微生物发酵法生产抗癌药物紫杉醇
微生物发酵生产紫杉醇研究进展
微生物发酵生产紫杉醇研究进展摘要：综述了微生物发酵生产紫杉醇的主要研究进展，包括产紫杉醇的内生真菌的生物多样性、真菌细胞发酵生产紫杉醇的优势，同时也对如何改良内生真菌菌种性能和优化培养基组成及培养条件以提升其产紫杉醇的能力，作出了较为全面的综述。
关键字：紫杉醇，微生物发酵，内生菌，产量前言：目前国外市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮中提炼和人工合成方法，目前并未见有第三种形式形成大规模产业化制作的报道。
紫杉醇的生产受着原材料与科技二个方面的约束，短期内无法突破。
为克服红豆杉资源匮乏和紫杉醇需要量的日益扩大的问题，人类对生产紫杉醇开展了多种多样的科学研究，涉及化学全合成、植物细胞培养、微生物转化和微生物发酵。
微生物发酵法生产紫杉醇由于具备突出优点，其研制与发展日益引起中外科研学者的普遍重视。
一、紫杉醇产生菌的研究进展（一）产紫杉醇的内生真菌的种类Stierle和Strobel等首次从短叶红豆杉的树枝上分离出一个可以形成紫杉醇的内生真菌，命名为安德列亚霉[1]。
当时这一发现对于紫杉醇的药源研究是一次重要的突破，为开发紫杉醇的物源提出了一个崭新的途径。
此后，各地研究者相继进行对产紫杉醇的内生真菌的分离操作，先后在西藏红豆杉、云南省红豆杉、东北地区红豆杉、欧洲红豆杉和中国红豆杉中分离到能形成紫杉醇的内生真菌，其寄主植被基本包括红豆杉属下的所有种类。
在国外的树木中，科学家也分离出来到了可形成紫杉醇的内生真菌。
Li等在不同种类的秃柏的韧皮部和木材部中均分离出能形成紫杉醇的内生真菌[2]。
GA等18人在同一种松树中分离出产紫杉醇的内生真菌。
这表明，产紫杉醇的内生真菌不但存在于红豆杉属植被中，在某些非红豆杉属植被中也存在，他的研究结果更拓宽了产紫杉醇的内生真菌的研究范畴。
（二）真菌发酵制备紫杉醇的优越性与过去在红豆杉植株的树皮上获得的紫杉醇比较，由内生真菌发酵制备紫杉醇有着更多的优越性，微生物发酵方法具有以下特点：（1）微生物发酵的方法易扩大化，有利于工业化生产的落地实施；（2）微生物易于通过诱变育种等方法筛选高产菌株，提高紫杉醇的产量，微生物育种及选育速度明显高于植物细胞株；（3）内生真菌生长迅速，在简单培养基中便可大量繁殖，形成丰富的发酵活性性质；（4）内生真菌在生物反应器中生长时，可人为调节各项发酵参数，使代谢路径朝着有利于紫杉醇的生产及高浓度紫杉醇的积累的方向进行。
紫杉醇生物体内合成过程
紫杉醇生物体内合成过程全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：紫杉醇是一种来源于紫杉树的天然化合物，具有很强的抗癌活性，被广泛应用于临床治疗各种癌症。
紫杉醇的生物体内合成过程极为复杂，需要多个酶和底物共同作用，经过一系列反应才能最终得到紫杉醇。
下面将具体介绍紫杉醇在生物体内的合成过程。
紫杉醇的生物体内合成过程主要发生在植物体内，具体是在紫杉树的树皮和树叶中。
紫杉树通过光合作用将二氧化碳和水转化为葡萄糖，并通过细胞壁和细胞质膜将葡萄糖输送到叶绿素细胞内。
在叶绿素细胞内，葡萄糖被进一步转化为异戊二烯醛，这是紫杉醇合成的起始物质。
接着，异戊二烯醛经过一系列酶的催化作用，逐步转化为异香树脑、异下角酯和芳亚麻酸。
这些中间产物经过进一步反应和转化，在经过多个酶催化反应后，最终合成为紫杉醇。
紫杉醇是一个高度复杂的生物合物，结构稳定，有很强的生物活性，能够有效抑制癌细胞的增殖和扩散。
紫杉醇的生物体内合成过程不仅仅发生在紫杉树中，还可以通过生物工程技术在其他微生物或植物中进行合成。
科学家们通过改造微生物或植物的基因组，使其拥有紫杉醇合成途径的相关基因和酶，从而实现紫杉醇的人工合成。
这种方法不仅可以提高紫杉醇的产量，还可以避免砍伐紫杉树等不可持续的开发方式，对环境保护和资源节约具有重要意义。
紫杉醇的生物体内合成过程是一个极为复杂的生物化学反应网络，需要多个酶和底物的协同作用，经历多个步骤才能最终合成出紫杉醇这种抗癌活性物质。
通过深入研究紫杉醇的生物合成机制，可以为生物医药领域的新药研发提供重要的参考和借鉴，有助于开发出更多高效的抗癌药物，促进健康医疗事业的发展。
希望未来能够进一步加强对紫杉醇生物合成的研究，推动这一领域的发展和进步。
【紫杉醇生物体内合成过程】。
第二篇示例：紫杉醇（Paclitaxel）是一种重要的治疗肿瘤的药物，具有广泛的疗效和应用。
而紫杉醇的主要来源是从紫杉树的树皮中提取得到，但是该方法存在诸多问题，比如提取难度大，产量低等。
真菌发酵法生物合成抗癌药物紫杉醇的研究
真菌发酵法生物合成抗癌药物紫杉醇的研究真菌发酵法生物合成抗癌药物紫杉醇的研究一、引言癌症是当今世界严重威胁人类健康的重大疾病之一，寻找有效的抗癌药物一直是医学和生物学领域的研究热点。
紫杉醇作为一种重要的抗癌药物，具有独特的作用机制和显著的临床疗效。
传统的紫杉醇提取方法主要依赖于从红豆杉属植物中提取，然而红豆杉生长缓慢，资源有限，这限制了紫杉醇的大量生产。
因此，探索新的紫杉醇生产方法具有重要的现实意义。
真菌发酵法生物合成紫杉醇作为一种有潜力的替代方法，受到了广泛的关注。
二、紫杉醇的结构与作用机制1. 紫杉醇的化学结构紫杉醇是一种复杂的二萜类化合物，其分子结构包含多个手性中心和独特的官能团。
它的基本结构由紫杉烷环和侧链组成，紫杉烷环是一个刚性的四环结构，侧链则连接在紫杉烷环的特定位置上。
这种复杂的结构赋予了紫杉醇独特的物理和化学性质。
2. 紫杉醇的抗癌作用机制紫杉醇主要通过促进微管蛋白聚合，抑制微管解聚，从而稳定微管结构来发挥抗癌作用。
在细胞分裂过程中，微管是构成纺锤体的重要成分，紫杉醇稳定微管的作用会导致纺锤体无法正常形成，进而阻断细胞的有丝分裂过程，使癌细胞停止增殖并最终死亡。
此外，紫杉醇还可能通过其他机制影响癌细胞的生物学行为，如调节细胞信号传导通路、诱导细胞凋亡等。
三、真菌发酵法生物合成紫杉醇的研究进展1. 产紫杉醇真菌的筛选与鉴定研究人员从自然界中广泛筛选能够产生紫杉醇的真菌。
通过对不同环境样本（如土壤、植物组织等）进行分离培养，然后利用高效液相色谱（HPLC）等分析方法检测培养物中是否含有紫杉醇。
经过大量的筛选工作，已经发现了一些能够产生紫杉醇的真菌菌株，如紫杉霉属（Taxomyces）、拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis）等。
对这些产紫杉醇真菌进行准确的分类鉴定，有助于深入了解它们的生物学特性和代谢途径。
2. 真菌发酵条件的优化为了提高真菌发酵生产紫杉醇的产量，需要对发酵条件进行优化。
对于天然抗癌药物紫杉醇的探究
对于天然抗癌药物紫杉醇的探究一、紫杉醇的研究历史紫杉醇是从红豆杉科红豆杉属植物树皮、针叶中分离出的一种四环二硝酸胺类化合物，它能有效地治疗晚期卵巢癌，乳腺癌和其它癌症，被称为是过去几十年中发现的最好的抗癌药物。
1992年12月29日，美国FDA正式批准紫杉醇作为治疗晚期卵巢癌的新抗癌药物（商品名为Pach－taxel）。
由于紫杉醇在植物体中的含量相当低，大约从3～6棵60～100年生大树的树皮中才能提取到1g紫杉醇，可治疗一个癌症患者。
目前全球每年200kg紫杉自的消耗量意味着要砍伐100万棵红豆杉大树，随着紫杉醇应用范围的扩大，其需求量必然会逐年增加，而红豆杉树生长速度相当慢，直径20厘米的树需生长100年。
因此，伐树生产紫杉醇的方法不仅会严重破坏该树的长期生存和分布，也根本无法满足人们对紫杉醇的需求。
就目前研究结果表明：紫杉醇的主要来源仍是紫杉树皮，这种常绿乔木生长十分缓慢，大规模的砍伐必然严重破坏植物资源．二、紫杉醇的药理紫杉醇具有独特的作用机制，能诱导与促进微管蛋白聚合、微管装配与微管稳定，从而阻止肿瘤细胞的生长。
药理实验证明，紫杉醇具有广谱抗癌作用，其抗癌性源于它作用细胞分裂过程中形成纺锤体的微管蛋白。
与常用的其它纺锤体毒物如阻止微管聚集的长春花碱、长春花新碱、秋水仙碱、鬼臼毒素等作用相反，紫杉醇在低浓度下（0．25μm）就催化激管蛋白的迅速合成微管并结合到微管上起稳定和防止微管解聚作用。
正常微管在4 ℃低温或Ca2+存在下便可解聚，而紫杉醇作用后的微管则不发生解聚。
这样紫杉醇的活性表现在两个方面：1、对迅速分裂的肿瘤细胞，紫杉醇冻结有丝分裂纺锤体，从而使肿瘤细胞停在G2期和M期，直至死亡。
2、抑制肿瘤细胞的迁移。
三、紫杉醇的毒副作用紫杉醇为作用机制新颖的抗肿瘤药物对卵巢届、乳腺癌、食道涵、头颈部群状细胞癌等多种肿在有效，因此为广谱抗肿瘤药。
但紫杉醇临床应用的某些方面有待继续研究，包括与其它抗肿在药物的联合用药、虽佳治疗方案、田注时间、耐受性等。
对于微生物发酵法生产紫杉醇的探究
内生真菌的培养、保存
• 一般20 ℃～25 ℃培养一个月左右,即可形成内生 真菌菌落。
• 二是从产紫杉醇的内生真菌细胞中分离出 产紫杉醇的关键酶基因并将其导入微生物 体内，利用其它真菌甚至细菌、酵母菌构 建新的紫杉醇高产工程菌株来生产紫杉醇。
• 三是优化发酵培养条件，通过添加碳源、 氮源和前体物、特殊的诱导子、抑制剂等 物质借助代谢途径工程的研究来提高真菌 紫杉醇的合成量。
发酵液中紫杉醇的分离，提纯和检测
对于微生物发酵法生产紫杉醇的探究
紫杉醇
• 紫杉醇是红豆杉属植物的树皮中提出的一 种复杂的次生代谢产物，属于二萜类衍生 物。是目前所了解的惟一一种可以促进微 管聚合和稳定已聚合微管的药物。通过临 床相关研究，紫杉醇是目前公认的广谱、 活性强的抗癌药物之一。由于其具有显著 抗癌效果，现已成为临床上治疗肿瘤的重 要药物。
• 化学半合成法
• 化学全合成法
• 微生物发酵法
• 红豆杉细胞培养法
目前国际市场上的紫杉醇主要从红豆杉树 皮提取及半合成,迄今为止尚未见有第三种 形式形成大规模工业化生产的报道。
• 紫杉醇是濒临灭绝的珍稀树种
• 紫杉醇在树皮中的含量极低,仅为干重的 0.101 %～0.106 % ,且生长缓慢,植株成熟 约需100 年。约3～6棵100 年左右的红豆 杉树皮才能提取出用于治疗一个癌症病人 所需求的紫杉醇。即使将世界上现有的红 豆杉全部砍伐，所提取的紫杉醇也只能挽 救12.5万癌症患者的生命，远远不能满足 当今市场的需求量。
紫杉醇的发酵培养
自1929年英国人发现青霉菌分泌青霉素能抑制葡 萄球菌生长以后，相继发现了链霉素、氯霉素、金霉 素、土霉素、四环素、新霉素和红霉素等抗菌素.在 近几十年内，抗生素的研究又有了飞速的发展，已找 到的抗生素有数千种，其中具有临床效果并已利用发 酵法大量生产和广泛应用的多达百余种.
2、维生素类药物
美国西部山区有一片红豆杉林，山林中有一个小村镇，住
着2000多居民。这个小村镇虽然不大，却以长寿而闻名美国。 小村镇里，寿命最短的人都活到95岁以上，绝大多数人的寿命 都在100岁以上，百岁寿星处处可见！
副作用
但是，人们发现紫杉醇具有独特的 抗肿瘤作用，能够显著地抑制肿瘤生长， 对晚期卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、 卡波济肉瘤等疗效确切，而且副作用很 小。当世界各国都为无法攻克癌症而焦 灼的时候，红豆杉中紫杉醇的发现像一 棵救命的灵芝草，给癌症患者带来了生 的希望。
2) 内生真菌的培养
• 种子培养基: 液体培养基，将纯 化菌株接种到液体培养基中培养 种子菌,3 d 后,取5 mL 液体种 子菌转入发酵罐中发酵。
• 发酵培养基：2.8L 和10L 小罐发酵方法： 以3%接种量将种子培养液接入已灭菌 (2.8L 小罐进行实罐灭菌,10L 罐先空消, 再用无菌压缩空气吹干后加入灭过菌的培 养基)、冷却的发酵培养基中，200 r/ min ，28℃通风培养16~18d，定期测定 发酵液中紫杉醇含量、生物量、总糖和 pH 值。
• 维生素作为六大生命要素之一，为整个生命活动所必 需.VA的前体β-胡萝卜素及VC和VE均为抗氧化剂，能 保护人体组织的过氧化损伤并提高机体免疫力，有抗 癌、抗心血管疾病和白内障等功能.
• 就拿Vc为例，Vc的微生物发酵法早已取得重要突破， 利用“大小菌落”菌株混合培养生产VC的工艺已经成 熟，进入产业化.目前利用氧化葡萄糖杆菌与一种蜡 状芽孢杆菌混合菌共固定化发酵技术，可将Vc的收率 提高到80%以上，生产周期比传统工艺缩短1/3.
紫杉醇发酵生产工艺
微生物发酵生产紫杉醇产品介绍及社会价值：紫杉醇是一种二萜类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一⋯。
紫杉醇最早是wanj等于1971年从短枝红豆杉(7Ikusbreviifolia)树皮中分离得到的。
随后，schiff等证实紫杉醇具有独特的抗癌机制。
随着紫杉醇的临床应用，对其研究也逐渐深入，其主要抗癌机制为抑制肿瘤细胞的微管(Microtllbules)合成，以阻断细胞分裂，致使肿瘤体积逐渐缩小；紫杉醇还可诱导细胞凋亡，另外还有类似脂多糖(IPS)的作用，可调节机体的免疫功能。
目前国际市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮提取及半合成，迄今为止尚未见有第三种形式形成大规模工业化生产的报道。
紫杉醇的工业生产受到了原料和技术两方面的制约，短期内难以突破。
为了解决红豆杉资源短缺与紫杉醇需求量的日益增加的矛盾，人们对生产紫杉醇进行了多方面的研究，包括化学全合成、红豆杉细胞培养及微生物发酵。
微生物发酵法生产紫杉醇因具有明显优势，其研究和开发越来越受到国内外研究学者的广泛关注。
这里提出一种运用基因工程，代谢工程，发酵工程结合的方法生产紫杉醇，该法首先将杉醇纯合成基因克隆至大肠杆菌，让其高产紫杉二烯，再把它流加至高产紫杉醇酵母的发酵罐中，运用代谢工程手段生产紫杉醇。
创新点：运用克隆方法，将合成紫杉二烯的代谢过程酶的结构基因，以及调控系列克隆至大肠杆菌，让其表达，此过程刚被Parayil Kumaran Ajikumar及其同事实现，而运用代谢工程手段让高产紫杉醇酵母利用紫杉二烯这个前体高产紫杉醇，这是没尝试但可行的。
国内外研究：1、分离菌种：最早stierle和strobel等在短叶红豆杉的枝条上分离到一种内生真菌，能够产生紫杉醇，定名为安德列亚霉。
此后，各国学者纷纷开展产紫杉醇内生真菌的分离工作，陆续从西藏红豆杉、云南红豆杉、东北红豆杉、欧洲红豆杉、中国红豆杉中分离到产紫杉醇的内生真菌，其宿主植物几乎涉及红豆杉属的各个种。
微生物发酵法生产抗癌药物紫杉醇
• （2）由于发酵条件的限制，单位培养液中 紫杉醇的含量低
三 提高内生菌紫杉醇的产量的方法
（一）改良菌种
1. 利用常规的诱变改良菌种
2. 利用原生质体融合改良菌种 3. 利用基因工程构建工程菌
分离紫杉醇合成代谢酶类和获得它们的 cDNA 克隆，将已经构建的携 带紫杉醇合成途径关键酶基因的真菌表达载体转入高产紫杉醇内生真菌中， 获得高产紫杉醇工程菌株
高效液相色谱( HPLC)
• HPLC 是最常用的、较为有效的分析检测方 法。HPLC 不仅可以测定紫杉醇含量, 而且 还能追踪分离紫杉醇。
• 色谱条件：惠普1100系列，采用XDB-C18色谱柱 (4.6mm×250 mm，5μm)，流动相为甲醇与水混 合物(V甲醇:V水=65:35)，柱温为25℃，波长为 227 nm，流速1.0 mL/min，进样量10μL。用紫杉 醇标准品做对照。
一、紫杉醇的概况和作用机制
二.微生物发酵法生产紫杉醇的技术路线 三.提高内生菌紫杉醇的产量的方法
一、紫杉醇的概况和作用机制
红 豆 杉 树
紫杉醇（Paclitaxel,商品名Taxol）的概述：
1963年美国化学家瓦尼（M.C. Wani）和沃尔（Monre E. Wall） 首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（Pacific Yew） 树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。
可通过诱变育种等手段来提高菌种性能以提高紫杉醇产量2由于发酵条件的限制单位培养液中紫杉醇的含量低利用基因工程构建工程菌分离紫杉醇合成代谢酶类和获得它们的cdna克隆将已经构建的携带紫杉醇合成途径关键酶基因的真菌表达载体转入高产紫杉醇内生真菌中获得高产紫杉醇工程菌株二优化发酵条件1
紫杉醇生物合成途径的关键缺失酶
紫杉醇生物合成途径的关键缺失酶紫杉醇是一种在抗癌药物中应用广泛的有效成分，广泛应用于治疗卵巢、乳腺和前列腺等多种癌症。
其药效显著，但由于紫杉醇在天然来源中含量较低，而化学合成成本高昂，因此人们开始关注紫杉醇的生物合成途径。
紫杉醇的生物合成途径中有一些关键的酶缺失，这限制了其高效生物合成的实现。
本文将从紫杉醇的生物合成途径、关键缺失酶以及可能的解决方案等方面进行探讨。
一、紫杉醇的生物合成途径紫杉醇的生物合成途径主要包括二萜醇、喹啉和紫杉醇三个关键中间体的合成。
其中二萜醇主要通过异戊二烯二醇合成酶（GGPPS）和色胺酸脱羧酶（TDC）催化合成，喹啉则通过二萜醇氧化酶（T5OH）和喹啉合酶（DBAT）合成，最后通过紫杉醇合酶（TS）合成紫杉醇。
这一生物合成途径中的关键缺失酶主要是喹啉合酶（DBAT），其功能是将二萜醇氧化酶（T5OH）合成的喹啉与GPP（异戊二烯二磷酸）反应形成紫杉醇的前体酮氧化环辛烯烷酮。
二、关键缺失酶DBATDBAT是紫杉醇生物合成途径中的关键酶，其缺失导致了紫杉醇生物合成的受阻。
DBAT的缺失主要表现在以下两个方面：1.缺乏高效的DBAT酶目前已知的DBAT酶在催化喹啉合成环辛烯酮的过程中效率较低，而且受底物抑制的影响较为显著。
由于DBAT酶的低效率和受抑制作用，导致紫杉醇的生物合成效率较低，制约了其在医药领域中的广泛应用。
2.缺乏功能稳定的DBAT酶基因在紫杉醇的生物合成途径中，对DBAT酶基因的缺失限制了人们通过基因工程技术来提高DBAT酶的活性和稳定性。
缺少功能稳定的DBAT 酶基因限制了对紫杉醇生物合成途径的深入研究和应用。
三、解决方案针对DBAT酶的关键缺失，可以从以下几个方面来解决：1.发现高效的DBAT酶目前，科研人员可以通过对微生物和植物中进行广泛筛选，以寻找具有较高活性和稳定性的DBAT酶。
通过对这些酶的深入研究和改良，可以为紫杉醇的生物合成途径提供更多的选择。
紫杉醇的生物合成
获取紫杉醇的途径
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化学合成 红豆杉中提取 植物细胞培养 真菌发酵
化学合成
紫杉醇分子结构复杂，具有特殊的三环 紫杉醇分子结构复杂，具有特殊的三环[6+8+6]碳架 碳架 和桥头双键以及众多的含氧取代基。先后共有30多 和桥头双键以及众多的含氧取代基。先后共有 多 个研究组参与研究其全合成， 多年的努力， 个研究组参与研究其全合成，经20多年的努力，于 多年的努力 1994年才由美国的 ．A．Holton与 年才由美国的R． ． 年才由美国的 与 K．C．Nic~aou两个研究组同时完成紫杉醇的全合 ． ． 两个研究组同时完成紫杉醇的全合 随后， ． ． 成。随后，S．T．Danishefsky(1996年)、 年、 P．A．Wender(1997年)、T．Mukaiyama(1998年) ． ． 年、 ． 年 个研究组也完成这一工作。 和Kuwajima(1998年)4个研究组也完成这一工作。 年 个研究组也完成这一工作 半合成方法一般以其前体 脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ为 半合成方法一般以其前体10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ 脱乙酰浆果赤霉素 原料，延长边链而成。另一种半合成方法是以10-去 原料，延长边链而成。另一种半合成方法是以 去 乙酰巴卡亭Ⅲ为前体物来合成。 乙酰巴卡亭Ⅲ为前体物来合成。
从红豆杉中提取
紫杉醇在植物体内的含量相当低，目前公认含量最 紫杉醇在植物体内的含量相当低， 高的短叶红豆杉树皮中也仅含0． 高的短叶红豆杉树皮中也仅含 ．069％ ％ 资源很匮乏 红豆杉生长缓慢， 红豆杉生长缓慢， 树皮剥去后不能再生， 树皮剥去后不能再生， 树木将死亡
红豆杉怀璧获罪
由于美国、加拿大等国家对红豆杉立法保护， 国家。 由于美国、加拿大等国家对红豆杉立法保护，药源地转向了中国等 国家。在 中国，８０％的红豆杉集中在云南，而且云南红豆杉的紫杉醇含量 最高。 中国，８０％的红豆杉集中在云南， 最高。 １９９３年 民营企业云南汉德公司成立， １９９３年，民营企业云南汉德公司成立，其主要业务是从红豆杉中提 杉醇。１９９５年 汉德公司依靠中科院昆明植物研究所的技术， 杉醇。１９９５年，汉德公司依靠中科院昆明植物研究所的技术，建成 国最大的年生产能力５０公斤的紫杉醇及其系列产品生产线。 ５０公斤的紫杉醇及其系列产品生产线 国最大的年生产能力５０公斤的紫杉醇及其系列产品生产线。１９９９ 月，该厂的产品还通过了美国ＦＤＡ认证，“顺利扫清了通向美国市场 该厂的产品还通过了美国ＦＤＡ认证， ＦＤＡ认证 碍”。 取紫 了中 年２ 的障
紫三醇
影响紫杉醇生产的因素和提高产量的方法姓名：赵玉学号：090913058摘要：概述了利用植物细胞大量培养,发根农杆菌转化的发根培养,产紫杉醇真菌养及基因工程等生物技术生产抗癌新药紫杉醇的研究现状,并对各种途径的应用前景进行展望。
关键词：紫杉醇细胞培养发根培养产紫杉醇真菌11，概述紫杉醇(taxol)是从红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxusspp.)植物树皮、针叶中分离,出的一种四环二萜酰胺类化合物,它能有效地治疗晚期卵巢癌,乳腺癌和其它癌症,被称为是过去几十年中发现的最好的抗癌药物。
1992年12月29日,美国FDA正式批准紫杉醇作为治疗晚期卵巢癌的新抗癌药物(商品名为Pacli-taxel)。
由于紫杉醇在植物体中的含量相当低,大约从3～6棵60～100年生大树的树皮中才能提取到1g紫杉醇,可治疗一个癌症患者。
目前全球每年200kg紫杉醇的消耗量意味着要砍伐100万棵红豆杉大树,随着紫杉醇应用范围的扩大,其需求量必然会逐年增加,而红豆杉树生长速度相当慢,直径20cm的树需生长100年!因此,伐树生产紫杉醇的方法不仅会严重破坏该树的长期生存和分布,也根本无法满足人们对紫杉醇的需求。
尖锐的供需矛盾在医学、化学和生物学领域中引起了一场非同寻常的广泛研究,以增加这种化合物的来源。
本文概述国内外利用生物技术生产紫杉醇的研究进展。
2利用细胞大量培养技术生产紫杉醇利用红豆杉细胞大量培养技术生产紫杉醇及其合成前体是扩大紫杉醇来源的重要途径之一。
它具有不破坏自然资源和生态环境,不受自然条件限制等优点。
目前国内外几十家实验室已对红豆杉属的10个种或变种进行过细胞培养研究,自克里森(Christen A.A.)于1991年5月在美国申请了用细胞培养技术生产紫杉醇的专利以来,国内外至少已批准了9个利用细胞培养技术生产紫杉醇及其类似物的专利。
也有许多公开的研究报目前红豆杉愈伤组织诱导与培养技术已经成熟,诱导愈伤组织的基本培养基,激素种类和浓度,外植体类型,培养条件等因素和培养程序都已经确定。
紫杉醇发酵生产工艺
微生物发酵生产紫杉醇产品介绍及社会价值：紫杉醇是一种二萜 类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的 抗癌药物之一 ？。
紫杉醇最早是wanj 等于1971 年从短枝红豆杉(7lkusbreviifolia) 树皮中分离得到的。
随后， schiff 等证实 紫杉醇具有独特的抗癌机制。
随着紫杉醇 的临床应用，对其研究也逐渐深入，其主 要抗癌机制为抑制肿瘤细胞的微管 (Microtllbules) 合成，以 阻断细胞分裂，致使肿瘤体积逐渐缩小；的作用，可调节机体的免疫功能。
目前国际市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮提取及半合 成，迄今为止尚未见有第三种形式形成大规模工业化生产的报道。
紫杉醇的工业生产受到了 原料和技术两方面的制约， 短期内难以突破。
为了解决红豆杉资源短缺与紫杉醇需求量的日 益增加的矛盾，人们对生产紫杉醇进行了多方面的研究，包括化学全合成、红豆杉细胞培养 及微生物发酵。
微生物发酵法生产紫杉醇因具有明显优势，其研究和开发越来越受到国内外 研究学者的广泛关注。
这里提出一种运用基因工程，代谢工程，发酵工程结合的方法生产紫杉醇， 该法首先将杉醇 纯合成基因克隆至大肠杆菌，让其高产紫杉二烯，再把它流加至高产紫杉醇酵母的发酵罐中， 运用代谢工程手段生产紫杉醇。
创新点：运用克隆方法，将合成紫杉二烯的代谢过程酶的结构基因，以及调控系列克隆至大 肠杆菌，让其表达，此过程刚被 Parayil Kumaran Ajikumar 及其同事实现，而运用代谢工程手 段让高产紫杉醇酵母利用紫杉二烯这个前体高产紫杉醇，这是没尝试但可行的。
国内外研究：1、 分离菌种：最早stierle 和strobel 等在短叶红豆杉的枝条上分离到一种内生真菌，能够产生紫杉醇，定名为安德列亚霉。
此后， 各国学者纷纷开展产紫杉醇内生真菌的分离工作， 陆续 从西藏红豆杉、云南红豆杉、东北红豆杉、欧洲红豆杉、 中国红豆杉中分离到产紫杉醇的内 生真菌，其宿主植物几乎涉及红豆杉属的各个种。
紫杉醇及其产生菌的研究现状
2011
【摘要】 抗癌药物紫杉醇已在临床上广泛应用，但受原料 红豆杉树木短缺的制约，存在巨大的供需差距， 而内生真菌发酵生产紫杉醇是解决紫杉醇药源问 题的很有前景的途径之一。本文主要概述了紫杉 醇及其产生菌的发现、内生真菌发酵生产紫杉醇 的优势、紫杉醇 产生菌的生物多样性及提高内生真菌生物合成紫 杉醇量的途径。
紫杉醇及其产生菌的发现
紫杉醇结构式
分子式：C47H51NO14
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紫杉醇及其产生菌的发现
• 紫杉醇抗癌机制为抑制肿瘤细胞的微 (Microtubules)合成 合成， 管(Microtubules)合成，以阻断细胞 分裂，致使肿瘤体积逐渐缩小； 分裂，致使肿瘤体积逐渐缩小；
小结
综上所述 ，从植物中寻找抗 肿瘤的天然活性物质,长期以 来是新型药物研究的重要内 容 ，而植物内生真菌是天然 药物的重要来源。紫杉醇市 场具有广阔的前景，利用内 生真菌生产紫杉醇受到国内 外学者的关注。在内生真菌 中发现紫杉醇 ，也可以启发 我们寻找能够产生其他抗癌 药物的内生真菌，进一步扩 大药物的来源。
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紫杉醇及其产生菌的发现
• 紫杉醇是美国国家癌症研究所 (NCI)在 (NCI)在 1958～1980年间 年间， 500个天然提取 1958～1980年间，从约 3 500个天然提取 发现的， Wall和 Wani于 物普 发现的，其粗提物是 Wall和 Wani于 1963 年从太平洋红豆杉的树皮和木部得到 Wani发表了紫杉醇的结构 发表了紫杉醇的结构。 的。1971 年 Wani发表了紫杉醇的结构。 1992年 l2月 29日 FDA已批准该药 1992年 l2月 29日，美国 FDA已批准该药 用于卵巢癌的治疗。 用于卵巢癌的治疗。
利用基因组工程技术改造汉逊酵母生产甘油和紫杉醇
利用基因组工程技术改造汉逊酵母生产甘油和紫杉醇利用基因组工程技术改造汉逊酵母生产甘油和紫杉醇基因组工程技术的发展为生物工程领域带来了新的可能性。
通过修改生物体的遗传信息，我们能够改变其代谢途径，使其具备特定的生产能力。
在此背景下，汉逊酵母（Hansenula polymorpha）作为一种常见的真核微生物，吸引了人们的关注。
本文将探讨利用基因组工程技术改造汉逊酵母生产甘油和紫杉醇的可能性。
首先，我们来了解一下汉逊酵母的特点。
汉逊酵母是一种酵母菌，可以在不同的环境中生长和繁殖。
它具有较高的生长速度和较强的代谢能力，因此具备潜力用于产生各种有用的化合物。
在传统的发酵工业中，汉逊酵母已经被广泛应用于生产酒精、甘油等化合物。
然而，由于自然产生的汉逊酵母株系的限制，传统的工业生产往往不能满足市场需求。
基因组工程技术的引入为解决这个问题提供了可能。
通过分析汉逊酵母的基因组并选择性地修改某些关键基因，我们可以改变其代谢途径，使其具备产生特定化合物的能力。
首先，我们可以通过转基因技术引入甘油产生途径的关键基因，提高汉逊酵母对甘油的生产能力。
甘油是一种重要的化学品，广泛应用于制药、化妆品、食品等行业。
通过增加甘油合成途径的代谢能力，我们可以获得更高产量和更高纯度的甘油，满足不同行业的需求。
此外，汉逊酵母的基因组工程还可以应用于紫杉醇的生产。
紫杉醇是一种重要的抗癌药物，具有抗肿瘤活性。
传统的紫杉醇生产通常依赖于从紫杉树提取，成本高昂且供给不稳定。
然而，通过将紫杉醇合成途径的关键基因引入到汉逊酵母中，我们可以改变其代谢途径，使其能够直接合成紫杉醇。
这种基因组工程的方法不仅可以节约生产成本，还可以提供稳定的供应，满足紫杉醇的医药需求。
当然，在利用基因组工程技术改造汉逊酵母生产甘油和紫杉醇的过程中，我们也面临着一些挑战。
首先，我们需要深入了解汉逊酵母的基因组和代谢特点，确定哪些基因是关键的，并选择合适的启动子和表达载体。
紫杉醇发酵研究进展
由 于市 场 需 求量 大 ， 用 微 生 物 发 酵 生产 紫杉 醇是 解 决 药 源 问题 的 有 效 途 径 ， 时 有 利 于 对 红 豆 杉 这 种 珍 贵 利 同 树 种 的 保 护 。笔 者 对 微 生物 发 酵 生 产 紫 杉 醇 的 最 新 研 究进 行 了 全 面 综 述 。
萜类衍 生 物 ， 当前 公认 的广谱 、 是 活性 强 的抗癌 药 物 之一 。紫杉 醇 主 要用 于治 疗 卵 巢 癌 和 乳 腺 癌 、 对肺 癌 、 肠 癌 、 色 素瘤 、 颈 部 癌 、 巴 瘤 、 大 黑 头 淋 脑 瘤 也 都有 一 定疗 效 。紫杉 醇 最早 是 Ｗａ ｉ １于 ｎ 等ｒ ］
关键词 ： 杉醇； 酵 ； 紫 发 内生 真 菌 ； 量 产
紫 杉 醇 （ ａｌ ａ ｅ ， 品 名 Ｔａ ｏ） 一 种 二 ｐ ｃ ｔｘ ｌ商 ｉ ｘ １是
孢 属 （ ｅ ｔｌｔ ｐ ｉ ｍｉ ｏ ｐ ｒ ） 树 状 多 节 孢 Ｐ ｓａｏｉ ｓ ｃ ｓ ｏ ａ 、 ｏ ｓ ｒ
（ ｄ ｚ ｐ ｒ ｍ ｙｖｆｒ ） 镰 刀 菌 属 （ ｕ ａｉ Ｎｏ ｕｉ ｏ ｉ ｓ ｌｉ ｍｅ 、 ｓ ｕ ｏ Ｆ ｓｒ —
万 ｋ ｇ红 豆杉 树 皮才 能 提 取 １ｋ ｇ紫 杉醇 原 料 药 ，
而 且最 大 问 题 是 这 种 做 法 会 毁 灭 大量 红 豆 杉 树 木， 并破 坏环 境 ， 以 ， 护红 豆杉 资源 ， 所 保 寻找 新 的
ｍｌ发 酵 周 期 １ 。筛 选 出最 佳 碳 源 为 葡 萄 糖 ， ， ２ｄ 最佳 氮源 为 硝 酸铵 。在上 述 条 件 下 发 酵 ， 杉 醇 紫
陕
西
农
业
科
学
紫 杉 醇 发 酵 研 究 进 展
抗癌药物紫杉醇的研究进展
优点：1、摆脱自然因素，可长期稳定 生长 2、适应市场、方便调节 3、成分简单，有利于分离纯化 4、成本低、生长周期短 5、为半合成提供原料 6、有望工业化生产 缺点：1、产量低、不稳定 2、工业化放大研究
红豆杉生物合成途径基本明确 10种相关酶基因被克隆表达 利用基因工程手段改造红豆杉提高紫杉醇产量
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紫杉醇开发的关键问题
上游产业——药源问题 下游制剂产业
药效（活性、水溶性） 安全性 生物相容性
药源问题
红豆杉
主要原料植物 国家一级保护野生植物，全球十大濒危物种 之一
抗癌药物紫杉醇的制备、抗癌机理和应用前景
抗癌药物紫杉醇的制备、抗癌机理和应用前景摘要紫杉醇具有显著的抗癌活性和独特的作用机理，现主要用于治疗晚期乳腺癌和卵巢癌等。
紫杉醇分子结构复杂，具有特殊的三环[6+8+6]碳架和桥头双键以及众多的含氧取代基，其全合成引起国内外许多有机化学家的兴趣。
本文简述紫杉醇的制备、抗癌机理和不良反应。
关键词紫杉醇制备抗癌机理不良反应紫杉醇（Taxol）是从短叶红豆杉树皮中分离得到的一种四环二萜化合物。
1992年12月29日美国FDA正式批准紫杉醇作为治疗晚期卵巢癌的新抗癌药物。
由于该药疗效确切、副作用小，在美国上市后销售情况一直很好，并保持着20％以上的年销售增长率。
2000年该药的销售额已超过10亿美元。
紫杉醇被当今世界上公认为广谱、活性最强的抗癌药物，尤其是对子宫癌、卵巢癌、乳腺癌具有特殊的疗效，它的问世被誉为20世纪90年代国际上抗癌药三大成就之一[1]。
美国FDA已原则上同意其他国家及厂家生产紫杉醇制剂并可以作为通用名药上市，这就打破了美国施贵宝公司对该药的垄断生产。
这一决定意味着紫杉醇制剂价格将大幅下降，从而有利于广大肿瘤患者服用。
然而由于这种天然化合物资源极其有限，严重的限制了其研究和应用的进度。
同时尖锐的供需矛盾也在医学、化学和植物组织培养领域的科学家中引起了一场非同寻常的广泛研究，以增加这种化合物的来源和寻找高效、低毒、来源丰富的紫杉醇类似物。
经过40多年努力，已经取得了可喜的进展。
1紫杉醇的制备1.1天然红豆杉植物提取[2，3]紫杉醇的直接来源是从天然植物红豆杉树皮、树叶中提取。
但并不是所有品种的红豆杉树均含有紫杉醇，而且不同种类的红豆杉紫杉醇含量的多少差别非常明显。
红豆杉属植物共11种，我国有4种及1种变种，它们分别是云南红豆杉、西藏红豆杉（又名喜马拉雅红豆杉）、中国红豆杉、东北红豆杉、南方红豆杉（又名美丽红豆杉）。
紫杉醇在不同植物来源以及植物体不同部位的含量与提取分离有着直接关系。
Vidensek对东北红豆杉幼苗以及成树的不同部位中的紫杉醇含量作了分析，结果表明，成树紫杉醇的含量高低依次为：树皮>树叶>树根>树干>种子>心材。
紫杉醇的发酵法生产工艺流程
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有人估计，治疗一个卵巢癌患者需要6 棵树龄60~ 100 年的红豆杉树。但紫杉 醇已经广泛使用, 并成为抗肿瘤的主流药物之一。对紫杉醇的需求越大，对红 豆杉树和环境都会造成严重的伤害。后来，人们发现了微生物发酵法
二 微生物发酵法生产紫杉醇的技术路线
• 实验材料 罗汉松的树皮 • 实验方法
1 内生真菌分离 2 内生真菌纯化、鉴定与保存 3 发酵培养 4 发酵产物的处理 （紫杉醇的提取、纯化、含量测定）
1 内生真菌分离
• 1）对植物组织表面进行消毒, 以控制表生真菌的 生长, 使内生真菌得以分离。其分离方法是先用水 冲洗已剪碎的植物材料, 然后在75%乙醇中浸泡 3min 后,最后用无菌水冲洗。 • 2）分离所用的培养基为PDA 培养基。为了防止 细菌污染可在培养基中加抗菌素, 如链霉素、四环 素等。温箱中28 ℃培养3-4 d 后观察. • 在分离内生真菌时常添加一些宿主植物的提取液， 以满足内生真菌的一些特殊的营养需求
• 预期结果
• 从罗汉松树皮中成功筛选出一株产紫杉醇 的内生真菌菌株。
微生物发酵法生产紫杉醇的优势
• • • • • 内生真菌能在简单的培养基上良好生长 产生大量的发酵产物 发酵周期短 可以在生物反应器中人为控制各种参数 可通过诱变育种等手段来提高菌种性能， 以提高紫杉醇产量
微生物发酵法生产紫杉醇 面临的困境
（二）优化发酵条件
3.添加代谢产物的抑制剂
真菌的次生代谢产物十分丰富，估计有 3,000 多种，如果研究清楚紫 杉醇与其他次生代谢物之间合成关系，对人为抑制其他次级代谢物的合 成，能有效促进紫杉醇的生物合成量
4.添加诱导物
诱导子是一类可以引起代谢途径改变或强度改变的物质，包括植物激 素、无机离子、多糖、真菌培养物等
（Байду номын сангаас）优化发酵条件
1.培养基和培养条件的优化
依据不同产紫杉醇真菌的生长条件，选择合适的培养基，发现最佳发 酵条件，以期提高紫杉醇的产量
2.添加紫杉醇合成的前体物质
加入前体一方面可通过增加底物量来加快反应速度和提高产率，另一 方面还能够反馈抑制分支路径而促进反应顺利进行，有效提高紫杉醇产 量。如：钠不仅能掺入到乙酰基，而且能掺入到苯环及紫杉烷骨架中， 是紫杉醇合成的有效前体
• （1）缺乏良好的适合发酵的工业菌株
• （2）由于发酵条件的限制，单位培养液中 紫杉醇的含量低
三 提高内生菌紫杉醇的产量的方法
（一）改良菌种
1. 利用常规的诱变改良菌种
2. 利用原生质体融合改良菌种 3. 利用基因工程构建工程菌
分离紫杉醇合成代谢酶类和获得它们的 cDNA 克隆，将已经构建的携 带紫杉醇合成途径关键酶基因的真菌表达载体转入高产紫杉醇内生真菌中， 获得高产紫杉醇工程菌株
紫杉醇发现到临床应用大约经历了30 年的时间。
注：紫杉醇是一种复杂的具有抗癌活性的三环二萜类生物碱。
紫杉醇的作用机制
它作用于细胞微管，通过与微管蛋白N端第31位 氨基酸和217~231位氨基酸结合，诱导和稳定微管 蛋白聚合，抑制其解聚，增加聚合程度，使维管束 不能与微管组织中心相互连接，将细胞周期阻断于 G2/M期，导致有丝分裂异常或停止，阻止癌细胞 增殖或肿瘤体积逐渐缩小。
（三）与 “前提内生真菌”一起培 养
如产紫杉醇合成前体 10-去乙酰巴卡亭 III
和巴 卡亭 III 的内生真菌
微生物发酵法生产抗癌药物紫杉醇
一、紫杉醇的概况和作用机制
二.微生物发酵法生产紫杉醇的技术路线 三.提高内生菌紫杉醇的产量的方法
一、紫杉醇的概况和作用机制
红 豆 杉 树
紫杉醇（Paclitaxel,商品名Taxol）的概述：
1963年美国化学家瓦尼（M.C. Wani）和沃尔（Monre E. Wall） 首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（Pacific Yew） 树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。
高效液相色谱( HPLC)
• HPLC 是最常用的、较为有效的分析检测方 法。HPLC 不仅可以测定紫杉醇含量, 而且 还能追踪分离紫杉醇。
• 色谱条件：惠普1100系列，采用XDB-C18色谱柱 (4.6mm×250 mm，5μm)，流动相为甲醇与水混 合物(V甲醇:V水=65:35)，柱温为25℃，波长为 227 nm，流速1.0 mL/min，进样量10μL。用紫杉 醇标准品做对照。
• 2）紫杉醇的纯化
紫杉醇的纯化多采用色谱法。已报道的用于紫杉醇 分离的方法除薄层色谱法、柱层析法外还有胶束 电动毛细管色谱法、高速逆流色谱法、树脂吸附 分离法、膜分离法、沉淀法、化学反应法和药理 作用靶点法 。
• 3）紫杉醇含量测定
真菌发酵液中紫杉醇的定量可采用薄层色谱(TLC) 、 高效液相色谱( HPLC) 、UV 免疫分析、生物学方 法和放射性前体标记等。
2 内生真菌纯化、鉴定与保存
待培养基上初步长出菌落后，选择长势较好 的菌落，挑取菌丝到PDA平板上纯化，根 据经典形态学方法鉴定菌种。纯化的菌株 在PDA斜面4℃下保持，备用。
3 发酵培养
• 从PDA 平板上切取5 mm × 5 mm 小块菌 落,接种至装有150 mL 液体培养基的500 mL 三角瓶中, 于28 ℃ , 100 r/ min 摇床上 振荡培养10-14 d.
4 发酵产物的处理
1）紫杉醇的提取 • 常用的有机溶剂：甲醇、乙醇、氯仿、二 氯甲烷、乙酸乙酯等 • 提取原则：能够充分萃取出发酵液和菌丝 中的紫杉醇 • 具体方法：
• 发酵液过滤后, 菌丝研磨（加适量石英砂），滤液 称量体积。 • 滤渣烘干( 低于50℃) ,滤渣用适量乙酸乙酯萃取, 滤液用1/2 滤液体积的乙酸乙酯萃取( 30min) , 下 层水层再用乙酸乙酯萃取一次, 合并乙酸乙酯,减 压蒸馏。 • 用适量甲醇洗涤减压蒸馏得到的固体, 再用正己烷 洗涤15min, 收集下层甲醇, 加入乙酸乙酯和水( 1： 1) 进行萃取( 30min) , 将收集的乙酸乙酯进行减 压蒸馏, 用一定量的乙腈洗下固体, 0 ℃密封保存。
1971年Wall 和Wani将粗提物进行纯化，并确定了其化学结构（一 种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇（taxol））。
2001 年Huang Q 等通过实验获得紫杉醇生物合成的重要中间产物 紫杉二烯( Taxadiene, 产量达13mg/L) , 成为基因工程菌合成紫 杉醇中间体的先例。
那么人们根据紫杉醇作用机制，研究出来紫杉醇能治疗什么疾病呢？
紫杉醇的临床作用
紫杉醇有抗肿瘤、抗癌作用。可治疗卡波济氏肉瘤(一种艾滋病人 特有的恶性肿瘤)、直肠癌、膀胱癌和转移性乳腺癌等一系列的棘手 肿瘤 ；可治疗卵巢癌、肺癌。 紫杉醇具有抗类风湿性关节炎、抗疟的作用, 对中风、早老性痴呆 和先天性多囊肾病、头部和颈部肿瘤、恶性黑色素癌和肉瘤等, 均展 现出一定疗效。