，成熟的卵类粘蛋白的分离纯化技术已被 人们广泛使用。其流程如下：卵类粘蛋白的抽提（活
ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎ ｏｖｏｍｕｅｏｉｄ ａｆｔｅｒ ｌｏｏｋｉｎｇ ｕｐ ｌｏｔｓ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌｓ
ａｂｏｕｔｏｖｏｍｕｃｏｉｄ ｆｉ＇ｏｍ
ｈｏｍｅ ａｎｄ ａｂｒｏａｄ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｅｇｇ；ｐｒｏｔｅｉｎ；ｏｖｏｍｕｅｏｉｄ；ａｌｌｅｒｇｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ
内二硫键连接。
作者简介：史晓霞，女，山西朔州，主要从事蛋清蛋白质方面的研究。武汉华中农业大学食品科技学院，４３００７０，Ｅｍａｉｈ ５２４９９５３４２０＠ｑｑ．ｃｏｒｎ．
’通讯作者：马美湖（１９５７～），男，湖南常德，博士生导师，主要从事肉类蛋品方面的教学和研究。武汉华中农业大学食品
科技学院，４３００７０，Ｅｍａｉｈ
计，在食物过敏儿童中，大约３５％的儿童对鸡蛋过敏，
其中一岁前的幼儿更为常见１１９－２０１。 ４．１．１鸡蛋过敏的发病机制 鸡蛋过敏是一种免疫性疾病，其发病机制较为复杂，
实验一鸡卵类粘蛋白的分离与纯化(共23张PPT)
鸡卵类黏蛋白纯品的制备
【操作步骤】
1)量取已处理的DEAE-纤维素50 mL，用60 mL pH 6.5 磷酸盐缓冲液浸泡约15mim，脱气。
2）装柱 将脱气后的DEAE-纤维素装入柱内。用pH 6.5 磷酸盐缓冲液平衡，流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定 的基线即可加样。
鸡卵类黏蛋白纯品的制备
2）装柱 将柱子垂直地安装好，关闭层析柱出水口，
将脱气后的凝胶缓缓地倒进柱内，使之自然沉降。
凝胶层析对鸡卵类黏蛋白提取液的纯化
3）平衡 打开核酸蛋白检测仪、记录仪电源，将柱出
水口与核酸蛋白检测仪比色池进液口相连，开启柱口下夹 子，用约2倍体积的pH6.5磷酸盐缓冲液平衡。直至流出液 在蛋白检测仪上绘出稳定的基线。
8)倾去上清，浑浊液转到离心管内，于 3500r/min 离 心10min , 沉淀抽真空干燥，即可得到透明胶状物－鸡 卵类粘蛋白。
实验结果与数据处理
1)鸡卵类粘蛋白（mg/mL）= —A—280—×稀—释—倍—数— 2)鸡卵类粘蛋白的产率（mg/mL）=100mL鸡蛋清得 到鸡卵粘蛋白的mg数。
鸡卵类黏蛋白的提取
2) 4h后, 3000r/min离心10min 。收集上清液，再 用滤纸过滤，除去上清液中脂类物质及其它不溶物。
滤液量体积，转入500 mL烧杯内，缓慢加入3倍体积冷 丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，置冰箱放置2h。
鸡卵类黏蛋白的提取
3)小心虹吸出部分上清液，剩余部分全部转移到离心管
里，经平衡后以3500r/min 离心10min，弃清液，沉淀 初步提取得到的鸡卵类粘蛋白，经DEAE-纤维素离子交换柱进一步纯化，可除去少量的杂蛋白。
凝胶层析对鸡卵类黏蛋白提取液的纯化 1）凝胶的处理 量取100mL Sephadex G-25凝胶，加入200mL磷酸盐缓冲液，沸水浴中1h。 选择性沉淀法从鸡蛋清中提取鸡卵类黏蛋白；
实验一鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定
实验一鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定一、实验目的：通过本实验的学习，掌握蛋白质的提取、分离、纯化及性质测定技术，掌握高速冷冻离心机、可见分光光度计、核酸蛋白检测仪、电泳仪等仪器的使用。
二、基本原理：鸡卵类粘蛋白(chicken ovomucoid简称CHOM)是由鸡卵清中制成的一种糖蛋白，它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究。
也可将其制成吸附亲合剂，通过亲和层析技术有效的分离和纯化胰蛋白酶。
鸡卵类粘蛋白至今还未能获得单一组分的制品，在电泳行为上常呈不均一性。
目前至少已获得四种不同的组分，它们在抑制胰蛋白酶的性能上和氨基酸组成上没有多大区别，但是在糖蛋白的糖部分（主要为D-甘露糖、D-半乳糖、葡萄糖胺和唾液酸）的含量上则有差别。
它们的等电点有一定的范围，大致在pH3.9~4.5。
相对分子量28，000。
卵类粘蛋白抑制胰蛋白酶克分子比为1：1，因此高纯度的卵类粘蛋白1微克能抑制相当于0.86微克的胰蛋白酶（比活力为12，000BAEE单位/毫克蛋白）。
不同来源的卵类蛋白末端基有很大差异，鸡卵类粘蛋白N—末端基为丙氨酸（C—末端为苯丙氨酸）。
卵类粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度较高时易迅速失活。
鸡卵类粘蛋白除对牛和猪的胰蛋白酶有强烈的抑制作用外，对枯草杆菌蛋白酶也有一定的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，另外对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。
本实验主要参照Kassell所述的方法，先将鸡蛋清经三氯乙酸（TCA）—丙酮溶液处理，除去沉淀物，然后经丙酮分级沉淀获得粗品，在经过DEAE纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）柱层析纯化而得合格产品。
三、试剂与器材3.1粗提所需试剂：丙酮，0.5M三氯乙酸，0.2M pH6.5磷酸盐缓冲液；3.2 纯化所需试剂：0.02M pH6.5磷酸缓冲液，；DEAE-纤维素32或52，0.5M氯化钠-0.5M氢氧化钠溶液，0.5M盐酸，0.02M，pH6.5磷酸盐缓冲液,0.30M氯化钠-0.02M pH6.5磷酸盐缓冲液，1.0 M氯化钠-0.02M pH6.5磷酸盐缓冲液，聚乙二醇8000，蔗糖。
鸡卵类粘蛋白提取教学内容
鸡卵类粘蛋白提取鸡卵类粘蛋白提取摘要：本实验利用蛋白质在等电点处会沉淀和丙酮分级沉淀的特征，对样品进行粗处理。
在对处理过的样品进行细分离，其方法是凝胶过滤。
最后通过SDS —PAGE电泳对粗样品进行细分离和对样品的分子量进行分析。
有实验可得鸡卵类粘蛋白的分子质量为32187Da。
关键词：鸡卵类粘蛋白，凝胶过滤，SDS—PAGE第一章前言1.1鸡卵类粘蛋白的介绍鸡卵类粘蛋白是由鸡卵清中制得的一种糖蛋白，它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用，常用与胰蛋白酶的酶学性质的研究。
也可将其制成吸附亲合剂，通过亲和层析技术有效分离与纯化胰蛋白酶。
鸡卵类粘蛋白是至今还未能获得单一组分的制品，在电泳行为上常呈现不均一性。
目前至少已经获得4种不同组分，它们在抑制胰蛋白酶的性质上和氨基酸的组成上没有多大区别，但是在糖蛋白的糖蛋白部分（主要是D-甘露糖，D-半乳糖，D-葡萄糖胺和唾液酸）的含量上有差别。
它们的等电点有一定的范围，是在pH3.9-4.5。
相对分子量28000。
鸡卵类粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高溶度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度比较高时迅速失活。
鸡卵类粘蛋白除对猪和牛的胰蛋白酶有强烈的抑制作用外，对枯草杆菌蛋白酶也有一定程度上的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，另外对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。
1.2对样品前处理的原理先由鸡蛋清经三氯乙酸（TCA）-丙酮溶液处理，除去沉淀物，然后经丙酮分级沉淀获得粗品，经分离从而获得粗品。
1.3凝胶过滤的原理凝胶过滤也称为排阻层析，分子筛层析和凝胶层析。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，其内部具有许多细微的多孔网状结构。
凝胶层析的机理是分子筛效应，当凝胶颗粒在合适的溶剂中浸泡，充分吸液膨胀，然后转入到层析柱内，加入欲分离的混合物，再以同一洗脱液洗脱。
在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而在凝胶颗粒的空隙最先流出柱外，而小分子物质可以进入凝胶颗粒的内部的多孔网状结构，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质按照顺序分离开。
鸡卵粘蛋白的提取及猪胰蛋白酶的分离纯化
鸡卵粘蛋⽩的提取及猪胰蛋⽩酶的分离纯化鸡卵粘蛋⽩的提取及猪胰蛋⽩酶的分离纯化摘要：鸡卵类粘蛋⽩是由鸡卵清中制得的⼀种糖蛋⽩，具有强烈的抑制胰蛋⽩酶的作⽤，常⽤于胰蛋⽩酶的酶学性质的研究和胰蛋⽩酶的亲和层析纯化制备。
胰蛋⽩酶Trypsin (Parenzyme) 为蛋⽩酶的⼀种，EC3.4.21.4。
在脊椎动物中，作为消化酶⽽起作⽤，⽽且还能限制分解糜蛋⽩酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作⽤。
本实验以鸡蛋清为原料，提取猪胰蛋⽩酶的天然抑制剂鸡卵粘蛋⽩，并以此为配基，偶联到琼脂糖凝胶上，制成鸡卵粘蛋⽩的亲和吸附剂，然后通过亲和层析直接从猪胰脏的粗提液中纯化猪胰蛋⽩酶。
并设计了酶活性测定以对纯化过程进⾏监测和对纯化效果进⾏评价；设计了电泳实验对制备的猪胰蛋⽩酶进⾏纯度和分⼦量的测定。
关键词：鸡卵粘蛋⽩；胰蛋⽩酶；亲和层析；分离纯化；酶活性。
鸡卵粘蛋⽩（chicken ovomucoid简称CHOM）是鸡蛋清中的⼀种糖蛋⽩，⾄今还未能获得单⼀组分，在电泳⾏为上常呈现不均⼀性。
不同来源的卵类蛋⽩末端基有很⼤差别，鸡卵类蛋⽩N-末端基为丙氨酸。
卵类粘蛋⽩在中性活酸性溶液中对热和⾼浓度的脲是相当稳定的，⽽在碱性溶液中⽐较不稳定，尤其温度较⾼是易迅速失活，在50%丙酮或10%三氯⼄酸溶液中仍有较好的溶解度。
它们的等电点有⼀定的范围，⼤致在3.9—4.5之间。
鸡卵粘蛋⽩除对⽜和猪的胰蛋⽩酶有强烈的抑制作⽤外，对枯草杆菌蛋⽩酶也有⼀定的抑制作⽤，但对胰凝乳蛋⽩酶⽆抑制作⽤，对⼈的胰蛋⽩酶也⽆明显抑制作⽤，因此常⽤于胰蛋⽩酶酶学性质的研究。
在pH7.8～8.0碱性条件下，CHOM可可逆性的结合胰蛋⽩酶，以CHOM为配基制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术对胰蛋⽩酶进⾏分离纯化。
1材料与⽅法1.1材料与试剂市售鲜鸡蛋，10%TCA，1mol/L NaOH ，5mol/L NaOH ，1mol/L HCl，5mol/L HCl，丙酮（A.R），葡聚糖凝胶G-25（SephadexG-25)，0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液，DEAE-52离⼦交换纤维素，离⼦交换剂（0.5mol/L HCl ，0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl ），洗脱液（0.3mol/L NaCl—0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液）,透析袋（φ2.7cm）,标准胰蛋⽩酶溶液（1mg/ml），0.05mol/L PH7. 8 Tris- HCl缓冲液，BAEE底物缓冲溶液（0.05mol/L CaCl2- 0.05mol/L PH8.0 Tris- HCl缓冲液），1mmol/L BAEE底物溶液，Sepharose 4B，0.5mol/L NaCl，2mol/L NaOH，0.2mol/L PH9.5碳酸钠缓冲液，56%1，4-⼆氧六环（V/V），环氧氯丙烷（A.R），亲和柱平衡液（0.5mol/L KCl，0.05mol/L CaCl2—0.1mol/L, Tris—HCl PH7.8缓冲液），亲和柱洗脱液（0.5mol/L KCl—0.1mol/L PH2.5甲酸溶液），，⽆⽔氯化钙，亲和柱平衡液新鲜猪胰脏，PH2.5-3.0⼄酸酸化⽔，2.5mol/L H2S04（ 0.5mol/L KCl，0.05mol/L CaCl2—0.1mol/L, Tris—HCl PH7.8缓冲液），亲和柱洗脱液：（0.5mol/L KCl— 0.1mol/LPH2.5甲酸溶液）等。
实验五 鸡蛋清中卵类粘蛋白分离纯化及活性测定
实验五鸡蛋清中卵类粘蛋白分离纯化及活性测定一、实验目的和要求1）设计从鸡蛋清中分离纯化卵类粘蛋白的试验方案。
2）设计从鸡蛋清中分离纯化卵类粘蛋白的试验操作条件。
3）了解离子交换层析系统中四大组成部分和实验主要影响因素。
4）掌握熟离子交换层析层析仪的使用方法和注意事项。
5）学会凝胶预处理和装柱、平衡、洗脱的方法。
二、器材和试剂1．实验器材：层析系统LH-2，（包括自动部分收集器，紫外检测仪，记录仪，蠕动泵，梯度混合器）6套；高速离心机；布氏漏斗；烧杯500ml,100ml，各16个；移液管1、2、5ml, 各16个；量筒50ml,100ml，各16个；真空干燥器 4个；滴管， 16个；滤纸φ120， 1盒；2．实验试剂：(1)丙酮；(2)1％，pHl.15的三氯乙酸：将称取的三氯乙酸置烧杯内，加入2／3总体积的蒸馏水溶解，用6mol／L氯氧化钠调至约pHl.15，静置约1h，然后在pH计上校正至pH 1.15，最后补充水到所配体积；(3)0.02 mol／L,pH6.5，磷酸盐缓冲液；(4)0.5mol／L 氯化钠—0.5mol／L氢氧化钠溶液；(5)0．5mol／L盐酸溶液；(6)0.3mol/L氯化钠—0.02mol ／L磷酸盐缓冲液，pH6.5；(7)底物缓冲液：0.05mol／L，Tris-HCl缓冲液，pH8.0，内含2.22mol／L的氯化钙；(8)2mmol／1,BAEE底物：用底物缓冲液配制；(9)lmg／mL胰蛋白酶溶液：用0.001 mol／L盐酸配制；(10)DEAE-纤维素粉(DE-32)；(11)SphadexG-25；（12）鸡蛋 30个；（13）1％硝酸银三、实验原理1．蛋清中蛋白质结构组成为：卵清蛋白、卵转铁蛋白、卵类粘蛋白、卵粘蛋白、溶菌酶、G2、G3球蛋白、卵抑制素、卵糖蛋白、黄素蛋白、卵巨球蛋白、蛋白抑制剂、抗生物素蛋白。
2．鸡卵类粘蛋白(chickenovomucoid，CHOM)的性质:鸡卵类黏蛋白(chickenovomucoid，CHOM)是由鸡卵清中制得的一种糖蛋白，可强烈地抑制胰蛋白酶，对枯草芽孢杆菌蛋白酶也有一定程度的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。
生物化学技术实验
CHOM的理化性质
（分离纯化的依据）
CHOM在中性及偏酸性溶液中对热及 高浓度的脲、有机溶剂有较高的耐受性，在 碱性条件下易变性，在50%的丙酮或者10%
三氯醋酸溶液中仍然有较好的溶解度。
因此选择合适的pH值、丙酮或三氯醋 酸的浓度，可以从鸡蛋清中除去大量的非卵 类粘蛋白，从而获得较纯的CHOM。
N项注意
! 做明白人，干明白事。先动脑，再动手。 ！实验无小事，事事不马虎。 ! 实验结果和数据及时保存及处理 ! 保持实验室整洁 。。。。。
需要得到的结果
*胰蛋白酶标准品的比活力（BAEE单位/mg蛋白） *鸡卵类粘蛋白粗品和纯品的抑制比活力（BAEE单位/mg蛋白） *胰蛋白酶粗提液及纯品的比活力（BAEE单位/mg蛋白）
聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-Gel P ，） 琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-Gel A）
支持物的选择：
（三） 根据电荷性质的差异分离
1、电泳和等电聚焦法：
普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、 毛细管电泳
支持物： PAGE 、琼脂糖胶等
Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)
■ 亲和层析作用机理：
(1) X
B A
Sample
(2)
Washing
A
B
配体 X
(3)
Elution
A
B
亲和吸附剂的制备
• 分离纯化一定数量的游离配体 • 载体活化 • 配体与载体偶联
（五）HPLC（high performance/pressure liquid chromatography)
胰蛋白酶的BAEE单位定义为： 在下列实验条件下，引起每分钟光吸收值 A253nm增加0.001的酶量。
鸡卵类粘蛋白实验论文
鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子质量的测定摘要：目的分离纯化鸡卵类粘蛋白并测定其浓度、相对分子质量以及其对胰蛋白酶的抑制活性。
方法先用三氯乙酸—丙酮溶液沉淀鸡蛋清中的杂蛋白，再经离心、丙酮分级沉淀以及透析得到粗品，经过DEAE 纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）对其进行纯化；考马斯亮蓝法测定粗品和纯品的蛋白浓度，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯度及测定相对分子质量；最后用紫外分光光度法测定鸡卵类粘蛋白的活性。
结果提取到的粗品体积为6.2mL,纯化后得到纯品体积为5.8mL,计算得粗品浓度为15.233mg/mL，纯品浓度为1.636mg/mL，粗品比活力为2625.867U/mg，纯品比活力为4482.383U/mg，纯化倍数为1.707，粗品相对分子质量约为25kD，纯品相对分子质量约为36kD。
结论实验结果证明该实验中所用方法均为较为简便的方法且结果较好。
关键词：鸡卵类粘蛋白纯化胰蛋白酶分子量SDS-PAGEIsolation and purification of CHOM its activity、molecular weightdeterminationAbstract: Objective To purify chicken ovomucoid from egg white and determine its concentration and molecular weight and activity. Methods Firstly, CHOM was separated by TCA-acetone, Secondly, crude CHOM was obtained by acetone fractional precipitation, Thirdly, CHOM was purified through DEAE-cellulose column chromatography, Then, the molecular weight of CHOM was determined by SDS-PAGE, and the activity of CHOM was measured by Lowry method. Result to extract the volume of the crude product is 6.2mL, the volume of the pure product is 5.8mL, the concentration of the crude product is 15.233mg/mL, the concentration of the pure product is 1.636mg/mL, the specific activity of the crude product is 2625.867U/mg, the specific activity of the pure product is 4482.383U/mg, the purification fold is 1.707.The molecular weight of crude product is 25kD, The molecular weight of pure product is 36kD.Conclusion experimental methods described is a more simple and convenient method for purification of CHOM.Key words: CHOM Purification Trypsin molecular weight SDS-PAGE鸡卵类黏蛋白（ Chicken Ovomucoid, CHOM）是从鸡卵清中分离的糖蛋白，具有强烈抑制胰蛋白酶的的作用，是典型的胰蛋白酶抑制剂，常用于胰蛋白酶及类胰蛋白酶的酶学性质研究。
卵粘蛋白分离实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习卵粘蛋白的提取方法。
2. 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离卵粘蛋白。
3. 分析卵粘蛋白的分子量和纯度。
二、实验原理卵粘蛋白是鸟类蛋壳膜中的一种主要蛋白，具有高度的生物学活性。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是一种常用的分离蛋白质的方法，其原理是基于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率与其分子量成正比。
三、实验材料1. 实验动物：鸡2. 主要试剂：聚丙烯酰胺凝胶、十二烷基硫酸钠（SDS）、考马斯亮蓝G-250、Tris-HCl缓冲液、甘油、甲醇等3. 仪器：电泳仪、凝胶成像系统、显微镜等四、实验方法1. 卵粘蛋白提取（1）取新鲜鸡蛋，去壳取卵白。
（2）加入适量的Tris-HCl缓冲液，用玻璃棒搅拌，使卵白充分溶解。
（3）加入适量的SDS和β-巯基乙醇，搅拌混匀。
（4）加入适量的甘油，搅拌均匀。
（5）加入适量的甲醇，搅拌均匀。
（6）超声处理，使卵粘蛋白充分溶解。
2. 凝胶制备（1）配制聚丙烯酰胺凝胶，加入适量的SDS、甘油、β-巯基乙醇等试剂。
（2）将凝胶灌入模具中，插入梳子，静置凝固。
（3）取出梳子，将凝胶放入电泳槽中。
3. 电泳（1）将提取的卵粘蛋白样品加入样品缓冲液，煮沸变性。
（2）将样品加到凝胶孔中，加入适量的电极缓冲液。
（3）接通电源，进行电泳。
（4）电泳结束后，关闭电源，取出凝胶。
4. 染色与观察（1）将凝胶放入考马斯亮蓝G-250染液中，染色30min。
（2）取出凝胶，用水冲洗，直至背景色消失。
（3）观察凝胶，记录卵粘蛋白的迁移位置和条带。
五、实验结果与分析1. 卵粘蛋白提取通过实验，成功提取了卵粘蛋白，样品呈现淡黄色，表明卵粘蛋白在溶液中充分溶解。
2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳结果显示，卵粘蛋白在凝胶中形成了明显的条带，表明卵粘蛋白分子量较小，易于分离。
3. 卵粘蛋白分子量分析根据凝胶中卵粘蛋白条带的迁移位置，结合标准蛋白分子量对照，可计算出卵粘蛋白的分子量约为50kDa。
鸡卵类粘蛋白的制备及活力测定
（二）凝胶过滤（分子筛层析）的基本原理
（三）离子交换层析的基本原理
（四）活力测定原理
鸡卵类粘蛋白具有强烈的抑制胰蛋白酶 的作用；胰蛋白酶能水解酯键、酰胺键 和肽键，利用这一性质用人工合成的底 物或天然的蛋白质可以测定胰蛋白酶的 活力，由此可计算卵类粘蛋白的活力。
三、实验流程
卵类粘蛋白的抽提（活力测定）→分子筛 层析（凝胶预处理→装柱→平衡→上样→ 洗脱→收集蛋白峰→活力测定）→离子交 换层析（活力测定）→透析→丙酮沉淀→ 离心(活力测定)
鸡卵类粘蛋白的制备及活力测定
一、实取卵类粘蛋白的方法 了解凝胶层析法的工作原理，掌握其基 本操作技术 掌握离子交换纤维素柱层析的基本操作 技术 掌握测定鸡卵类粘蛋白活力的方法
二、实验原理
（一）鸡卵类粘蛋白的特性 1.糖蛋白 2.在中性及偏酸性溶液中对热及高浓度的 脲、有机溶剂都有较高耐受性；碱性溶液 不稳定 3.在50%丙酮或10%三氯乙酸溶液中仍有较 好的溶解度
四、操作方法
参见实验讲义
五、思考题
1.利用凝胶层析法分离混合样品时，怎 样才能得到较好的分离效果？
2.通过本实验，指出酶活力测定对于酶 的分离提纯有何意义？
鸡卵粘蛋白活性的测定
1.1环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基的偶联
↓活化
↓偶联
↓亲和结合
↓洗脱
1.2溴化氰活化载体 与蛋白质配基的偶联
2亲和介质合成 2.1琼脂糖凝胶层析介质(Sepharose 4B)的活化 2.1.1 琼脂糖凝胶层析介质的处理
称取10克琼脂糖凝胶层析介质，置于G-3玻璃烧结漏斗内， 用100ml 1.0mol/L NaCl溶液抽洗（少量多次），100ml 蒸 馏水抽洗，抽干后转移到100ml三角瓶中备用。
停止偶联。
2.3洗涤
取一个洗净的500ml抽滤瓶，将已经偶联好的琼脂糖凝
胶层析介质转移到G-3玻璃烧结漏斗内抽滤，收集滤液，
测定滤液中剩余的鸡卵粘蛋白的含量。
用100ml 1.0mol/L NaCl溶液抽洗，100ml 蒸馏水抽洗，再
用20ml 亲和层析洗脱液洗涤。
将亲和介质转移到50ml的小烧杯内，加入20ml 亲和层析
6时间安排
星期 上午（8：00-12：00） 讲实验，配试剂 下午（12：00-6：00） 提取鸡卵粘蛋白，装 DEAE 和 G25 柱，处理各 柱 上G25柱脱盐，收集第一 峰，上DEAE柱分离，收 集第二峰，对蒸馏水透 析过夜。 继续测定标准酶活性和 抑制活性，离心，收集 沉淀物4℃干燥。 结束实验 晚上
平衡液，浸泡20分钟，脱气，装柱。
3胰蛋白酶粗提液的制备 3.1胰蛋白酶的基本性质 3.1.1存在形式：胰蛋白酶通常是以胰酶原的形式存在于动
物的胰脏或其他组织中。在底物的诱导下或激活剂的作用
下，酶原的C端水解，去6肽转变成具有活性的胰蛋白酶。 -6肽
胰蛋白酶原
Ca+2 激活剂
胰蛋白酶
3.1.2等电点与分子量： 胰蛋白酶原的 pI=10.8 ， 胰蛋白酶的 pI=8.9 ， 分子量：24000Da 分子量：23700Da
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综合实验报告书
（2014~2015 学年）
实验题目鸡类卵粘蛋白的制备
学院名称生物与食品工程学院
专业（班级）生物工程11-2班
姓名（学号）胡肖希20115971
起讫日期2014年6月23日—2014年6月27日
指导教师罗水忠
2014年7月1日
鸡类卵粘蛋白的制备
生物工程11-2班学号：20115971 姓名：胡肖希
同组人员：孙禹
摘要：参照Kassell的方法进行了鸡卵类粘蛋白的提取与制备，并使用核酸蛋白检测仪及紫外分光光度计检验了产物的纯度。
实验结束后从鸡蛋中获得了鸡卵类粘蛋白。
关键字：鸡卵类粘蛋白；Kassell法
鸡卵类粘蛋白（chicken ovomucoid，简称CHOM）是由鸡卵清中制得的一种糖蛋白，它具有抑制胰蛋白酶的作用，常用语胰蛋白酶的酶学性质的研究，也可将其制成吸附亲和剂，通过亲和层析技术有效地分离与纯化胰蛋白酶。
鸡卵类粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度较高时迅速识货，鸡卵类粘蛋白除对牛和猪的胰蛋白酶有强烈的抑制作用外，对枯草杆菌蛋白酶也有一定程度的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无以至作用买另外对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。
本实验主要参照Kassell的方法，先由鸡蛋清经三氯乙酸（TCA）-丙酮溶液处理，除去沉淀，然后经丙酮分级沉淀获得粗品，再经DEAE-纤维柱层析纯化而获得合格产品。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与器材
1.1.1 主要试剂
丙酮，10% pH1.15的三氯乙酸，0.02mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液，
0.5mol/L氯化钠- 0.5mol/L氢氧化钠溶液，0.5mol/L盐酸溶液，
0.3mol/L氯化钠-0.02mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液，
底物缓冲液：0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液（内含2.22mg/mL的氯化钙），2mmol/L BAEE底物：用底物缓冲液配制，DEAE-纤维素粉（DE-32），
1mg/ml胰蛋白酶溶液：用底物缓冲液配制，Sephadex G-25
1.1.2 器材
新鲜鸡蛋，pH计，布氏漏斗及抽滤瓶，透析袋，层析柱（35m m×200mm,35mm
×300mm各1支），紫外分光光度计，核酸蛋白质检测仪，离心机，真空干燥器1.2鸡卵类粘蛋白的提取
取50ml鸡卵清，加入等体积的10%pH1.15三氯乙酸溶液，在酸度计上检查pH值，用5mol/L氢氧化钠或5mol/L盐酸将pH调到pH3.5±0.2范围内，在室温下静置4小时以上。
待卵清清蛋白完全沉淀后，以3000r/min 离心10分钟。
弃去沉淀物并过滤上清液，收集滤液转移到一个500mL烧杯内，将pH调回pH3.5。
放置冰浴或冰箱内冷却片刻，缓慢加入3陪体积预冷的丙酮。
用玻璃棒轻轻搅匀，封严，在冰浴里放置2到4小时左右，待鸡卵类蛋白完全沉淀后，小心虹吸出一部分上清液，剩余的部分全部转移到50mL带盖的离心杯内，盖上盖经平衡后以3000r/min离心15分钟，除去上清，离心杯底部的沉淀物放在真空干燥器内，抽气出去残留丙酮。
待沉淀物由白色转变为透明粘稠物后停止抽气。
加入20mL蒸馏水溶解，有不溶物则用滤纸滤去。
滤液经Sephadex G-25柱层析法脱盐或者经透析除盐。
本实验采用Sephadex G-25柱层析法脱盐，操作如下：称取30g Sephadex G-25，用500mL0.02mol/L，pH6.5的磷酸盐缓冲夜在100℃热溶胀2小时或者室温下溶胀24小时。
脱气后装柱（35mm×300mm），柱床体积约150mL。
用约2倍体积的0.02mol/L,pH6.5的磷酸盐缓冲夜平衡。
流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定放入基线或经紫外分光光度计测定光吸收，其A280小于0.02即可使用.
取20mL鸡卵类粘蛋白提取液上柱，用同样的缓冲液洗脱，收集第一峰，在蛋白峰完全流出后盐才开始流出，盐通常在280nm无明显光吸收，若绘出第二峰则是残留丙酮峰。
丙酮和盐同时流出。
1.3鸡卵类蛋白的纯化
通过上述方法获得的鸡卵类蛋白仍含有少量的卵清清蛋白。
采用DEAE-纤维素离子交换层析可以将二者分开，从而达到分离纯化的目的。
称取10gDEAE-纤维素粉（E-32），以150mol/L氯化钠溶液浸泡分钟。
转移到布氏漏斗内抽滤。
用蒸馏水洗至pH8.0左右，抽干。
然后移至一个500mL的烧杯内，用
150mL0.5mol/L盐酸溶液浸泡20分钟，在转移到布氏漏斗内抽滤，用蒸馏水洗至pH6.0左右，最后转移到烧杯内，用150mL0.2mol/L，pH6.5磷酸盐缓冲液浸
泡约15分钟，经真空干燥器脱气后装柱。
取一支层析柱装入约1/4体积的0.02 mol/L，pH6.5磷酸盐缓冲液，将处理过的DEAE-纤维素装入柱内。
以同一缓冲液平衡，流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线或经紫外分光光度计测定光吸收，待A280nm值小于0.02即可。
将经Sephadex G-25脱盐后的鸡卵类粘蛋白溶液上柱吸附。
以0.02 mol/L，pH6.5磷酸盐缓冲液平衡，待流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线后，改用0.3 mol/L氯化钠-0.02 mol/LpH6.5的磷酸缓冲夜洗脱，收集第二洗脱峰。
在鸡卵清清蛋白量很少时，可根据峰形大小，测定活性来确定鸡卵类粘蛋白洗脱峰的位置。
1.4鸡卵类粘蛋白纯品的制备
经DEAE-纤维素离子交换柱层析制得的鸡卵类粘蛋白溶液装入透析袋内，对蒸馏水进行透析，间隔一段时间更换一次蒸馏水，直至经1%硝酸银检查五氯离子为止。
将透析过的鸡卵类粘蛋白溶液转移到烧杯内，小心地用1 mol/L盐酸调节至pH4.0，取出1mL，稀释5到10倍测定鸡卵类黏蛋白的含量及活性。
然后加入3倍体积的预冷丙酮，用塑料薄膜封严烧杯口，在冰浴里静置4小时左右。
待鸡卵类粘蛋白完全析出后，倾出上清液，沉淀部分转移到一个带盖的50mL的离心杯内，于3000r/min离心15分钟，弃去上清，沉淀物放入真空干燥器内真空干燥，即可得到透明胶胶状物----鸡卵类粘蛋白（约200到300mg）。
1.5鸡卵类粘蛋白的活性测定
鸡卵类粘蛋白是胰蛋白酶的天然抑制剂，测定它的活性可以用抑制胰蛋白酶的活力单位来表示。
即：抑制1个胰蛋白酶活力单位（BAEE单位）所需卵类粘蛋白量定为抑制剂的1个活力单位。
将卵类粘蛋白和结晶胰蛋白酶按一定比例相互混合（一般以1：2较适合），加入适量的0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液在25℃保温10分钟左右，使酶与抑制剂充分结合。
然后取适量混合液按所述胰蛋白酶活力测定方法测出剩余酶活力，同时，取相同量的胰蛋白酶（未加抑制剂）按常规方法测出胰蛋白酶活力，由它减去剩余酶活力，即为被抑制的胰蛋白酶活力，也就是卵类粘蛋白的抑制活力。
取2个石英比色池（带盖，光程为1cm），向一个碧色池内加入1.5mL的0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液和1.5mL的2.0mmol/LBAEE底物溶液，混匀，在波长253nm处调整仪器零点。
向另一个比色池加1.5mL0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl 缓冲液，10微升胰蛋白酶，10微升鸡卵类粘蛋白轻轻摇匀，在室温下（最好是在25℃恒温箱内）放置2分钟，使胰蛋白酶与鸡卵类粘蛋白充分结合。
然后加入1.5mL 2mmol/LBAEE底物溶液，立即混匀并记时。
于波长253nm处测定其光吸收递增值-----△A253nm/min。
每隔30秒钟读数一次，使△A253nm /min值控制在0.05左右为宜，否则要根据△A253nm/min的大小适当减少或增加鸡卵类粘蛋白的量。
以反应时间t为横坐标，△A253nm为纵坐标作图，取直线部分的任一时间间隔与相应的光吸收变化值△A253nm /min用A2表示。
与此同时，以同样的方法（不加鸡卵类粘蛋白）测胰蛋白酶的活性。
通过作图得到光吸收变化值△
A253nm/min，用A1表示。
鸡卵类粘蛋白的抑制活性及抑制比活性的计算公式如下：
鸡卵类粘蛋白的抑制活性单位（BAEE）=（A
1-A
2
）/0.001
鸡卵类粘蛋白抑制比活单位（BAEE单位/mg胰蛋白酶）
=1000（A1-A2）/(I×0.001)
式中：A
1为胰蛋白酶△A
253nm
/min
A
2为加入抑制剂后胰蛋白酶△A
253nm
/min
I为测定时所用鸡卵类粘蛋白的量（微克）
1000是将抑制剂的微克数转换成mg数
0.001是指光吸收每增加0.001定义为1个BAEE单位
1.6鸡卵类粘蛋白的含量测定
配成一定浓度的鸡卵类粘蛋白溶液，在280nm处测定其光吸收。
鸡卵类粘蛋白的消光系数是：A1%（1cm）=4.13式中1%为蛋白浓度（1g/100mL），当蛋白浓度为1mg/mL时，其消光系数为0.413.
鸡卵类粘蛋白=A280nm×稀释倍数/0.413
2 结果与分析
3 讨论(包括心得体会)
参考文献
综合实验报告成绩评定
合肥工业大学
姓名专业(班级) 学号实验名称：
个人自评（包括实验态度、出勤、纪律、收获与体会等）：
组长（或学习委员）签字：
年月日指导教师评定成绩：
指导教师签字：
年月日。