脂肪酶的技术开发及其应用

脂肪酶的技术开发及其应用

一.脂肪酶

脂肪酶(LipaseEC3．1．1．3甘油水解酶)是一类特殊的酰基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。同时还催化其他一些水性酯类的水解(Hydrolyze)、醇解(Alchoholysis)、氨解(Aminolysis)、酯化(Esterification)、转酯化(Transesterification)以及酯类逆向合成反应。

(1)水解反应： RCOOR’+H20¨RCOOH-4-R’OH

(2)合成反应：

A 酯化：RCOOH+R’OH----RCOOR’+H20

B 酯交换：RCOOR'+R”COOR----RCOOR+R”COOR’

C 醇解：RCOOR’+R”OH---- RCOOR7’+R’0H

D 酸解：RCOOR％R”COOH----R”COOR“RCOOH

脂肪酶广泛存在于动植物与微生物当中。动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织等。而植物中含脂肪酶较多的是油料作物种子。

目前脂肪酶的生产方法有提取法和微生物发酵法。

由于微生物脂肪酶具有种类多、比动物脂肪酶具有更广的作用pH和作用温度范围、便于进行工业生产和获取高纯度制剂等优点而得到广泛应用，特别是在油脂化工和有机合成工业中，酶催化的反应具有条件温和、耗能低、原料要求低、成品质量高等优点。尤其是l，3专一脂肪酶可用于特殊脂肪酸、单甘酯的合成及立体选择性化学合成和拆分，具有巨大应用潜力。因此微生物脂肪酶已经成为生产脂肪酶的主要来源，关于微生物脂肪酶在工业上的生产也越来越多。

二．微生物脂肪酶

微生物脂肪酶的生产：

以微生物为来源生产脂肪酶较动植物更具有巨大的潜力和优势。目前，国内外微生物脂肪酶的研究、生产和应用都取得很大的进展。

产脂肪酶的微生物共65个属，其中纲菌28个属，放线菌4个属，酵母菌10个属，其他真菌23个属(Jaeger 1994)。随着发现范圈的不断扩大，脂肪酶获得和制备的手段也产生了显著变化，从动植物提取到微生物纯种培养再到目前新兴的体外设计，重组表达。

经近20年来的深入研究，能应用于工业生产的微生物脂肪酶种类不断增加，目前已遍及细菌、酵母及霉菌各大类中，最近公布的36种不同来源的商业化脂肪酶中有19种来源于真菌，8种来源于细菌。我国微生物脂肪酶的生产，就目前而言，碱性脂肪酶仅绿微康独家生产，假丝酵母产中性脂肪酶也仅l、2家，绿微康碱性脂肪酶罐上发酵单位可稳定在6000u／ml左右，产品酶活可由几千吨到几万吨，甚至更高。我国微生物脂肪酶已实现产业化，虽然目前生产量还低，但已在诸多产业中逐步推广使用。由于价低质优，在国际市场中极具竞争力，绿微康已首次实现我国碱性脂肪酶的出口，而且份额正在逐步扩大之中．

三．提高脂肪酶产量

要提高脂肪酶的产量的途径主要有两个：育种改良和发酵工艺优化。

(1)育种改良

育种改良主要途径有：育种驯化、诱变育种和基因工程菌改造等。

A.育种驯化：通过贫瘠培养驯化和定向诱导可使产酶菌株对简单的底物的利用能力增强，一定程度提高菌株的产酶活力。它也是退化菌种复壮的常用手段之一。

B.诱变育种：此方法是微生物改良的常用方法。在具体的研究实践中，常见的诱变因子有低温、紫外线(UV)、Co—r射线以及溴化乙锭、胆盐、制霉菌素、克霉唑、琥珀酸钠、柠檬酸钠、丁酸、己酸、三丁酸甘油酯、NTG、亚硝基肌和盐酸轻胺等。据有关研究表明，不同的诱变因子处理同一菌株的效果存在较大差异。通过诱变因子Uv、Co-r射线、NTG对扩展青霉(Penicillium expansum)S一14菌株进行单因子诱变(韦裕萍，1999)研究比较发现，NTG处理的效果最佳，Co．r 射线次之，UV最差：另外，据对黑曲霉、假单胞菌、酵母等多种产脂肪酶微生物菌株的诱变研究报道，复合因子诱变法较单因子诱变法具有更好的诱变效果，常可以将脂肪酶产量提高1～10倍，’最高可达40倍(Destain，1997)(舒正玉，2007)(李江华，1999)(Tan，2003)。

C.基因工程法

传统诱变法虽然是一种操作简单、技术成熟的好方法，但比起现代基因程法，在微生物的育种中存在一定的局限，难以获得突破性进展。随着生物科技的不断进步，基因工程法用于产脂肪酶微生物的育种技术正逐渐成熟并已经用于研究和生产实践。

目前，基因工程在产脂肪酶细菌育种中的应用主要是通过克隆相应的脂肪酶基因，然后在异源宿主菌中实现大量表达。常用的异源宿主主要有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和蓝霉表达系统三种。其中曲霉表达系统由于其强大的分泌能力和成熟的发酵技术而得到生产者的青睐，并成功地用于生产实践。

由于异源表达常常受限于宿主菌的修饰系统、密码子的偏爱性、翻译后修饰等对外源基因的兼容性，使得外源基因在宿主菌中不一定能成功实现大量的表达或活性的表现。从而限制了该技术大范围成功的应用。

脂肪酶基因的克隆是构建脂肪酶工程菌的基础，虽然国内外许多工作者都在不断的努力，但是目前基因工程菌在生产实践中的运用仍然很少。因此，通过基因工程从根本上降低生产成本，促进脂肪酶相关产业的发展虽然切实可行，但仍然需要更多的科研工作者的加入和坚持不懈的努力和研究。尽管理论或者技术

上都还存在许多有待解决的问题和困难，但基因工程技术的介入，客观上给微生物脂肪酶的产业化研究开辟了一个充满希望的崭新世界。

（2）发酵工艺优化

优化的生物品种从实验水平到工业化生产首先要解决的是生物过程的放大。

放大优化包括培养基与发酵条件的优化、发酵的培养方式与发酵调控等。（3）提高脂肪酶的利用率

在脂肪酶的固定化方固定化酶由于其自身的一此优越性，固定化酶的优点在于：①催化效率高；②酶的费用较低；③酶不会进入产物中；④提高了酶的稳定性；⑤改善了酶的行为；⑥可连续加工，因而能更好地控制产品质量；⑦有利于多酶系统的利用。

传统脂肪酶的固定化方法主要包括物理吸附(曹国民，1997)、包埋以及交联法和共价固定法四种，其中物理吸附、包埋法(鲁玉侠，2001)为物理法，该法不但操作简单、成本低，而且由于酶分子与固定化载体间没有发生化学反应，所以对酶活性的影响较小；可美中不足的是，物理固定法不能有效地实现酶分子与载体牢固的结合，以至于酶分子容易脱离载体，从而严重影响固定化酶的稳定。

固定化是有效提高酶稳定性的措施和方法，但无论是哪一种固定化方法都有它一定的缺陷和局限性。随着酶工程的发展，“脂肪酶分子的改造”一种新的、有望解决天然脂肪酶蛋白由于具有遇热不稳定、易为蛋白酶降解、与一些表面活性剂不相容等一系列缺陷的方法被提出来。目前，这方面的研究还主要集中在国外。国外学者对脂肪酶分子进行改造的技术策略主要有两种：一是理性设计方法，如基因定点突变等；二是定向进化技术策略。前者必须建立在获得酶的分子结构、结构与功能之间的关系以及氨基酸残基功能等方面的信息的基础上，结合定点突变等技术对酶分子进行改造。然而，脂肪酶分子中氨基酸残基之间具有相互作用，某一个或几个特定氨基酸的替换，往往达不到预期的效果。而后者则不需要脂肪酶分子准确的结构信息，仅仅通过随机突变、基因重组和定向筛选等方法就可对其进行定向的分子改造，大大增强了该法的可行性，不过定向进化法也有其不足，因为设计出一种高效的突变体筛选方法是相当不容易的。因此，目前绝大多数脂肪酶性质分子水平上的改造均结合使用了以上两种方法(唐良华，2003)。

目前国内外的研究重点主要集中在固定载体的选择与固定条件的优化上。Ore等研究了来源于Burkholderia cepacia和Pseudomonas cepacia的商业脂肪酶制剂，固定化于二氧化碳超临界技术干燥的石英纤维气凝胶中，催化向日葵油与乙酰甲酯合成生物柴油。姜绍通等以高吸水树脂为载体，采用物理吸和戊二醛交联的方法固定脂肪酶，研究结果表明，固定化后酶活力比游离状态活性提高两倍以上，且稳定性也提高了。。TAN等在大孔树脂上吸附固定化脂肪酶，酯转化率可达97.3%，在使用19次之后依然可达到70.2%。在工业生产中，酶能够重复使用次数越多，使用周期越长，表明酶的稳定性

就越好，工业生产的成本就越低。

（4）高密度发酵

高效的表达手段是获得足够量目的产物的关键，而合适的发酵工艺则是基因工程产业化的关键。世界各地的实验室在多年研究中，获锝了不少性质优良的基因工程产物，但其中能够实现真正产业化的却是风毛麟角，除去环境因素和条约限制等影响，最主要的制约因素就是基因工程产物从实验室规模到实际生产规模