农杆菌电击感受态的制备_转化及验证

农杆菌电击感受态的制备，转化及验证

1.制备农杆菌电转感受态

(1)挑取根癌农杆菌EHA 105单菌落，接种于5mlLB〔含利福平(Rif) 50mg/L,；链霉素

100mg/L)液体培养基中，28'C, 220rpm震荡培养过夜。

(2)将2m1过夜培养的菌液加到50ml含同样抗生素的LB培养基中，28'C, 220rpm震荡

3-4小时，至OD600=0.8左右。

(3) 5000rpm离心5分钟，去上清。

(4) 加入40m1 10%甘油悬浮菌体，冰浴30min.

(5) 4'C, 5000rpm离心5分钟，去上清。

(6 加入30mL10%甘油重悬浮菌体，4'C, 5000rpm离心5分钟，

(7)重复步骤6一次，去上清，加入2ml10%甘油悬浮，分装于1.5ml的离心管中(200 p 1/

管)备用。

2 农杆菌感受态的电转化

〔I)取2 ul质粒加到200 u I EHA 105感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴

30分钟。

(2)把质粒和感受态混合液吸入电极杯，电击转化。

(3)马上加入lml新鲜的LB液体培养基，28'C, 150rpm轻摇4-6小时。

(4)收集菌体涂布于含有链霉素100mg/L),利福平(50mg/L)及质粒所含的抗性的LB固体培

养基平板上，

28℃培养2-3天。其实和大肠杆菌电转化差不多，只不过培养温度是28度，摇的时间长一些，还有就是链霉素和利福平两种抗生素要加上，目的是防止根癌脓杆菌自带质粒的丢失，不过具体要加哪些抗生素还得看你是那种根癌脓杆菌非常感谢我用的不是电转化是把茎和叶浸在农杆菌液里30秒..想知道为什么不是把菌液直接滴在土里?可以采用注射法导入农杆菌还有就是把植株取出放入侵染液中用真空渗透法导入

感受态制备及转化方案二

1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV3101

2、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。28℃培养。

3、农杆菌感受态细胞的制备：

1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。

2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；

3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；

4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；

5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；

6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；

制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。

4、DNA直接转化农杆菌：

1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；

2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；

3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；

4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。2天左右菌落可见。

（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str

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普通农杆菌感受态制备与转化：

1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。

2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。

3. 5k rpm离心5分钟。

4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。

5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。

如不是马上使用，可以将之按200ul分裝储存于-80℃待用。

6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。

7. 液氮中冷冻1分钟。

8. 37℃水浴溶化细胞。

9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。

10. 离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。

11. 涂板，28℃培养2-3天。

电转农杆菌感受态细胞制备与转化

1．挑取单克隆接种于2mlYEP（含50mg/l链霉素）液体培养基，28℃，250rpm，振荡培养过夜。（如用5mlYEP，需培养36h）

2．将菌液按1:100转移至200mlYEP（含50mg/l链霉素）培养液中，28℃，250rpm，振荡培养至OD=0.3(约4~5h)。

3．转入50ml的无菌离心管，4℃，4000rpm离心10min，弃上清。

4．用20ml冰浴的HEPES(1mM，PH-7.0)重悬。

5．4℃，4000rpm离心10min，弃上清。

6．重复4、5步骤2~3次。

7．用2ml冰浴的10%甘油重悬。

8．每管100µl分装于1.5ml无菌的Eppendorf管中，-70℃保存。

1mM HEPES的配制：称取0.119gHEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500ml，用NaOH调pH至7.0，灭菌后待用。

注：HEPES需现用现配。

电击法转化农杆菌感受态细胞

1．取出农杆菌感受态细胞于冰上冻融。

2．加2µl质粒DNA于100µl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀。

3．取出细胞与质粒的混合物转入电击杯中(电击杯-20℃预冷)，在2500V高压