植物组织培养技术(一)

• 洗涤、灭菌室：完成各种器具的洗涤、 干燥、保存、培养基的灭菌等。
主要设备：水池、操作台、高压灭菌锅、 干燥灭菌器（如烘箱）等。
• 无菌操作室（接种室）：主要用于植物材料的消毒、接
种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一 切需要进行无菌操作的技术程序。
主要设备：紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接 种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）等。
• (2)B5培养基 是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要 特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得 知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。
• (3)White培养基 是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作 了改良，称作White改良培养基，提高了MsSO4的浓度和增加了硼素。其 特点是无机机盐数量较低，适于生根培养。
• ②生长周期短，繁殖率高 植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求 而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往20— 30d为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由 于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供
规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。
1 实验室设计原则：保证无菌操作，达到工 作方便，防止污染。
2 实验室组成：
化学实验室、洗涤菌室、无菌操作室 （接种室）、培养室、细胞学实验室。
• 化学实验室（准备室）：完成所使用的 各种药品的贮备、称量、溶解、配制、 培养基分装等。
主要设备： 药品柜、防尘橱（放置培养 容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度 计及常用的培养基配制用玻璃仪器.
• （4）N6培养基 是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。 其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用 于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。
离体的植物 脱分化 器官、组织、
细胞
愈 再分化 根 伤
组
织
芽
植 物 体
植物组织培养条件：
含有全部营养成分的培养基、一定的温度、 空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等。
植物组织培养特点
• ①培养条件可ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ人为控制 组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下 进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响， 且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。
植物细胞全能性的表达
• 脱分化（dedifferentiation)：将来自已分 化组织的已停止分裂的细胞从植物体部 分的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞 的分裂活性。
• 再分化（redifferentiation):经脱分化的组 织或细胞在一定的培养条件下可有转变 为各种不同细胞类型的能力。
植物组织培养过程
一、营养条件——培养基(culture medium) 培养基：是植物组织培养的重要基质。在离
体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不 同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对 营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的 特殊要求，它们才能很好地生长。因此，没有 一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器 官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找 到一合适的培养基，培养才有可能成功。
• 愈伤组织（callus）在人工培养基上由外植体上 形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。
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植物组织培养的理论基础——
植物细胞的全能性
• 植物细胞的全能性（totipotent)：植物细胞具有该植物 体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整 植物体的潜在能力。
• 原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的 全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部 基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具 有全能性。
应用领域
• 1、快速繁殖 运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几 万到几百万个植株。例如一株葡萄一年繁殖到3万多株，一株兰花 一年繁殖到400万株。 2、种苗脱毒 针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织 培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。已经取得成功的有马 铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。 3、远缘杂交 利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得 成功，从而育成一些罕见的新物种。比如辽宁果树研究所利用这 种方法获得苹果与梨的杂交种。 4、突变育种 采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、 抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。象中国林科院用逐 步加大培养基中盐的浓度，直接获得耐盐的杨树株系。 5、基因工程 基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后 必须通过组织培养途径才能实现植株再生。 6、生物制品 有些极其昂贵的生物制品，如抗癌首选药物--紫 杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。近年国内在红 豆杉组织培养中获得生长量高达0.49gFW/（gFW·d）的细胞系，
• ③管理方便，利于工厂化生产和自动化控制 植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、 营养、激素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动 化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培 等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可以
每升细胞培养物中紫杉醇的产量可达0.25mg。
植物组织培养的分类
• 外植体（explant)：由活体（in vivo)植物体上 提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组 织、器官等。
• 广义的组织培养依外植体不同，可分为：器官 培养（organ culture）、茎尖分生组织培养 (shoot tip culture,shoot apex culture,apical meristem culture)、愈伤组织培养(calluse cultrue)、细胞培养(cell culture)、原生质体培养 (protoplast culture)
大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。
第二章 组织培养实验技术
第一节 实 验 室
在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需 要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地 制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室 的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目 的，实验室规模太小，则会限制生产，影响效率。在 设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来没计， 避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培 养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件， 需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制 温度、光照、湿度等培养条件。
• 差异：（1） 受精卵的全能性最高 （2） 受精卵分化后 的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。
• 潜在全能性的原因：基因表达的选择性
• 科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定 的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能 表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现 的这一过程，就是植物组织培养。
培养基的种类
• 培养基有许多种类，根据不同的植物和培养部位及不同的 培养目的需选用不同的培养基。
• 培养基的产生最早是Sacks(1680)和Knop(1681)，他们对绿 色植物的成分进行了分析研究，根据植物从土中主要是吸收 无机盐营养，设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液， 至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。以后根据 不同目的进行改良产生了多种培养基，White培养基在40年 代用得较多，现在还常用。而到60和70年代则大多采用MS 等高浓度培养基，可以保证培养材料对营养的需要，并能生 长快、分化快，且由于浓度高，在配制、消毒过程中某些成 分有些出入，也不致影响培养基的离子平衡。
植物组织培养技术 Plant tissue culture
植物组织培养简介
定义：离体（in vitro)条件下利用人 工培养条件在无菌情况下培养、生长、 发育再生出完整植株的过程。
• 植物组织培养是二十世纪发展起来的 新技术，近三十年来由于组织培养基础 理论研究的深入，发展极为迅速，发表 的文献浩如烟海，几乎以植物为研究对 象的各个分支学科都在广泛进行组织培 养。
发展简史
• 1838-1839年，德国科学家Schleide 和Schwann发表了细胞学说， 奠定了组织培养的理论基础。 1902年，德国植物学家Haberlandt 根据细胞学说，提出单个 细胞的植物细胞全能性（totipotency）理论。 1904年，Hanning 最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。 1922年，Knudson 采用胚培养法获得大量兰花幼苗。 1934年，White 用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁 殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。 1958年，英国科学家Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织细胞 进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，不但 使细胞全能性理论得到证实，而且为组织培养的技术程序奠定了 基础。 1962年，Murashinge 和Skoog 在烟草培养中筛选出至今仍被 广泛使用的MS培养基。 1964-1966年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼陀罗花药培 养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。 1972年，Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得 了第一个体细胞杂交的杂种植株。……
• 培养室：培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根
据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空 间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火 的性能。
培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设5层，最 低一层离地高约lOcm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1．7m左右。 培养架长度都是根据日光灯的长度而设计， 如采用40W日光灯，则长 I．3m，30W的长lm，宽度一般为60cm。