农杆菌感受态制备与氯化钙转化及电转化

普通农杆菌感受态制备与转化：

1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。

2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。

3. 5k rpm离心5分钟。

4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。

5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。

如不是马上使用，可以将之按200ul分裝储存于-80℃待用。

6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。

7. 液氮中冷冻1分钟。

8. 37℃水浴溶化细胞。

9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。

10. 离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。

11. 涂板，28℃培养2-3天。

电转农杆菌感受态细胞制备与转化

1．挑取单克隆接种于2mlYEP（含50mg/l链霉素）液体培养基，28℃，250rpm，振荡培养过夜。（如用5mlYEP，需培养36h）

2．将菌液按1:100转移至200mlYEP（含50mg/l链霉素）培养液中，28℃，250rpm，振荡培养至OD=0.3(约4~5h)。

3．转入50ml的无菌离心管，4℃，4000rpm离心10min，弃上清。4．用20ml冰浴的HEPES(1mM，PH-7.0)重悬。

5．4℃，4000rpm离心10min，弃上清。

6．重复4、5步骤2~3次。

7．用2ml冰浴的10％甘油重悬。

8．每管100μl分装于1.5ml无菌的Eppendorf管中，-70℃保存。

1mM HEPES的配制：称取0.119gHEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500ml，用NaOH调pH至7.0，灭菌后待用。

注：HEPES需现用现配。

电击法转化农杆菌感受态细胞

1．取出农杆菌感受态细胞于冰上冻融。

2．加2μl质粒DNA于100μl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀。3．取出细胞与质粒的混合物转入电击杯中(电击杯-20℃预冷)，在2500V高压下电击。

4．取出电击杯，加入500μl预冷的YEP培养液(不含抗生素)，轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡培养5h。

5．取30-40μl菌液涂在含相应抗生素的YEP平板上，28℃倒置培养1.5~2d。

注：

1．细胞与质粒的混合物应沿槽壁慢慢加入电击杯中，避免产生气泡。2．电击前擦干电击杯外侧。

3．涂板菌液量可根据菌液浓度作调整。

另：农杆菌的感受态制备和转化

曾做过1年的农杆菌，下面为我采用的农杆菌感受态制备和转化方法，供参考：

农杆菌感受态细胞的制备

(l)将农杆菌接种于5一10mlYEB液体培养基中(Str 100mg/L)，28℃震荡过夜。

(2)取lml活化的菌液接种于50ml含有抗生素的YEB培养基中，同样条件下培养至OD600值为0.4一0.5左右。

(3)将菌液冰浴30min后，装至50ml离心管中。

(4)4℃，5000g离心10min，收集菌体。

(5)弃上清，用lml 20mmol/L的冰预冷CaCl2重悬沉淀，并加入0.5ml，80%的甘油，混匀。

(6)按每管200ul分装，液氮速冻后于一70℃保存。

冻融法转化土壤农杆菌

(l)取1ug载体DNA加到200ul冰上溶化的感受态细胞中，轻混，冰浴30min。

(2)液氮中速冻5min，37℃水浴5min，再迅速冰浴2min。

(3)加入800ul YEB液体培养基，28℃轻摇4一6hr。

(4)取50一200ul菌液涂布于YEB选择平板上（含有相应的抗生素），28℃倒置培养2天