核酸化学及研究方法考试复习题

核酸化学及研究方法

名词解释：

正向遗传学：是指通过生物个体或细胞的基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关的表型或性状改变，然后从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能。

核小体组蛋白修饰：核小体组蛋白八聚体中每个组蛋白多肽链的N末端游离在核心之外，常被一些化学基团修饰，组蛋白修饰的种类包括①乙酰化：赖氨酸的乙酰化②甲基化：赖氨酸和精氨酸的甲基化③磷酸化：丝氨酸的磷酸化③磷酸化：丝氨酸的磷酸化

位点特异性重组：（site-specific recombination）是遗传重组的一类。这类重组依赖于小范围同源序列的联会，重组也只发生在同源的短序列的范围之内，需要位点特异性的蛋白质分子参与催化，重组的蛋白不是rec 系统而是int

转座机制：细菌转座子通过“剪切-黏贴”机制进行转录，转座酶两个不同亚基结合在转座子的特定序列上，两个亚基靠在一起形成有活性的二聚体，导致转座子的切除，转座酶-转座子复合物结合到靶DNA上，通过转座酶的催化将转座子整合到新位点上

基因敲除：利用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，外源DNA 与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。此法可产生精确的基因突变，从而达到基因敲除的目的。

Sanger双脱氧终止法：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序

荧光实时PCR技术原理：

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

1. .SYBRGreenⅠ法：

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

2.TaqMan探针法：

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

双分子荧光互补(BiFC)技术原理：将荧光蛋白在某些特定的位点切开，形成不发荧光的N和C端2个多肽，称为N片段(N-fragment)和C片段(C-fragment)。这2个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发地组装成完整的荧光蛋白，不能产生荧光。但是，当这2个荧光蛋白的片段分别连接到一组有相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这两个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的2个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，并在该荧光蛋白的激发光激发下，发射荧光。简言之，如果目标蛋白质之间有相互作用，则在激发光的激发下，产生该荧光蛋白的荧光。反之，若蛋白质之间没有相互作用，则不能被激发产生荧光。

问答题：

1. 怎样将一个基因克隆到pET32a载体上；原核表达后，怎样纯化该蛋白？（1）基因克隆

1.目的基因的获取：根据同源基因的保守区段设计引物，然后以该生物的总

DNA为模板进行PCR扩增，获得目的片段

2.酶切：在精确的位置切割目标DNA。用限制性内切酶对DNA进行酶切

3.选择克隆载体。它们通常是质粒或病毒DNA。通常实验室用T载体作为

克隆载体

4.连接：用DNA连接酶共价连接目的DNA片段和克隆载体，形成重组质

粒。

5.转化：将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，然后扩大培养，并进行

测序验证DNA序列是否正确。

6.将测序正确的重组质粒进行酶切，并连接到pET32a表达载体上，获得重

组的表达载体。

7.将重组的过量表达载体转化进入大肠杆菌感受态细胞中，通过菌落PCR

或者酶切或者测序，鉴定是否含有重组DNA。

（2）纯化蛋白

①表达融合蛋白的标签：

②利用标签蛋白的亲和纯化：谷胱甘肽转移酶，一种分子量较小的酶，26KD，可以特异结合谷胱甘肽；加入谷胱甘肽，可以竞争地将与beads-谷胱甘肽结合的重组蛋白洗脱下来

2. 通过哪几种方法可以获得cDNA的全长？简述其原理。

（1）同源序列法：根据基因家族各成员间保守氨基酸序列设计简并引物，并用简并引物进行RT-PCR 扩增，得到该基因的部分cDNA 序列，再用RACE 获得cDNA 全长。

（2）功能克隆法：在鉴定已知基因功能后，进而分离目标基因的一种方法。生物种、属间基因编码区的同源性一般高于非编码区，当其他种属的同源基因被克隆后，构建含目的基因的cDNA 文库或基因组文库，用已知的基因序列作为探针，可克隆到同源基因。

3. 什么是DNA探针、种类及标记的方法有哪些？

①探针（probe ）：指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又

能被特殊方法检测的已知被标记（同位素或非同位素标记）的核苷酸链

②探针种类：

ⅰ基因组DNA 探针为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。

ⅱcDNA 探针以mRNA 为模板经逆转录酶催化产生的互补于mRNA 的DNA 链。

ⅲRNA 探针以DNA 两条链中的任意一条为模板转录生成RNA 。具高杂交效率，但易于降解和标记方法复杂。

ⅳ寡核苷酸探针

③探针标记方法：

Ⅰ随机引物法（random priming ）利用DNA 聚合酶来合成与模板互补的新的DNA 链。将6-8 寡核苷酸片段与已变性的DNA 单链或RNA 模板退火，在大肠杆菌DNA 聚合酶I Klenow 片段作用下，以同位素标记的dNTP 为原料，寡核苷酸为引物的3’-OH 端开始沿5’至3’方向，合成一条与模板互补的DNA 链。

Ⅱ切口平移法：胰DNA 酶Ⅰ在DNA 双链上随机切开若干切口，切口处形成3’-OH 末端。大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ从切口处开始作用，以另一条DNA 链为模板。4 种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解5’端核苷酸和3’端修复加入标记核苷酸同时进行，切口平行推移。生成

的两条链都被同位素均匀标记。

Ⅲ末端标记法ⅰ5’端标记法：T4 噬菌体多苷酸激酶用碱性磷酸酶切除DNA 双链分子或RNA 单链5’末端的磷酸基团，使其成为5’-OH，然后在（γ- 35 S ）ATP 存在下，经T4 噬菌体多苷酸激酶催化，将γ位上的35 S 转移到DNA 或RNA 分子的5’-OH 末端，使DNA 片段或RNA 或寡核苷酸5’端均带35 S 标记。ⅱ3’端标记法利用末端转移酶

4. 哪些方法可以检测转录水平(mRNA水平)的表达差异？简述原理。

根据分析方法的原理和功能特性，可将基因表达分析分为：1）封闭性系统研究方法：例如DNA 微阵列、Northern 印迹、实时RT-PCR 等方法，其应用范围仅限于已测序的物种，只能研究已知的基因。

2）开放性系统研究方法: 如差异显示PCR 、双向基因表达指纹图谱、分子索引法、随机引物PCR 指纹分析等，可以发现和分析未知的基因。

a.Northern 印迹杂交是应用DNA 探针检测特异mRNA 的一种杂交技术，主