农杆菌介导的苹果炭疽叶枯病菌遗传转化及插入突变体的筛选_张俊祥

基金项目：本研究由现代苹果产业技术体系建设项目(CARS-28)和农业部公益性行业(201203034)共同资助
基因组学与应用生物学 1262
Genomics and Applied Biology
reduced, transformants M285 and M744 lost the ability of pathogenicity, transformants M598 and M856 lost the capability of sporulation and pathogenicity. ATMT of Glomerella cingulata was established and optimized. The green fluorescent protein (GFP) tagging insertional mutant population of G. cingulata was established, and some sporulation and pathogenicity deficient transformants were obtained. Keywords Colletotrichum, GFP, Conidia, Virulence, A grobacterium tumefaciens-mediated transformation
Dong Qinglong
Zhou Zhongshan **
Abstract Glomerella cingulata, an ascomycetous fungus, can cause glomerella leaf spot of apple. This study aimed to establish and optimize the A grobacterium tumefaciens-mediated transformation (ATMT) of G. cingulata, and obtain the conidiation and pathogenicity mutants, and to provide new insights into the molecular mechanisms of conidiation and pathogenicity, as well as efficient strategy of disease control in G. cingulata. Single factor test was conducted on transformation efficiency experiments of G. cingulata with ATMT, respectively. Transformants were determined by PCR amplification and green fluorescent detection by using fluorescent microscope. Mycelium growth rate and sporulation of transformants were measured after incubation on PDA plate, and
Research Institute of Pomology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Xingcheng, 125100 * These authors contributed equally to this work ** Corresponding author, zszhouqrj@163.com DOI: 10.13417/j.gab.033.001261
苹果炭疽叶枯病菌野生型菌株 W16 在含有潮霉 素 B 的 PDA 平板上(50 滋g/mL)生长缓慢，培养 7 d 后 菌落直径为 1 cm；在含有 75 滋g/mL 的潮霉素 B 平 板上，只有稀疏的菌丝生长；在 100 滋g/mL 及以上浓 度的 PDA 平板上，病菌不能生长。因此，转化子筛选 的潮霉素 B 浓度定为 100 滋g/mL。在农杆菌对氯霉素 和氨苄青霉素混合使用的敏感性测定中，100 滋g/mL 氯霉素和 100 滋g/mL 氨苄青霉素混合使用，平板放 置 3 d 后，无菌落出现，继续放置至 7 d，仍无菌落出 现。因此，转化子筛选的氯霉素和氨苄青霉素混合使 用的浓度定为 100 滋g/mL。
1.2 苹果炭疽叶枯病菌 ATMT 的优化
al., 2000)转移到植物基因组中，也可以转移到酿酒 酵 母 (Saccharomyces cerevisiae ) 基 因 组 中 。 从 此 ， ATMT 在真菌研究中得到了广泛的应用(Michielse et al., 2005)。相比真菌的其 它遗传转化方法 (Minz and Sharon, 2010)，ATMT 的一个优势是能以孢子、 菌丝和子实体等作为介导材料，且 T-DNA 在真菌转 化子基因组中多为单拷贝插入(Michielse et al., 2005)； 另一个优势是 T-DNA 介导到基因组后，其侧翼序列 (flanking sequences)是部分保守的，因此 ATMT 突变 的基因能通过 TAIL-PCR (thermal asymmetric interlaced PCR)来鉴定和克隆(Rolland et al., 2003; Michielse et al., 2005; Singer et al., 2012)。
pathogenicity was detected after inoculation on apple cultivar Gala. The results showed that the optimal ATMT conditions were: preliminary induction culture for 4 h, filter paper used for culture membrane, concentration of acetosyringone for 50 滋mol/mL, A grobacterium tumefaciens OD600=0.30, concentration of conidia for 1伊106 CFU/mL, 21℃, co-culture for 24 h. A total of 350~400 hygromycin-resistant transformants could be obtained to form 106 conidia under the optimized conditions. It was proved that the hygromycin-resistant gene and gfp gene were integrated to genome of G. cingulata by PCR amplification and green fluorescent detection. Preliminary results of conidiation and pathogenicity on Gala leaves identified that virulence of transformants M421, M755 and M903
delicious)等苹果品种的叶片，造成苹果落叶。该病菌 致病型缺陷突变子。
也可侵染幼果，百度文库实近成熟时开始发病，贮藏期仍可
继续发展，因此造成采收前大量落果和贮藏中烂果， 1 结果与分析
导致严重的经济损失。 围小丛壳菌能产生一系列特定的侵染结构，包
括芽管、附着胞、侵入钉和次生死体营养型菌丝。因 此，该菌成为研究植物病原真菌与寄主互作非常理 想的模式菌之一(Perfect et al., 1999)。深入研究该菌 的致病分子机理，探讨该菌与寄主植物互作过程中 的识别因子及调控基因，不仅能够解析该菌为何只 侵染嘎拉、金冠等苹果品种的叶片，而对富士等苹果 品种的叶片无侵染能力，也将对其它植物病原真菌 的致病机理研究提供重要的参考信息。
基因组学与应用生物学，2014 年，第 33 卷，第 6 期，第 1261-1267 页 Genomics and Applied Biology, 2014, Vol.33, No.6, 1261-1267
研究报告 Research Report
农杆菌介导的苹果炭疽叶枯病菌遗传转化及插入突变体的筛选
长期以来，农杆菌基因介导技术(ATMT)一直用 于植物基因的转导与打靶(Tinland, 1996)。直至 1995 年，Bundock 等(1995)报道 ATMT 技术不仅能将农 杆菌的 T-DNA (part of plasmid-borne DNA) (Zupan et
1.1 供试菌株对抗生素的敏感性测定
苹 果炭 疽叶 枯 病 是 由 围 小 丛 壳 菌 (Glomerella 叶枯病菌进行遗传转化，获得高效率的转化体系，
cingulata)引起的一种苹果重要叶部新病害(Wang et 进一步构建该病菌的绿色荧光蛋白(green fluorescent
al., 2012)。病原菌主要为害嘎拉(gala)、金冠(golden protein, GFP)标记的突变体库，获得分生孢子形成和
大多数研究表明，许多参数影响到 ATMT 的转 化效率，包括真菌的种类、农杆菌菌株、转化材料(孢
本试验首先以预诱导时间(均为 4 h)、共培养时 间 48 h、AS 浓度 200 滋mol/mL、农杆菌浓度 OD600= 0.20、分生孢子浓度 1伊106 个 /mL 和介质(玻璃纸)为 基本参数，测试共培养温度对转化效率的影响。结果 显示(图 1A)，在 19~27℃，均可获得转化子，21℃转 化效率显著高于其它温度。因此，确定 21℃为最佳的 共培养温度。在接下来的其它因子测试中，以前因子 已确定的最优条件下进行。筛选出单因子的最高转 化效率，分别为 AS 浓度 200 滋mol/mL (图 1B)、农杆 菌浓度为 OD600=0.6 (图 1C)、共培养时间 72 h (图 1D)、 分生孢子浓度 1伊106 个 /mL (图 1E)和硝酸纤维素膜 (图 1F)。
张俊祥 * 吴建圆 * 冀志蕊 迟福梅
中国农业科学院果树研究所, 兴城, 125100 * 同等贡献作者 ** 通讯作者, zszhouqrj@163.com
蒋晓玲
董庆龙
周宗山 **
摘 要 围小丛壳菌，一种子囊菌真菌，能引起苹果炭疽叶枯病。本研究的目的是建立和优化农杆菌介导的 苹果炭疽叶枯病菌遗传转化技术体系，获得产孢与致病性变异的突变体，为开展该菌的分生孢子形成机制、 致病机理研究奠定基础。对影响转化效率的主要因子进行单因子条件测验，对转化子进行 PCR 鉴定、绿色荧 光观察和产孢及致病性分析。优化的遗传转化体系：预诱导 4 h，培养介质滤纸，分生孢子浓度 1伊106 个 /mL， 农杆菌浓度 OD600=0.3，乙酰丁香酮浓度 50 滋mol/mL，21℃，共培养时间 24 h。利用这一体系，每 106 个分生 孢子能产生 350~400 个转化子。通过转化子潮霉素抗性基因的 PCR 检测和荧光观察，证实潮霉素抗性基 因和 gfp 基因已成功整合到该病菌基因组中。产孢和致病性检测结果显示，转化子 M421、M755 和 M903 致病力明显下降，转化子 M285 和 M744 丧失了致病能力，转化子 M598 和 M856 丧失了产孢能力和致病 能力。本研究建立和优化了农杆菌介导的苹果炭疽叶枯病菌遗传转化技术体系，构建了该病菌的绿色荧光 蛋白标记的突变体库，获得了产孢与致病性变异的转化子。 关键词 炭疽菌, GFP, 分生孢子, 毒力, 农杆菌介导的遗传
A grobacterium tumefaciens-mediated Transformation of Glomerella cingulata and Screening Pathogenicity-deficient Mutants
Zhang Junxiang * Wu Jianyuan * Ji Zhirui Chi Fumei Jiang Xiaoling