LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测实验方法
细胞毒性检测方法总结!
细胞毒性检测方法总结！细胞毒性(cytotoxic)是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。
有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。
细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法：MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测一.LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等细胞增殖能力分析试剂原理：正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如MTT、XTT、WST-1等）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围，然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态优点：1）快速：96孔培养板形式，可进行高通量检测。
2）灵活：可直接通过显微镜观察，也可通过酶标仪进行定量检测。
二.荧光素发光法细胞生存能力检测原理：腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中，AK具有激活ADP 生成ATP。
当细胞受损后，细胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。
该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量进行检测。
特点： 1）简单、快速。
2）板式检测，可进行高通量。
三.LDH法细胞毒性检测原理：LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。
通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度特点：1）方法简单，安全，不使用放射性物质2）可进行高通量检测。
乳酸脱氢酶（LDH）测定-标准操作程序
三级文件标准操作程序第2页共3页生效日期：目的：建立乳酸脱氢酶（LDH）测定标准操作规程。
范围：适用于乳酸脱氢酶（LDH）测定的标准操作。
职责：生化部检验人员对本规程的实施负责。
规程：1 测定方法：乳酸脱氢酶在催化乳酸生成丙酮酸的同时将NAD+还原成NADH。
通过测定NADH在340nm处吸光度增加的速度可求得乳酸脱氢酶的活力。
LDHL-乳酸+ NAD+─────→丙酮酸+ NADH + H+2 仪器设备GS200全自动生化分析仪3 试剂3.1 乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒，包括试剂1（R-1）、试剂2(R-2)。
试剂成份含量R-1 L-乳酸锂≥76mmol/LR-2 NAD+≥31mmol/l3.2 分析用人基质质控血清（RANDOX）、血清3.3 试剂稳定性与贮存乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒在2-8℃避光保存可稳定一年；试剂R-1、R-2开启后在2-8℃避光保存可稳定一个月。
3.4 样本稳定性与贮存3.4.1 分析用人基质质控血清：该血清自生产之日起，在2-8℃下保持可稳定4年；该血清一旦复融，在25℃下可稳定24小时，在2-8℃下可稳定7天，在-20℃可稳定1个月。
3.4.2 待测血清：2-8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定3个月。
样本不可反复冻融。
不可使用已被污染的样本。
4 操作步骤4.1 打开全自动生化仪，按照GS200全自动生化分析仪操作维护保养程序，完成普三级文件准操作程序第3页共3页生效日期：通测试流程。
4.2 检验方法分析方法：速率A；主波长：340nm；副波长：405nm；样品量：8.0ul；R-1：320ul，R-2：80ul；校准方式：K因子；反应方向：上升；测定温度：37℃。
样本与R-1混匀后反应5分钟，加入R-2混合后延迟53秒，测定104秒。
样本8.0ul 主波长340nmR-1 320ul R-2 80ul 副波长405nm测光测光K=81990 5 6 8 min4.3 计算△A/min×Vt×1000ALT（U/L）= ─────────────6.22×Vs×d△A/min = 每分钟吸光度变化率Vt = 反应液总体积（ml）1000 =U/ml到U/L的转换系数 6.22 = NADH的毫摩尔吸光系数Vs = 样本体积（ml） d = 比色杯光径（cm）5 检验结果的解释抗坏血酸≤50mg/dl、游离胆红素≤684umol/L（40mg/dl），结合胆红素≤855umol/L （50mg/dl）、乳糜微粒≤2500浊度单位对测定无影响。
乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒一站式解决方案
乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒一站式解决方案乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LD 或LDH ，EC1.1.1.27 ）是一类NAD依赖性激酶，有LDHA、LDHB、LDHC三种亚基，可构成6种四聚体同工酶。
动物乳酸脱氢酶是由4个亚单位组成的四聚体，常见的A、B 两种亚基构成的5种LDH同工酶（LDH1-5），C亚基则仅组成一种LDH同工酶即LDH-C4。
乳酸脱氢酶为含锌离子的金属蛋白，分子量为135-140kD，是糖无氧酵解及糖异生的重要酶系之一，可催化丙酸与L-乳酸之间的还原与氧化反应，也可催化相关的α-酮酸。
LDH广泛存在于人体组织中，以肾脏含量最高，其次是心肌和骨肌。
红细胞内LDH约为正常血清的100倍。
一、乳酸脱氢酶分类1.根据结合辅酶的不同，微生物体一般包含两种乳酸脱氢酶，NAD-依赖型乳酸脱氢酶（NAD-dependent lactate dehydrogenases，nLDHs）和NAD-非依赖型乳酸脱氢酶（NAD-independent lactate dehydrogenases，iLDHs）两大类。
2.按其催化底物的构型不同，NAD-依赖型乳酸脱氢酶可以分为NAD依赖型-L-乳酸脱氢酶（L-NAD-依赖型乳酸脱氢酶）和NAD依赖型-D-乳酸脱氢酶（D-NAD-依赖型乳酸脱氢酶）两大类，分别催化丙酮酸合成L-乳酸和D-乳酸。
3.根据天然电子受体的不同，可以将NAD-非依赖型乳酸脱氢酶分为三类。
第一类为膜蛋白，利用膜醌类作为外部的电子受体；第二类直接利用O2作为电子受体，根据氧化终产物的不同，又将其细分为乳酸氧化酶（Lactate oxidase，LOX）和乳酸单氧酶（Lactate monooxygenases，LMO），其中前者产生丙酮酸和H2O2，而后者产生乙酸、CO2和H2O；第三类是硫胺b2（flavocytochrome b2），存在于真菌中，它天然的电子受体为细胞色素c。
LDH Assay 测定药物细胞毒性
LDH Assay 测定药物的细胞毒性（Promega The CytoTox-ONE分析法）A．试剂的准备：1、从-20冰箱中取出底物混合物及分析缓冲液置于4度箱溶解。
2、待混合物及分析缓冲液溶解后置于37度水浴箱中平衡5分钟。
以下过程，需避光操作3、向平衡后的底物混合物中加入11毫升分析缓冲液。
轻柔混合至底物完全溶化。
4、完全混合的溶液即为Reagent试剂，用1.5ml EP管分装，EP管事先已锡纸包裹。
每支EP管内分装约24孔用量，650ulReagent应避光保存，在-20度可保存4~6周B. 实验设计（48孔板）：1、每株细胞铺设24孔，三复孔设计，共8组。
2组无用药组，6组用药组2、无用药a组在LDH实验中作最大LDH释放对照组，b组作FREE对照组。
3、无用药组b在MTT实验中作FREE对照组C. 细胞毒分析流程：1、取出过夜培养处于对数生长期，90%满瓶的细胞，消化。
2、向消化后的细胞瓶内加入6 ml完全培养液，充分吹洗，混匀。
3、取细胞培养平皿，加入5ml完全培养液，并加入第2步中充分混匀后的细胞2~3ml。
混匀。
4、设置48孔板，并铺细胞5、每孔加入至终体积250微升6、37度培养箱中孵育过夜（按步骤3-5铺细胞，过夜细胞可达90%密度左右，不超过95%密度）7、给药方法：a、从-20 冰箱中取出TRAIL蛋白，于4度冰箱内溶解后，置于冰上。
b、按最大给药孔药物浓度计算全部实验孔所需药量体积，并用完全培养液稀释药物。
c、取出48孔板，更换2%FBS的完全培养液，其中2组对照孔中加入200ul，其余给药孔按计算好的给药体系分别加入不同体积的2%FBS的培养液。
d、按计算好的各用药组所需药量体系给药，总体系200ul。
轻柔混匀。
例子：95C，用药浓度50ng/ml 150ng/ml 300ng/ml 450ng/ml 600ng/ml 750ng/ml药物母液浓度100ug/ml，按750ng/ml浓度，全部给药孔总需要量：1.5405.ml。
ldh法和mtt法
ldh法和mtt法一、介绍在细胞实验研究中，细胞增殖和生长的检测是必不可少的。
而常用的细胞增殖和生长检测方法有许多种，其中较为常见的是LDH法和MTT法。
这两种方法都是通过细胞的代谢和细胞的状态来反映细胞的增殖和生长情况的。
二、LDH法LDH法全称为乳酸脱氢酶检测法，是利用乳酸脱氢酶的氧化还原作用来检测细胞增殖和生长的方法。
该方法基于细胞膜通透性的变化，当细胞膜发生损伤或破裂时，细胞内的乳酸脱氢酶会释放到培养基中。
而乳酸脱氢酶检测法就是通过检测培养基中乳酸脱氢酶含量的变化来判断细胞是否发生了损伤或破裂，以此来推测细胞的增殖和生长情况。
三、MTT法MTT法全称为四氮唑盐（3-（4,5-二甲基-2-噻唑）-2,5-二苯基-二氮杂烷）法，是利用MTT盐的还原作用来检测细胞增殖和生长的方法。
该方法的原理是将MTT盐加入细胞培养液中，MTT盐通过细胞中的酶反应还原成具有紫色的甲醛样代谢产物。
而这个代谢产物则会在细胞中不断积累，从而使细胞颜色越来越深。
最后，通过检测细胞的颜色深浅来推测细胞的增殖和生长情况。
四、LDH法和MTT法的比较1.优点与缺点LDH法的优点是可以反映细胞的状态和增殖情况，适用于不同种类的细胞；缺点是需要时间较长，对细胞损伤有一定影响。
而MTT法的优点是简单易行，可作为高通量筛选的快速方法；缺点则是对细胞形态和生长状态的要求较高，对于一些较小或幼稚的细胞不适用。
2.应用范围LDH法和MTT法都常用于评估各种细胞因素（如生长因子、激素、细胞毒性物质等）对细胞生长的影响；同时也受到在细胞增殖实验和细胞毒性实验中的广泛应用。
此外，LDH法和MTT法也可应用于肿瘤和炎症等疾病的研究。
3.实验难度和操作技巧LDH法和MTT法均需要一定的实验基础和耐心，但LDH法一般操作难度稍高些。
五、总结细胞增殖和生长检测方法是细胞实验研究中非常重要的组成部分。
LDH法和MTT法是两种常用的检测方法，不仅能反映细胞的增殖和生长情况，也广泛应用于肿瘤和炎症等疾病的研究。
乳酸脱氢酶(LDH)法操作说明
乳酸脱氢酶(LDH)法操作说明乳酸脱氢酶（LDH）法操作说明操作简介：乳酸脱氢酶（LDH）法是一种常用的生物化学分析方法。
本文将详细介绍使用乳酸脱氢酶法进行实验操作的步骤。
材料准备：1. 乳酸脱氢酶试剂盒2. 样品溶液3. 乳酸标准品4. 实验用试管和显微管操作步骤：1. 样品制备- 将待测样品装入实验用试管中。
每个样品应分别装入不同的试管，以避免交叉污染。
- 若样品过浓稀，需要进行适当的稀释，确保样品浓度在测试范围内。
2. 标准曲线制备- 准备不同浓度的乳酸标准品溶液，浓度范围可根据实验要求而定。
- 将不同浓度的标准品溶液分别装入实验用试管中。
3. 试剂添加- 分别向样品管和标准品管中加入相同体积的乳酸脱氢酶试剂，充分混匀。
4. 反应温育- 将所有试管置于恒温水浴中，温度设定为适合乳酸脱氢酶反应的温度（一般为37°C）。
- 在设定的反应温度下，将试管保持在水浴中反应一段时间（时间根据实验要求而定）。
5. 反应终止- 在反应时间结束后，以适当的方法终止反应。
常见的终止方式是添加酸性试剂或采用其他合适的方法。
6. 测定乳酸脱氢酶活性- 使用光度计、分光光度计或其他合适的仪器，测定样品和标准品反应后产生的光吸收值。
吸收值与乳酸脱氢酶活性成正比。
- 通过标准曲线，将样品的吸收值转化为对应的乳酸脱氢酶活性。
注意事项：1. 本实验操作需要严格按照实验室安全操作规范进行，避免任何可能导致个人受伤或污染的行为。
2. 实验过程中的试剂、标样和废液等应按照实验室规定的方法处理，不得随意丢弃。
3. 在操作过程中，保持实验器材和试剂的洁净，尽量避免外界因素对实验结果的影响。
4. 操作时需注意避免交叉污染，尤其是样品的装管和试剂的配比过程。
5. 样品和标准品的选择要合适，浓度范围应覆盖实验要求。
6. 温育过程中，确保试管能均匀受热，并避免发生温度不稳定的情况。
总结：乳酸脱氢酶（LDH）法是一种可靠的生物化学分析方法，适用于乳酸脱氢酶活性的测定。
乳酸脱氢酶(LDH)法操作说明
LDH法细胞毒性检测：原理：乳酸脱氢酶在胞浆内含量丰富,正常时不能通过细胞膜,当细胞受损或死亡时可释放到细胞外,所以细胞死亡数目与细胞培养上清中LDH活性成正比,用比色法测定实验孔LDH 活性,并与靶细胞对照孔进行比较,可计算效应细胞对靶细胞的杀伤百分率LDH（乳酸脱氢酶）是一种极为稳定的细胞质酶，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH 即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应转化成红色甲臢化合物，可通过酶标仪进行检测。
颜色形成的量与裂解细胞的数目成正比。
应用一个96-孔平板读数计收集可见光波长的吸收值数据。
这个分析可用于测量在细胞介导的细胞毒性分析中细胞膜的完整性，这种情况下目标细胞被效应细胞裂解，可判断细胞受损的程度。
乳酸脱氢酶（LDH）在胞质内含量非常丰富，细胞处于正常状态下其不能通过细胞膜，但当细胞受到损伤或死亡时便可释放到细胞外，此时细胞培养液中 LDH 的活性与细胞的死亡数目呈正比，通过用比色法测定并与靶细胞对照孔的 LDH 活性进行比较，可计算出效应细胞对靶细胞的杀伤百分数。
该实验方法操作简便、快速，可应用于 CTL 和 NK 细胞活性测定及药物、化学物质或放射所引起的细胞毒性，目前已有 LDH 法测定 CTL 活性的试剂盒。
同时设4个对照:靶细胞最大释放组、体积校正对照组、背景对照组和自然释放组按5∶1、10∶1、20∶1（效应细胞∶靶细胞）细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大等因素会造成细胞自然释放乳酸脱氢酶操作流程：设立效应细胞孔（不同浓度的效应细胞设立效应细胞自发释放组）：50μl效应细胞+50μl培养基实验组：靶细胞不变，改变效应细胞：50μl效应细胞+50μl靶细胞设立靶细胞自发释放组：50μl靶细胞+50μl培养基设立靶细胞最大释放组：50μl靶细胞+50μl培养基+10μl裂解液（10×）设立体积校正对照组：100μl培养基+10μl裂解液（10×）设立背景对照组：100μl培养基250g离心4分钟37℃孵育4小时离心前45分钟添加裂解液（10×）至靶细胞最大释放组250g离心4分钟取上清50μl转移至另一孔板（可选）于独立的孔中加50μl LDH阳性对照（1：5000）于每孔中添加50μl再次稀释的底物混合物室温避光孵育30分钟添加50μl终止溶液490nm测吸收值1.靶细胞接种数目的优化1.1.设立检测板1.1.1.准备靶细胞：调整细胞浓度0, 5,000, 10,000, 20,000/100μl，使用与细胞毒分析相同的培养基及孔板终体积。
LDH检测
乳酸脱氢酶释放法lactate dehydrogenase release assay碧云天的乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit)，也称乳酸脱氢酶检测试剂盒(LDH Assay Kit)或乳酸脱氢酶释放检测试剂盒(LDH Release Assay Kit)，是一种基于diaphorase催化的INT显色反应，通过比色法检测细胞毒性时释放的乳酸脱氢酶活性或检测其它样品中的乳酸脱氢酶活性的试剂盒。
本试剂盒可以用于常规的乳酸脱氢酶活性的检测，更常用于以LDH释放为指标的细胞毒性检测。
同时，基于细胞总乳酸脱氢酶活性的检测，本试剂盒也可以用于检测细胞增殖和细胞毒性检测。
细胞凋亡或坏死而造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)。
通过检测从质膜破裂的细胞中释放到培养液中的LDH 的活性，就可以实现对细胞毒性的定量分析。
LDH释放被看做细胞膜完整性的重要指标，并被广泛用于细胞毒性检测。
LDH释放被认为是以前使用放射性的51Cr标记细胞，随后通过51Cr释放进行细胞膜完整性检测的安全有效的替代方法。
本试剂盒的基本原理是，在乳酸脱氢酶的作用下，NAD+被还原生成NADH，NADH和INT(2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride)被硫辛酰胺脱氢酶(diaphorase)催化反应生成NAD+和强生色物甲臜(formazan)，在490nm波长下产生吸收峰，从而可以通过比色来定量乳酸脱氢酶的活性。
吸光度与乳酸脱氢酶活性成线性正相关。
该酶联反应原理的示意图如下：可检测细胞培养液、细胞裂解液等样品中乳酸脱氢酶的活性。
一个试剂盒可进行100次检测。
包装清单：产品编号产品名称包装C0016-1 LDH释放试剂 1.5mlC0016-2 乳酸溶液2mlC0016-3 酶溶液1ml×2C0016-4 INT溶液(10X) 0.2mlC0016-5 INT稀释液2ml—说明书1份保存条件：-20℃保存，一年有效。
细胞毒性检测的实验方案
细胞毒性检测的实验⽅案
在糖酵解的发⽣速率上，乳酸脱氢酶不是限速酶，故对发⽣速率影响不⼤。
运⽤这个原料，我们通过质膜损伤的定量评估细胞死亡或细胞毒性。
LDH是⼀种稳定的酶，存在于所有细胞类型中，并在质膜受损后迅速释放到细胞培养基中。
因此，LDH是细胞毒性研究中使⽤zui⼴泛的标记。
乳酸脱氢酶(LDH或LD)应⽤范围⾮常⼴泛：
分析化合物或环境因素对细胞死亡的作⽤。
对动物细胞样本都可以进⾏检测。
细胞个数检测范围：10,00-100,0000个细胞/孔。
操作简便：
1.⽆需绘制标准曲线，⽤阳性结果和阴性结果进⾏定量细胞毒性；
2.LDH从细胞内被释放到培养基中，形成了⼀个可视化的颜⾊反应。
加样反应显⾊之后，⽤酶标仪进⾏检测，读数便捷；
3.样本和反应器材易得：仅需要取得200 µL细胞培养上清作为样本，进⾏后续检测。
普通96孔板就可以完成。
对于乳酸脱氢酶的搭配使⽤，为了帮助检测到更多的细胞状态指标，更加全⾯的评估外界刺激对细胞的影响，Abbkine 乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒（KTA1030）是⼀个不错的选择。
以上，主要讲的是细胞学研究的细胞毒性检测的实验⽅案。
乳酸脱氢酶(LDH)测定操作规程(SOP)
乳酸脱氢酶(LDH)测定操作规程（SOP）一、用途本产品用于体外定量测定血清、血浆样品中乳酸脱氢酶（LDH）的活性。
二、临床意义（一）概述乳酸脱氢酶（LDH），又称L－乳酸－NAD+氧化还原酶，酶编号为EC 1.1.1.27，分子量约为34000道尔顿。
LDH是一种细胞质酶，存在于所有组织细胞中。
由于组织中的LDH 浓度比血浆高约500倍，即使组织的轻微损伤也将导致血清中活性的明显增高，在肝、心肌、骨骼肌和肾中发现高度组织特异性活性的酶。
（二）临床意义乳酸脱氢酶增高主要见于心肌梗死、肝炎、肺梗死、某些恶性肿瘤、白血病等。
某些肿瘤转移所致的胸腹水中乳酸脱氢酶活力往往升高。
目前，常用于心肌梗死、肝病和某些恶性肿瘤的辅助诊断。
（三）医学决定水平170U／L:此值在参考范围以内，等于或低于此值可排除许多与LDH升高有关的疾病，而考虑其他的诊断。
此值还可作为病人自身的对照，用来与以前或将来的测定值作比较。
300U／L：高于此水平时，应考虑到可能引起LDH升高的各种疾病，如心肌梗塞、肝病变、传染性单核细胞增多症、进行性肌营养不良等。
因此，应作其他各种试验，以作出明确诊断。
血清溶血可使测定值增高，应予以注意。
500U／L：高于此值，常见于巨幼细胞性溶血，急性白血病、慢性粒细胞性白血病、转移癌和肝昏迷等，此时应作其他多种检测来作出正确诊断。
三、检验原理L-乳酸＋NAD+−−LDH丙酮酸＋NADH＋H+−→NADH的生成速率与样品中LDH活性成正比，在340nm波长处，通过连续监测吸光度的上升速率(△A／min)，即可计算出样品中LDH的活性。
四、样品血液样品原则上采集晨起空腹血（禁食12小时）；患者处于平静、休息状态，减少患者由于运动、饮食带来的影响；静脉采血时患者应取坐位或卧位；止血带使用后1分钟内采血，回血后立即松开；正确使用抗凝剂；防止溶血；防止过失性采样。
样品运送过程中应防止过度振荡、防止样品容器的破损、防止样品被污染、防止样品及唯一性标志的丢失和混淆，防止样品对环境的污染、水分蒸发。
LDH检测
乳酸脱氢酶释放法lactate dehydrogenase release assay碧云天的乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit)，也称乳酸脱氢酶检测试剂盒(LDH Assay Kit)或乳酸脱氢酶释放检测试剂盒(LDH Release Assay Kit)，是一种基于diaphorase催化的INT显色反应，通过比色法检测细胞毒性时释放的乳酸脱氢酶活性或检测其它样品中的乳酸脱氢酶活性的试剂盒。
本试剂盒可以用于常规的乳酸脱氢酶活性的检测，更常用于以LDH释放为指标的细胞毒性检测。
同时，基于细胞总乳酸脱氢酶活性的检测，本试剂盒也可以用于检测细胞增殖和细胞毒性检测。
细胞凋亡或坏死而造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)。
通过检测从质膜破裂的细胞中释放到培养液中的LDH 的活性，就可以实现对细胞毒性的定量分析。
LDH释放被看做细胞膜完整性的重要指标，并被广泛用于细胞毒性检测。
LDH释放被认为是以前使用放射性的51Cr标记细胞，随后通过51Cr释放进行细胞膜完整性检测的安全有效的替代方法。
本试剂盒的基本原理是，在乳酸脱氢酶的作用下，NAD+被还原生成NADH，NADH和INT(2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride)被硫辛酰胺脱氢酶(diaphorase)催化反应生成NAD+和强生色物甲臜(formazan)，在490nm波长下产生吸收峰，从而可以通过比色来定量乳酸脱氢酶的活性。
吸光度与乳酸脱氢酶活性成线性正相关。
该酶联反应原理的示意图如下：可检测细胞培养液、细胞裂解液等样品中乳酸脱氢酶的活性。
一个试剂盒可进行100次检测。
包装清单：产品编号产品名称包装C0016-1LDH释放试剂C0016-2乳酸溶液2mlC0016-3酶溶液1ml×2C0016-4INT溶液(10X)C0016-5INT稀释液2ml—说明书1份保存条件：-20℃保存，一年有效。
ldh试剂检测公式
ldh试剂检测公式ldh试剂检测公式是一种常用的生化检测方法，用于检测血清或组织中的乳酸脱氢酶（LDH）活性。
LDH是一种重要的酶类，存在于细胞的胞浆中，其活性水平可以反映细胞损伤程度，对于临床诊断和疾病监测具有重要意义。
LDH试剂检测公式是通过测定LDH催化的底物转化为产物的速率来间接测定LDH活性的方法，下面我们将介绍LDH试剂检测公式的具体步骤和计算方法。
一、LDH试剂检测公式的原理LDH试剂检测公式是基于LDH催化底物氧化还原反应的原理。
LDH催化的底物是乳酸，它在催化下被氧化为产物丙酮酸。
LDH试剂检测公式中，首先将待测样品和辅酶NAD+加入反应体系中，LDH催化乳酸氧化的同时，NAD+被还原为NADH。
NADH的生成量与乳酸氧化的速率成正比，而NADH的光密度与其浓度成正比。
因此，通过测定NADH的光密度变化，可以间接测定LDH活性。
二、LDH试剂检测公式的步骤1. 样品制备：将待测血清或组织样品离心去除悬浮物，取上清液作为待测样品。
2. 试剂配置：将乳酸、NAD+、琥珀酸、LDH酶等试剂按照一定比例配置成反应液。
3. 反应体系组装：将待测样品和试剂加入反应管中，混匀后放入分光光度计。
4. 反应条件设定：设置适当的温度和波长，记录初始吸光度。
5. 反应过程监测：启动分光光度计记录反应体系吸光度随时间的变化。
6. 数据处理：根据吸光度变化曲线计算LDH活性。
三、LDH试剂检测公式的计算方法1. 计算初始吸光度（A0）和最终吸光度（A1）。
2. 计算反应时间（t）。
3. 根据NADH的摩尔吸光系数ε和反应体系的光程b计算NADH的摩尔浓度C（C = ΔA / εb）。
4. 根据反应体系中NAD+的初始摩尔浓度C0和NADH生成量与NAD+消耗量之间的关系，计算LDH活性。
在实际操作中，为了提高LDH试剂检测公式的准确性和稳定性，需要严格控制各项操作条件，并采用标准曲线法进行定量分析。
此外，还需注意避免样品污染和环境干扰对实验结果的影响。
乳酸脱氢酶(LDH)释放法细胞繁殖与毒性定量检测试剂盒产
乳酸脱氢酶（LDH）释放法细胞繁殖与毒性定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途乳酸脱氢酶（LDH）释放法细胞繁殖与毒性定量检测试剂是一种旨在通过酶联连续反应系统检测由于细胞损伤导致的细胞内稳定的乳酸脱氢酶释放到细胞外，使四唑盐染料碘硝基氯化四氮唑（INT）还原为红色甲臜（farmazan），即比色法定量测定酶活性，以评价活体细胞繁殖的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。
适用于各种药物、化学、环境因子和营养因子处理的贴壁或悬浮生长中的动物或人体细胞。
替代传统的同位素[51 Cr]释放检测的最佳选择。
产品严格无菌，即到即用，简捷敏感，性能稳定，显色清晰，检测准确，重复性好。
技术背景细胞凋亡或坏死而造成的细胞膜结构的损害或完全裂解导致细胞浆内的酶释放外泄到培养液里，其中包括活性稳定的乳酸脱氢酶。
乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）释放法的测定是基于在乳酸脱氢酶的作用下，还原NAD+反应生成的NADH，再与氧化型2-（4-碘苯）-3-（4-硝基苯）-5-苯四唑（Iodonitrotetrazolium；INT）在硫辛酰胺脱氢酶（diaphorase）的催化下反应生成红色生色产物甲臜（formazan），在490nm波长下产生吸收峰，从而确定释放的乳酸脱氢酶的活性，作为细胞膜完整性的标志：吸光值与细胞死亡或毒性程度成线性正相关。
酶联连续反应系统为：lactate dehydrogenaseNAD+ + Lactate → Pyruvate + NADHdiaphoraseNADH + INT → NAD++ Formazan（red）产品内容裂解液（Reagent A）1毫升补充液（Reagent B）1毫升反应液（Reagent C）5毫升显色液（Reagent D）1毫升终止液（Reagent E）1毫升标准液（Reagent F）20微升产品说明书1份保存方式保存在－20℃冰箱里，反应液（Reagent C）和显色液（Reagent D）避免光照；有效保证6月用户自备96孔细胞培养板：用于细胞操作的容器细胞培养箱：用于孵育反应孔板离心机：用于沉淀细胞酶标仪：用于定量检测染色后的细胞实验步骤一、贴壁细胞检测1．准备96孔细胞培养板的待测细胞（每孔100微升）：包括未处理的对照细胞（样品对照孔），未处理的后续裂解的细胞（样品最大酶活性对照孔），以及药物处理的细胞（处理样品孔），并做好标记（细胞密度为每孔2 X 103至2 X 104细胞）2．到规定的检测时间点前1小时，从湿润的细胞培养箱里取出待测的96孔细胞培养板（注意：确保细胞培养液维持在100微升容量）3．加入10微升裂解液（Reagent A）到未处理的后续裂解的细胞孔里（样品最大酶活性对照孔）4．同时加入10微升补充液（Reagent B）到其余所有检测孔里5．放回湿润的细胞培养箱里，继续培养1小时，即规定检测时间6．从湿润的细胞培养箱里取出待测的96孔细胞培养板7．放进孔板离心机离心10分钟，速度为250g8．分别小心移取50微升上清液到新的96孔板的相应孔里，避免触摸细胞颗粒，同时注意做好标记9．分别加入50微升反应液（Reagent C）（注意：使用前，须混匀）10．分别加入10微升显色液（Reagent D）11．摇动96孔板混匀12．在室温下孵育30分钟，避免光照13．（选择步骤）分别加入10微升终止液（Reagent E）14．即刻放进酶标仪里测读：波长490nm15．计算处理样品实际吸光读数：处理样品孔吸光读数－样品对照孔吸光读数16．计算样品细胞最大酶活性的实际吸光读数：样品最大酶活性对照孔吸光读数－样品对照孔吸光读数17．计算细胞毒性或死亡率（％）：（处理样品实际吸光读数÷样品细胞最大酶活性的实际吸光读数）X 10018．或绘制细胞生长曲线：纵座标（Y轴）为实际吸光读数（A）；横坐标（X轴）为细胞数或时间点或药物浓度；据此计算其LD50二、悬浮细胞检测1．准备96孔细胞培养板的待测悬浮细胞（每孔100微升）：包括未处理的对照细胞（样品对照孔），未处理的后续裂解的细胞（样品最大酶活性对照孔），以及药物处理的细胞（处理样品孔），并做好标记（细胞密度为每孔5 X 103至5 X 104细胞）2．到规定的检测时间点前1小时，从湿润的细胞培养箱里取出待测的96孔细胞培养板（注意：确保细胞培养液维持在100微升容量）3．加入10微升裂解液（Reagent A）到未处理的后续裂解的细胞孔里（样品最大酶活性对照孔）4．同时加入10微升补充液（Reagent B）到其余所有检测孔里5．放回湿润的细胞培养箱里，继续培养1小时，即规定检测时间6．从湿润的细胞培养箱里取出待测的96孔细胞培养板7．放进孔板离心机离心10分钟，速度为250g8．分别小心移取50微升上清液到新的96孔板的相应孔里，避免触摸细胞颗粒，同时注意做好标记9．分别加入50微升反应液（Reagent C）（注意：使用前，须混匀）10．分别加入10微升显色液（Reagent D）11．摇动96孔板混匀12．在30℃温度下孵育30分钟，避免光照13．（选择步骤）分别加入10微升终止液（Reagent E）14．即刻放进酶标仪里测读：波长490nm15．计算处理样品实际吸光读数：处理样品孔吸光读数－样品对照孔吸光读数16．计算样品细胞最大酶活性的实际吸光读数：样品最大酶活性对照孔吸光读数－样品对照孔吸光读数）17．计算细胞毒性或死亡率（％）：（处理样品实际吸光读数÷样品细胞最大酶活性的实际吸光读数）X 10018．或绘制细胞生长曲线：纵座标（Y轴）为实际吸光读数（A）；横坐标（X轴）为细胞数或时间点或药物浓度；据此计算其LD50注意事项1．本产品为100次（1个96孔板）操作2．操作时须戴手套3．整个操作须无菌操作4．建议每个样品安排3个孔，即重复3次，计算时取其平均值5．检测体系相应增加，试剂用量按比例相应增加：例如200微升检测体系，试剂用量增加1倍6．每孔中的培养液需100微升，避免使用周边培养孔（常常液体蒸发而减少）7．系统测试，可以加入2至5微升标准液（Reagent G）到50微升无细胞的细胞培养液里，然后按照说明书加入反应液（Reagent C）和显色液（Reagent D）即可8．细胞裂解效果不佳，可以使用20微升裂解液（Reagent A）处理9．孵育时，须避光10．染色完成后，建议即刻检测，最迟不得超过1小时11．细胞培养和处理时，避免使用草酸（OXALATE），草氨酸（OXAMATE）和EDTA，否则影响检测的准确性12．血清含有乳酸脱氢酶，建议使用浓度不要超过1％13．细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大等因素会造成细胞自然释放乳酸脱氢酶14．酚红会干扰检测15．样品最大酶活性对照孔或最大OD吸光读数与细胞裂解程度密切相关16．如果用户没有孔板离心机，则移取上清液时格外小心17．如果用户没有匹配的波长，可以使用波长470nm至570nm之间的任一波长替代18．本公司提供系列细胞繁殖检测试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定检测敏感使用承诺杰美基因秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。
乳酸脱氢酶LDH检测作业指导书
乳酸脱氢酶LDH检测作业指导书1 检验目的规范乳酸脱氢酶（LDH）检测试验，确保检测结果准确性和重复性。
2 测定方法DGKC改良法L→P。
3 检测原理乳酸脱氢酶催化乳酸氧化为丙酮酸，同时NAD+被还原为NADH。
NADH在340nm处有吸收峰，因此反应会引起340nm吸光度的增高，并且吸光度增加的速率与样本中乳酸脱氢酶活性呈正比的关系。
乳酸脱氢酶L-乳酸+NAD+丙酮酸+NADH +H+4 样本血清、肝素或EDTA抗凝血浆，处理方法见生化标本采集程序。
稳定性：2～8℃稳定7天；15～25℃稳定1天。
5 仪器和试剂5.1 仪器：美国贝克曼-库尔特DXC800、AU5811全自动生化仪、迈瑞BS800M生化分析仪。
5.2 试剂：由武汉元景商贸公司提供原装贝克曼-库尔特试剂及迈瑞公司提供的生化试剂（详见试剂说明书），超过失效期的试剂不能使用。
5.3 校准物：Rodan混合校准品，符合WHO标准，贮存、准备严格遵照其说明书。
5.4 质控物：Rodan正常值及病理值质控品，符合WHO 标准，贮存、准备严格遵照说明书。
6 校准6.1 仪器校准：每年由该仪器维修工程师参照厂方的技术规范对仪器进行一次校准。
6.2 项目校准：试剂盒在仪器上放置稳定期后；试剂批号更换后；由质控结果随时决定。
7 操作步骤上机操作，操作程序、质量控制程序见相应生化仪操作程序。
8 参考范围135～225U/L。
9 警告/危急值：未规定。
10 性能指标10.1 线形上限：△A/min为0.40，1600U/L。
10.2 精密度：批内、批间CV分别为5.9%、6.8%。
10.3 准确度:不准确度≤15%。
10.4 试剂贮存:密闭避光贮存2～8℃可稳定12个月；工作液密闭避光贮存2～8℃可稳定21天，室温可稳定7天。
11 干扰因素及变异的潜在来源11.1.由于红细胞、血小板中含有大量的LD，故严禁使用溶血标本。
11.2.在采用血浆作为标本时必须用3000ｒ/min离心15min以除去血小板。
LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测实验方法
LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测LDH释放检测方法：a。
根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96孔细胞培养板中，使待检测时细胞密度不超过80—90％满。
b. 吸去培养液，用PBS液洗涤一次。
换新鲜培养液（推荐使用含1%血清的低血清培养液或适当的无血清培养液），将各培养孔分成如下几组：包括无细胞的培养液孔（背景空白对照孔),未经药物处理的对照细胞孔（样品对照孔)，未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔（样品最大酶活性对照孔），以及药物处理的细胞孔(药物处理样品孔)，并做好标记。
按照实验需要给予适当药物处理（如加入0-10μl左右特定的药物刺激，可设置不同浓度，不同处理时间,对照孔中需加入适当的药物溶剂对照)，继续按常规培养。
到预定的检测时间点前1小时，从细胞培养箱里取出细胞培养板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂，加入量为原有培养液体积的10%.加入LDH释放试剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育.c. 到达预定时间后,将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。
分别取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定.准备工作：a。
INT溶液（1X）的配置：根据所需的INT溶液（1X)的量，取适量INT溶液(10X)用INT稀释液稀释至1X.例如，取20μl INT溶液（10X)，加入180μl INT稀释液,混匀后即配置为200μl INT溶液(1X）.INT 溶液(1X）宜现配现用，配置后4℃保存可于当天使用,不宜配置后冻存。
b。
LDH检测工作液的配制: 根据待测定的样品数（含对照)，参考下表在临检测前新鲜配制适量的检测工作液。
注意：LDH检测工作液必须现配现用，配制和使用过程中均要注意适当避光.样品测定:a. 各孔分别加入60μl LDH检测工作液。
b. 混匀，室温(约25℃) 避光孵育30min（可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动）。
ldh细胞毒性检测原理
ldh细胞毒性检测原理
LDH细胞毒性检测是一种常用的细胞毒性评价方法，其原理基于乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，简称LDH）在细胞损伤时释放到培养上清液中。
LDH是一种催化乳酸转化为丙酮酸的酶，在正常情况下主要存在于细胞内。
当细胞发生损伤或坏死时，LDH被释放到外界环境中。
因此，通过测定培养上清液中的LDH水平，可以间接反映细胞损伤程度。
LDH细胞毒性检测的具体步骤如下：
1. 给予细胞不同浓度的试剂处理，例如药物、化合物等。
2. 处理一段时间后，将培养上清液收集并离心，得到上清液。
3. 使用LDH试剂盒，按照说明书的步骤将上清液与试剂进行反应。
4. 将反应混合物置于检测设备中，通过测定OD值或荧光信号的强度，可以得到LDH的活性或浓度。
5. 将测定结果与对照组进行比较，可以评估细胞毒性的程度。
LDH细胞毒性检测的优点在于操作简便，结果可靠，常用于评估药物、化合物对细胞的毒性影响。
然而，需要注意的是LDH的释放并不一定代表细胞的坏死，因为在一些情况下，LDH也可能通过非坏死途径释放，如胞吞作用、葡萄糖缺乏等。
因此，综合分析LDH释放的动力学变化和其他细胞毒性指标，可以更全面地评估细胞的毒性情况。
乳酸脱氢酶测定方法操作规程
乳酸脱氢酶（LDH）测定方法操作规程【产品名称】通用名称：乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒（IFCC 法）使用说明书【预期用途】该试剂盒采用IFCC法，用于体外定量测定人血清或血浆中乳酸脱氢酶的活力。
【检验原理】LDH催化乳酸氧化为丙酮酸，同时将NAD+还原为NADH。
NADH的生成速率与标本中乳酸脱氢酶的活性成正比。
乳酸+ 2O LDH丙酮酸+NADH+H+【主要组成成份】R1：Good’s缓冲液50 mmol/LL-乳酸 5.0 mmol/LR2：NAD+7.0 mmol/L*不同批号试剂盒各组分请勿混用。
【储存条件与有效期】未开启的试剂盒在2~8℃保存有效期为18个月。
试剂开瓶后应避光保存，在2℃~8℃可稳定30天。
试剂不可冰冻。
【适用仪器】迈瑞BS系列全自动生化分析仪、日立7180型全自动生化分析仪、日立7060型全自动生化分析仪、日立7600P自动生化分析仪、奥林巴斯AU400型全自动生化分析仪、奥林巴斯AU2700型全自动生化分析仪、贝克曼库尔特AU680型全自动生化分析仪。
若需自动生化分析仪应用参数，请随时和公司联系。
建议用户在不同仪器上使用本产品时，根据实验室情况进行验证。
【样本要求】新鲜血清或血浆，采集后及时测定，应避免溶血和污染。
【检验方法】试剂准备R1：即用液体试剂R2：即用液体试剂测定条件波长340nm温度37℃分析类型动力学法反应方向上升反应操作步骤* ΔA/min=ΔA/min样本管—ΔA/min空白管* 试剂和样本量可根据不同生化分析仪要求按比例适当增减。
校准校准品类型S1：生理盐水S2：迈瑞配套校准品推荐进行2点线性校准校准周期和要求（包括但不限于以下情况）更换试剂批号时仪器关键零部件更换时室内质控失效时质控每批样品检测时，建议使用迈瑞公司提供的配套质控品进行内部质量控制。
质控品测定值应该在规定的范围内。
若超出规定范围，有必要采取相应的措施或联系生产厂家。
【参考范围】男性：135~225U/L 女性：135~214U/L（注：各实验室应有自己的参考范围。
LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测实验方法
LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测之阳早格格创做LDH释搁检测要领：a. 根据细胞的大小战死少速度将适量细胞交种到96孔细胞培植板中，使待检测时细胞稀度没有超出80-90%谦.b. 吸来培植液，用PBS液洗涤一次.换新陈培植液(推荐使用含1%血浑的矮血浑培植液或者适合的无血浑培植液)，将各培植孔分成如下几组：包罗无细胞的培植液孔(背景空黑对于照孔)，已经药物处理的对于照细胞孔(样品对于照孔)，已经药物处理的用于后绝裂解的细胞孔(样品最大酶活性对于照孔)，以及药物处理的细胞孔(药物处理样品孔)，并干佳标记表记标帜.依照真验需要赋予适合药物处理(如加进0-10μl安排特定的药物刺激，可树立分歧浓度，分歧处理时间，对于照孔中需加进适合的药物溶剂对于照)，继承按惯例培植.到预约的检测时间面前1小时，从细胞培植箱里与出细胞培植板，正在“样品最大酶活性对于照孔”中加进试剂盒提供的LDH释搁试剂，加进量为本有培植液体积的10%.加进LDH释搁试剂后，反复吹挨数次混匀，而后继承正在细胞培植箱中孵育.c. 到达预约时间后，将细胞培植板用多孔板离心机400g离心5min.分别与各孔的上浑液120μl，加进到一新的96孔板相映孔中，随即举止样品测定.准备处事：a. INT溶液(1X)的晃设：根据所需的INT溶液(1X)的量，与适量INT溶液(10X)用INT稀释液稀释至1X.比圆，与20μl INT溶液(10X)，加进180μl INT稀释液，混匀后即晃设为200μl INT溶液(1X).INT溶液(1X)宜现配现用，晃设后4℃保存可于当天使用，没有宜晃设后冻存.b. LDH检测处事液的配造: 根据待测定的样品数(含对于照)，参照下表正在临检测前新陈配造适量的检测处事液.注意：LDH检测处事液必须现配现用，配造战使用历程中均要注意适合躲光.样品测定:a. 各孔分别加进60μl LDH检测处事液.b. 混匀，室温(约25℃) 躲光孵育30min(可用铝箔包裹后置于火仄摇床或者侧晃摇床上缓缓摇动).而后正在490nm处测定吸光度.使用600nm或者大于600nm的任一波少动做参照波少举止单波少测定.c. 估计(测得的各组吸光度均应减来背景空黑对于照孔吸光度)细胞毒性或者牺牲率(%)=(处理样品吸光度－样品对于照孔吸光度) / (细胞最大酶活性的吸光度－样品对于照孔吸光度)×100d. 可画造细胞毒性直线：纵座标为本质吸光度，横坐标为药物浓度；据此可估计该药物效率特定时间的半致死剂量LD50.。
血清乳酸脱氢酶LDH测定
血清乳酸脱氢酶LDH测定1 检验目的指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。
2 实验原理LDH催化乳酸氧化为丙酮酸，同时将NAD+还原为NADH，LDHNADH的生成速率与标本中乳酸脱氢酶的活力成正比。
L-乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+3 标本：3.1 病人准备：无特殊。
3.2 类型：血清或EDTA血浆。
3.3 标本存放：3天内的活性损失：2～8℃保存：<8%；15～25℃保存：<2%。
3.4 标本运输：常温条件下保存运输。
3.5 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染的标本。
4 实验材料4.1 试剂：上海复星长征医学科学有限公司LDH试剂盒（沪食药监械（准）字2014第2400166号 YZB/沪 1546-40-2014）4.1.1 试剂组成氯化钾 190mmol/L 试剂1（R1）乳酸62.5mmol/LTris缓冲液 100mmol/L试剂2（R2）NAD+ 30mmol/L Tris缓冲液 100mmol/L 4.1.2试剂准备试剂为即用式。
4.1.3 试剂稳定性与贮存：2～8℃避光、密封的储存条件下，试剂（盒）自生产之日起有效期为12个月。
试剂1 与试剂2 启用后，在2～10℃避光的条件下可稳定14天。
4.1.4 变质指示当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。
4.1.5 注意事项试剂中含叠氮钠为防腐剂。
不可入口！避免接触皮肤及粘膜。
应采取必要的预防措施使用试剂。
4.2 校准品：使用上海复星长征医学科学有限公司提供的LDH校准品对自动分析仪进行校准。
4.3 质控品：使用正常值、病理值复合控制品。
5 仪器AU2700生化分析仪，罗氏P800生化分析仪, 西门子ADVIA-2400生化分析仪，东芝TBA-120生化分析仪6 操作步骤6.1 样品的准备：将标好号的样品离心后放到仪器规定的位置。
6.2 试剂的检测：仪器开机后，检查各种试剂的位置，体积等确认无误后方可进行测定。
乳酸脱氢酶法操作说明
乳酸脱氢酶法操作说明装备与准备：1.安全镜、手套和实验室衣物。
2.LDH酶标仪和试剂盒。
3. 乳酸标准品（浓度待测，如1, 2, 4,和8mmol/L）。
4.甲酸钠和碳酸氢钠缓冲液（pH10）。
5.NADH。
6.甲酸钠酶混合物。
操作步骤：1.将LDH试剂盒中的所有试剂室温恢复到室温（20-25°C）。
2.使用甲酸钠和碳酸氢钠缓冲液，配制pH为10的缓冲液。
3.将试剂盒中的稀释液瓶放在LDH酶标仪中的样品槽中预热。
4. 在一个试管中加入10µl的标准品（1，2，4或8mmol/L），然后加入200µl的缓冲液和40µl的NADH。
5.加入10µl的甲酸钠酶混合物。
6.快速旋转混合试管中的液体。
7.立即将试管放在LDH酶标仪中的样品槽中，然后记录开始的时间。
8.观察反应液的吸光度变化。
该试剂盒中的酶会催化LDH的反应，并使NADH氧化为NAD。
NADH氧化产生的吸光度变化可以与待测标品中的乳酸浓度正相关。
9. 在约1至2分钟内，观察吸光度的稳定，并记录最大吸光度（Amax）的值。
10.用同样的步骤重复测量三个标准品。
11. 使用Amax值的三个测量结果，制作标准曲线。
将Amax值作为y 轴，标准品浓度（mmol/L）作为x轴绘制图表。
12.分析待测样本。
将待测样本用缓冲液稀释1:2或1:5的比例，在酶标板上重复三次。
13.将吸光度读数记录下来，并使用标准曲线，将吸光度转换为乳酸浓度。
14.使用样本的三个测量结果计算样本的均值。
注意事项：1.在操作之前，确保所有试剂和设备达到室温。
如果试剂需要特殊条件，按照说明书操作。
2.注意使用安全措施，如戴手套、安全镜和实验室衣物，以防止化学物质接触皮肤或眼睛。
3.按照说明书中的比例准确配制试剂和标准品。
4.必须在开始试验后立即将试管放入酶标仪中，以确保吸光度测量的准确性。
5.注意观察试剂盒中的反应液的颜色变化，并在愈合后的最大吸光度值时记录时间。
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LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测
LDH释放检测
方法：
a. 根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96孔细胞培养板中，使待检测时细胞密度不超过80-90%满。
b. 吸去培养液，用PBS液洗涤一次。
换新鲜培养液(推荐使用含1%血清的低血清培养液或适当的无血清培养液)，将各培养孔分成如下几组：包括无细胞的培养液孔(背景空白对照孔)，未经药物处理的对照细胞孔(样品对照孔)，未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔(样品最大酶活性对照孔)，以及药物处理的细胞孔(药物处理样品孔)，并做好标记。
按照实验需要给予适当药物处理(如加入0-10μl左右特定的药物刺激，可设置不同浓度，不同处理时间，对照孔中需加入适当的药物溶剂对照)，继续按常规培养。
到预定的检测时间点前1小时，从细胞培养箱里取出细胞培养板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂，加入量为原有培养液体积的10%。
加入LDH释放试剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育。
c. 到达预定时间后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。
分别取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。
准备工作：
a. INT溶液(1X)的配置：根据所需的INT溶液(1X)的量，取适量INT溶液(10X)用INT稀释液稀释至1X。
例如，取20μl INT溶液(10X)，加入180μl INT稀释液，混匀后即配置为200μl INT溶液(1X)。
INT溶液(1X)宜现配现用，配置后4℃保存可于当天使用，不宜配置后冻存。
b. LDH检测工作液的配制: 根据待测定的样品数(含对照)，参考下表在临检测前新鲜配制适量的检测工作液。
注意：LDH检测工作液必须现配现用，配制和使用过程中均要注意适当避光。
样品测定:
a. 各孔分别加入60μl LDH检测工作液。
b. 混匀，室温(约25℃) 避光孵育30min(可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动)。
然后在490nm处测定吸光度。
使用600nm或大于600nm的任一波长作为参考波长进行双波长测定。
c. 计算(测得的各组吸光度均应减去背景空白对照孔吸光度)
细胞毒性或死亡率(%)=(处理样品吸光度－样品对照孔吸光度) / (细胞最大酶活性的吸光度－样品对照孔吸光度)×100
d. 可绘制细胞毒性曲线：纵座标为实际吸光度，横坐标为药物浓度；据此可计算该药物作用特定时间的半致死剂量LD50。