植物组织培养技术

植物组织培养技术(国培)训练方案

一、主要训练内容

1. 组培实验室和组培工厂的设计；

2. 母液的配制（大量元素、钙盐、微量元素、铁盐、有机物）；

3. 培养基的配制（配制流程、定容、调节PH值、分装、封口、灭菌）；

4. 外植体灭菌(取材与处理、灭菌)；

5. 无菌接种技术；

6. 液体培养技术;

7. 常见问题的处理（诱导培养、分化、增殖培养、生根培养等出现问题与解决措施）；

8. 驯化移栽技术。

二、训练时间安排

7月18日上午：1. 组织培养技术流程简介；

2. 组培实验室和组培工厂的设计；

3. 母液的配制；

7月18日下午：4. 培养基的配制；

7月19日上午：5. 外植体灭菌；

7月19日下午：6. 无菌接种技术；

7月20日上午：7. 液体培养技术;

8. 常见问题的处理；

7月20下午：9. 驯化移栽技术。

三、主要训练内容要点

（一）植物组织培养技术流程简介

植物组织培养是指分离一个或数个体细胞或植物体的一部分在无菌条件下培养的技术。通常我们所说的广义的组织培养，是指在无菌条件下，将离体的植物器官（根、茎、叶、花、果实等）、组织（形成层、花药组织、皮层、胚乳等）、细胞（体细胞和生殖细胞）以及原生质体（即外植体），培养在人工配制的培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其长成完整的植株。

狭义概念：指对植物体组织或由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养直至生成完整植株。

广义概念：无菌操作分离植物体一部分（即外植体）接种到培养基上，在人工条件下培养直至形成完整植株。

植物组织培养的理论基础是细胞全能性。所谓细胞全能性是指一个完整的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息。

即：细胞具有形成完整植株的潜在能力，给其适宜的条件就能形成一个完整的植株。

特定条件：①不受母株控制的完整离体细胞；②特定的培养条件，包括营养、激素、光、温、气、湿等因子。

植物体愈伤组织

脱分化

再

分

化

完整植株不定器官或体细胞胚

1. 选择要培养的植物，查找相关资料，制定培养方案；

2. 准备培养基以及相关器材、灭菌材料等；

3. 外植体处理与灭菌---获得无菌材料；

4. 初代培养（诱导培养）；

5. 继代培养（增殖培养）或分化培养；

6. 生根培养；

7. 驯化移栽。

（二）实验室设计

实验室设置的基本原则：科学、高效、经济和实用。必须满足3个基本的需要：实验准备（培养基制备、器皿洗涤、培养基和培养器皿灭菌）、无菌操作和控制培养。

总体要求是保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。

实验室的建设均需考虑两个方面的问题：一是所从事的实验的性质，即是生产性的还是研究性的。

由洗涤室、准备室、接种室、培养室等组成。

需要明确1. 实验室建设目标；2. 主要功能；3. 需要购置的仪器设备；4. 驯化车间。

（三）母液的配制

根据表分别配制MS各种母液：每种母液各种元素分别称取并分别溶解然后混合。

MS培养基母液的配制

铁盐：分别溶解冷却后，将铁加入EDTA中，反之易沉淀。

各种母液的每种药品分别溶解后混合、定容。

（四）培养基的配制

固体培养基是以琼脂做支持材料，90度以上溶解，40度下变成凝胶。在凝固前加MS的各种母液及激素等，配成MS培养基。

方法步骤：（1）按做1升培养基计，先倒入2/3左右的水，加热，称取5、5克琼脂入锅加热熔解，近开锅时，加入称好的30克蔗糖、肌醇，待琼脂溶化后，加母液(不断搅拌，防止糊底)[在加热时量取母液，然后按表，用量筒移取大量元素母液20ml，钙盐20ml，用专一对应的移液管分别吸取微量元素母液10ml、铁盐母液10ml、有机物母液5ml【母液量取时先在容器中加入适量的纯净水，防治药品之间发生反应】。]搅拌均匀——MS0{基本培养基}。然后加激素[按下表添加]。（2）培养基配好后，要调整pH值。用0．1M的KOH、NaOH或HCl液调成5．8pH值左右。在培养基配方不大变动的情况下可用经验法。可以将连续三次测定所加入的酸或碱液的平均值作为以后调整的用量值。调后注意一定要搅拌均匀，还要注意酸或碱液不要放置时间太久。（3）分装30ml/瓶左右，封口并标记。（4）灭菌（121度，20分钟）MS+BA0.3（月季初代培养专用，每人至少3瓶）

MS+BA0.5+NAA0.1；

MS+BA0.5+NAA0.2；

MS+BA1.0+NAA0.1。

单位：mg/L

(五)外植体灭菌（以月季为例）

月季茎段材料的选取，保存、处理、灭菌流程，切割、接种。

选取开花近凋零的月季花枝（此时花下第3 节[具有5片小叶的叶片]的腋芽比较饱满，待萌发）或者腋芽饱满的枝条，放入干净的塑料袋中，迅速带回室内放入冰箱保存或直接处理。

去掉枝条上的叶片，剪成单芽茎段或5cm左右长，流水冲洗10min或者纯净水洗刷干净，进入超静工作台，先用70%酒精浸泡10-20秒，再用0.1%氯化汞灭菌7—8分钟（加1-2滴土温），无菌水冲洗5次，每次1分钟；切去两端伤口，上端平口，下端斜口，正放接种到预先配制的培养基上（MS+BA0.3），每瓶放一块材料（视情况最多放3块），放入培养室，光照培养。（侧芽萌发1cm高后，能看到节间，即可接入生根培养基1/2MS+ NAA0.5，或进行增殖培养MS+BA1-2+NAA0.01-0.1，然后生根培养，根长0.5cm可以驯化移栽。

（六）无菌操作（接种）技术

提前打开超静工作台（紫外灯、风机）15-20分钟。

(1) 洗净双手，换好实验服；

(2) 上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后擦拭工作台面；