第六章 亲和分离技术

（3）葡聚糖凝胶： 葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小，应 用受到限制。 （4）聚丙烯酰胺凝胶： Bio-gel P 有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较高的亲 和柱，适用于亲和势比较低的系统。 pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。
（5）多孔玻璃珠： 化学与物理稳定性较好，机械强度高。 缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非 特异性吸附，化学活性基团少。 （6）其它载体——壳聚糖
（5）辅酶和磷酸腺苷 脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。 辅酶主要有NAD（nicotinamide adenine dinucleotide）、 NADP（NAD phosphate）和ATP （adenosine triphosphate）等。 这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。 AMP（adenosine 5'-monophosphate）、 ADP （adenosine 2'，5'-diphosphate）的腺苷部分与上述辅酶 的结构类似，可用做这些酶的亲和配基。
（4）凝集素 凝集素（lectin）是与糖特异性结合的蛋白质（酶和 抗体除外）的总称。 伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，con A） 可用做 糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子的分析、纯化。 pH＜5.6时con A为二聚体，分子量为52 kD；pH＞5.6时 为四聚体，分子量为102 kD，两个亚基（subunit）之间 通过二硫键结合。因此，在利用con A为配基的亲和分离 技术中，操作条件应当适宜。
三、亲和作用体系
将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联，可 特异性结合另一种分子（目标产物） ，使其从混合物中 高选择性地分离纯化。 一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配基 （ligand），用L表示。
Kd：解离常数 Keq：结合常数 Keq越大，亲和结合作用越强。Keq一般为104～108 L/mol， 最高（生物素－抗生物蛋白）可达到1015 L/mol 。
第三节 亲和分离技术的应用
一、亲和分离过程
1、配基固定化：配基与载体偶联，结合成具有特异亲 和性的分离介质。 2、吸附样品：亲和层析介质选择性吸附生物活性物质。 3、样品解吸：选择适宜的条件使被吸附物活性物质解 吸。
目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。 （1）特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲 和结合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标产 物的竞争性结合，洗脱目标产物。 例如：Lys和Arg均为t-PA（组织纤溶酶原激活剂，一种 糖蛋白）的抑制剂，利用固定化Lys为配基亲和分离t-PA 时，可用Arg溶液进行洗脱。 利用con A为配基的目标产物可用葡萄糖溶液洗脱。

第二节亲和）一词源于拉丁语的affinitus，原意 为结婚或亲缘关系，因此在化学或生物化学中，affinity 可以理解为分子之间的结合作用。 实际上，亲和作用不止限于生物物质之间，对于简 单的化合物，如Na+和Cl-通过静电作用相互吸引的现象 也是一种亲和作用。因此，亲和作用是自然界普遍存在 的现象，只是生物分子间的亲和作用具有更高的选择性。
引入间臂分子最常用的方法: 先将间臂分子氨烷基化合物NH2(CH2)nCOOH、 NH2(CH2)n NH2连接到载体上。 然后将亲和配基连接在间臂分子上。
羧基和氨基在碳二亚胺的作用下可以缩合形成酰胺键。 间臂的长度是很重要的因素，太短，效果不明显；太长， 间隔臂容易弯曲，结合效果会下降。实验结果表明，一般引 入4－6个亚甲基时，间臂分子效果较好，常用的间臂分子为 ω-氨基己酸、1，6-二氨基己烷。
具有亲和作用的分子对之间具有钥匙和锁孔的关系 是产生亲和作用的必要条件，但并不充分，除此之外， 要想发生亲和作用还需要分子或原子水平的各种相互作 用。 （1）静电作用 （2）氢键 （3）疏水性相互作用 （4）配位键 （5）弱共价键
静电作用：近距离产生较大的作用力，但应与其它 因素结合才能具有亲和识别作用。 氢键：分子中的氧原子和氮原子，可形成氢键作用。 与原子间距离有关，应较近。 疏水性相互作用：需两分子都具有疏水性基团。 配位键：咪唑基（组氨酸）和Zn2＋、Cu2＋、Ni2＋等 产生配位键，形成金属螯合结构。 弱共价键：可逆共价键，结合力较弱。
（3）A蛋白 Protein A为分子量约42 kD的蛋白质，与IgG具有很 强的亲和作用，结合部位为IgG分子的Fc片段。A蛋白分 子上含有5个Fc片段可结合部位。 不同IgG的Fc片段的结构非常相似，因此A蛋白可作 为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的结合常数有所不 同。 A蛋白与抗体结合并不影响抗体与抗原的结合能力， 因此A蛋白也可用于分离抗原-抗体的免疫复合体。
3、抑制氢键形成的物质 脲和盐酸胍的存在可抑制氢键的形成，但容易使蛋 白质变性。 4、温度 温度升高，静电力、氢键、金属配位键减弱，疏水 力增强。 5、离液离子 SCN-，I-，ClO4-等离子半径较大的离液阴离子（破 坏水化作用）存在时，疏水性亲和作用降低。 6、螯合剂 加入螯合剂（如EDTA），去除金属离子，破坏配 位键，会使亲和作用消失。
（9）肝素 肝素（heparin）是存在于哺乳动物的肝、肺、肠等 脏器中的酸性多糖类物质，分子量一般为5至30 kD，具 有抗凝血作用。 肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内 切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有亲和作用，可用作 这些物质的亲和配基。 肝素的亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液中较 强，随着盐浓度的增大结合作用降低。
亲和配基的选择 （1）组合化学肽库选择亲和配基 目标肽→反义肽→组合合成→亲和筛选→优选序列 （2）噬菌体展示技术 目标蛋白→可结合噬菌体→扩增→多轮筛选单克隆群 体→氨基酸序列 （3）SELEX技术 随机序列→PCR扩增→特异性结合→重复筛选
间隔臂
当配基的分子量较小的时候，如果将其直接固定到 载体上，会由于空间位阻的影响，配基与生物大分子不 能发生有效的结合。 这时需要在配基和载体之间引入一个间臂分子，使 配基和生物大分子发生有效作用。

第一节 亲和技术发展
1910年有人发现不溶性淀粉可以选择性吸附生物 组织抽提液中的α-淀粉酶，这是亲和分离法的最初应 用及报道。 1951年Campbell等利用半抗原（对氨苯甲基）修 饰纤维素制备的载体为亲和吸附介质从血清中纯化了 抗体，这是人们开始有意识利用生物亲和作用纯化蛋 白质的研究。 由于亲和吸附介质制备技术的障碍，亲和分离技 术的实用化进程进展缓慢。
特异性洗脱法的洗脱条件温和，有利于保护目标产 物的生物活性，另外，由于仅特异性洗脱目标产物，对 于特异性较低的亲和体系（例如，用三嗪类色素为配基 时）或非特异性吸附较严重的物系，特异性洗脱法有利 于提高目标产物的纯度。 （2）非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、 离子种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。
亲和配基必须具备的条件(选择原则) ： （1）专一性识别或特异性作用必须是可逆的 配基与被分离生物大分子之间的专一性识别或特异 性作用，必须是可逆的。 （2）结合常数要适当 配基与被分离分子之间结合力要有足够高，以能形 成稳定的复合物；同时结合又不能太强，否则洗脱困难。 （3）稳定性好，可进行化学改性 （4）固定到载体上后配基的专一性识别或特异性作用 不发生明显的变化。
生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别特 定物质并与该物质的分子相结合的能力。这种识别并结 合的能力具有排他性，即生物分子能够区分结构和性质 非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结 合。 生物亲和作用是生命诞生、维持与延续的重要基础， 而亲和分离技术则是人类利用生物亲合作用的方式。
亲和作用的本质：锁钥理论 参与亲和作用的两个分子（或物质）中，其中之一 为蛋白质的情况占绝大多数，或者两者均为蛋白质。蛋 白质是高分子化合物，种类繁多、结构复杂，其参与亲 和作用的机理尚不完全清楚，一般认为是蛋白质的立体 结构中含有某些参与亲和结合的部位，这些结合部位呈 凹陷或凸起状，能与该蛋白质发生亲和作用的分子恰好 可以进入到此凹陷结构中，或者该蛋白质的凸起部位恰 好能够进入与其发生亲和作用的分子的凹陷部位，就像 钥匙和锁孔的关系一样。

常用载体
纤维素 (cellulose) 琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃珠（Bio-Glass） 其它载体——壳聚糖 (Chitosan)
（1）纤维素 纤维素结构紧密、均一性差，不利于大分子的渗入。 非特异性吸附力较强，空间位阻。 主要用于分离与核酸有关的物质。 （2）琼脂糖凝胶 琼脂糖浓度有2%、4%、6%，商品为Sepharose 2B、4B 和6B（Pharmacia）。 保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种功能基团， 结构疏松孔径大，流速快。 稳定性好，能在pH3~14中应用。
载体要求： （1）具有亲水、多孔结构； （2）含有可活化的反应基团； （3）理化性质稳定，不因共价偶联反应的条件及吸附 条件的变化而发生变化； （4）非特异吸附小。 多糖类的凝胶过滤介质表面含有大量可活化的羟基 可作为亲和配基的载体。 表面具有氨基的聚丙烯酰胺类的载体也常作为亲和 配基的载体。 还可采用一些无机载体如硅胶和多孔玻璃。
第六章 亲和分离技术
生物大分子之间的特异性结合作 用称为生物亲和作用（bioaffinity）， 简称亲和作用，如抗原与抗体、酶与酶 原（或抑制剂、底物）、核酸与互补碱 基链等。 利用亲和作用纯化生物大分子的 生化分离技术称为亲和分离技术，它是 基于固定相的配基与生物分子间的特殊 生物亲和能力的不同来进行相互分离的。
二、影响亲和作用的因素
1、离子强度 离子强度影响静电引力、氢键作用、疏水相互作用 等。离子强度越大，静电力和氢键力都降低，而疏水作 用增强。 2、pH值 在适当的pH下，亲和结合作用较高，在其它pH下， 亲和作用减弱或完全破坏。 如：当蛋白质的结合部位存在羧基时，在pH值等于 该羧基的pKa时，该羧基的50%带负电荷，当pH值高于 pKa一个pH单位时，该羧基的90%带负电荷，当pH值低 于pKa一个pH单位时，该羧基的10%带负电荷。