蛋白酶体活性测定与组分分析方法的建立
蛋白酶活力测定方法
酸性蛋白酶产品概述:蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。
由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。
包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。
蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。
蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。
工作机理蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。
在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。
酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。
本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。
它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。
酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。
从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。
这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。
（酸性蛋白酶537容易失活）简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。
1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml.2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml）特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5使用方法1、白酒工业：本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。
蛋白酶测定方法
蛋白酶活性测定方法一蛋白酶活力单位定义1g 固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个活力单位，以u/g(u/mL)表示。
二测定原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加人三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。
根据吸光度计算其酶活力。
三应用范围本法适用于各种含有酸性蛋白酶的复合酶和液体酶及单酶的测定。
四测定条件4.1 底物：酪蛋白4.2 pH： 3.004.3 温度： 40℃±0.5℃4.4 保温时间： 10min五仪器5.1 紫外分光光度计5.2 超级恒温水浴40±0.2℃5.3 秒表5.4 分析天平：感量0.0001g六试剂和溶液6.1.2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4 mol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4 g ，用水溶解并定容至1000 mL。
6.1.3 三氯乙酸c(CCI3·COOH)=0.4 mol/L称取三氯乙酸65.4 g ，用水溶解并定容至1000 mL。
6.1.4 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L按GB 601配制。
6.1.5 盐酸溶液c(HCl)=1 mol/L及0.1 mol/L按GB 601配制。
6.1.6 缓冲溶液a.磷酸缓冲液(pH=7.5)，适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)6.02 g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H20)0.5 g，加水溶解并定容至1000 mL。
b.乳酸缓冲液(pH=3.0 ) 适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸(80%～90%)10.6 g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液称取乳酸钠(70%)16 g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL,混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。
《蛋白酶的测定方法》课件
色谱法的注意事项
总结词
色谱柱的维护、流动相的选择
详细描述
色谱法测定蛋白酶时，需要关注色谱柱的维 护，保持其良好的分离效果。同时，要根据 实验需求选择合适的流动相，以获得准确的 蛋白酶分离和测定结果。
电泳法的注意事项
总结词
电泳参数的选择、染色剂的配制
详细描述
电泳法测定蛋白酶时，应选择适当的电泳参数，如电压、电流和电泳时间。同时，要关 注染色剂的配制和使用，以确保电泳结果的准确性和可重复性。
测定方法的操作简便性
比较不同测定方法的操作流程、所需试剂和 仪器等方面的简便程度。
测定方法的适用范围
比较不同测定方法的应用范围，例如适用于 何种类型的蛋白酶、何种样本类型等。
测定方法的成本
比较不同测定方法的实验成本，包括试剂、 仪器、人力和时间等方面的成本。
测定方法的选择
根据测定目的选择
根据实验目的选择适合的测定方法，例如若需要快速筛选蛋白酶，可 选择简便快速的测定方法。
设定温度和时间
设定适宜的反应温度和时间。
加入酶液和底物
将酶液和底物溶液混合，开始 反应。
结果测定
通过分光光度计等仪器测定反 应过程中的吸光度变化，计算
酶活力。
色谱法的操作流程
样品制备
将待测样本进行适当的处理和稀释。
柱层析分离
将处理后的样本通过色谱柱进行分离 。
洗脱和收集
用适当的溶剂对色谱柱上的组分进行 洗脱和收集。
蛋白酶的分类
总结词
根据作用方式和底物特异性，蛋白酶可分为多种类型，如胃蛋白酶、胰蛋白酶等。
详细描述
根据作用方式和底物特异性，蛋白酶可分为多种类型。例如，胃蛋白酶主要在胃液中发挥作用，能够分解蛋白质 成多肽；胰蛋白酶则主要在胰腺和小肠中发挥作用，能够分解蛋白质成氨基酸和较小肽段。此外，还有许多不同 类型的蛋白酶，如弹性蛋白酶、胶原蛋白酶等，分别具有不同的底物特异性和生理功能。
蛋白酶活性测定方法
2.0.4M碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g用水溶解和定容至1，000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。
3.0.1M三氯醋酸（TCA）：用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1，000ml。
4.L—酪氨酸。
5.缓冲液：磷酸二氢钙—氢氧化钠缓冲液。
A：0.2mol/L KH2PO4 (ml): 50;
1.5操作步骤
将酪蛋白溶液放入30℃恒温水浴中预热5min，取1ml酶液注入试管中，按以下程序操作。
酶液1ml——————————————在30℃恒温水浴中预热1—2min
+
2%酪蛋白1ml——————————加入时立即记时，精确反应10min
+
0.4MTCA 2ml—————————立即摇匀，终止反应。
将各管剧烈混合并在30℃保持30min，以完全沉淀反应后过量的酪蛋白。
从水浴中取出静止10min过滤（11cm的whatman43#滤纸）
+
滤液1ml
+
0.4Байду номын сангаасNa2CO35ml
+
稀释福林试剂1ml
摇匀，30℃恒温水浴显色20分钟
测定OD值————————用720型分光光
度计测定（波长680nm）
空白试验：酶液1ml，先向其中加入三氯醋酸，然后加酪蛋白溶液。其余步骤同试验。
B：0.2mol/L NaOH(ml) 29.63
C：水（ml）120.37
PH（20℃）：7.0
6．酪蛋白溶液：精确称取酪素2.000g，先用少量0.5N氢氧化钠浸润后，加入少量缓冲液，在沸水浴中加热，经常但不要剧烈的搅拌使之完全溶解，冷却后移入100ml容量瓶中，并用相应的缓冲液定容到刻度。若定容时泡沫过多，可加入1~2滴乙醇消泡。酪蛋白溶液可在4℃保存一周，变质后不能使用。
蛋白酶的测定方法
5、2%酪蛋白溶液
称取干酪素 2g加入0.1mol/L 氢氧化钠 20ml 在水浴中加 热使溶解 (必要时用小火加热煮沸 )，然后用 pH2.5乳酸-乳 酸钠缓冲液定容至1000ml即成。
配制后应及时使用或放入冰箱内保存。否则极易繁殖 细菌，引起变质。
配制酪蛋白溶液定容时，若泡沫过多，则可加 1~2滴酒 精消泡。 3350 酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，应加弄乳酸 2~3滴湿润。
响应面法优化蛋白酶生产工艺 （下）
实验内容
1 、干物质失重的测定 2 、蛋白酶活力的测定 3 、数据分析与建模 4 、响应曲面作图 5 、整改方案分析
一、干物质失重的测定
干重失重＝发酵前干重－发酵后干重
二、蛋白酶活力分析
1、 原理
（1）、福林试剂在碱性情况下极不稳定，可被酚类化合物还 原而呈蓝色反应。
四、响应曲面作图
作出本次实验的2D 与3D 曲面图。
R1 55.3
28.8
X1 = A: A X2 = B: B
Actual Factor C: C = 65.00
72
ossypol(μg/g)
62 52 42
g
e
Fre
32
1.92
1.71
0.18 0.14 0.10 0.06
1.50
1.29 (NH4)2SO4 (%)
（2）、蛋白质分子中含有具有酚基的氨基酸 (酪氨酸、色氨 酸及苯丙氦酸等)。
（3）、以酪蛋白为底物，同酶液反应，经一定时间后，加 三 氯醋酸，终止酶反应，并使残余的酪蛋白质沉淀，同水解产 物分开，经过滤后取滤液。用碳酸钠碱化，再加入福林试剂 使之发色，用分光光度计测定。
（4）、蓝色反应的强弱，同蛋白水解产物的多少成正比而水 解产物的量又是同酶活力成正比例关系。因此，根据蓝色反 应的强弱就可推测蛋白酶的活力。
实验四蛋白酶活力的测定方法
第一部分啤酒工艺综合实验实验一还原糖的测定 3 实验二α-氨基氮的测定（茚三酮法） 4 实验三双乙酰（紫外分光光度法） 5 实验四总酸（电位滴定法） 6 实验五酒精度7 实验六原麦汁浓度（蒸馏——密度法）9 实验七真正发酵度(实际发酵度) 10 实验八协定法糖化和外加酶糖化法11第二部分通风发酵综合实验实验一淀粉质原料的水分测定12 实验二原料中粗淀粉的测定13 实验三还原糖的测定17 实验四蛋白酶活力的测定方法19 实验五糖化酶的测定方法22 实验六玉米淀粉液化及糖化24 实验七面包酵母流加培养与分批培养试验27 实验八糖化酶的发酵和提取实验31 实验九酸性蛋白酶固态发酵实验34第一部分啤酒工艺综合实验实验一还原糖的测定1原理本法是利用含有自由醛基的还原糖，在碱性溶液中，能将二价铜还原成氧化亚铜的性质进行测定。
2仪器下端弯曲与管身成直角的滴定管。
3试剂（1） 0.1N 硫代硫酸钠标准溶液配制：溶26克硫代硫酸钠及0.2克无水碳酸钠于1000ml水中。
缓和煮沸10min，冷却。
将溶液保存于棕色具塞瓶中，放置一周后过滤备用。
标定：称取于120℃烘至恒重的重铬酸钾0.2克，称准至0.0002克，置于500ml 具塞锥形瓶中，溶于25ml煮沸并冷却的水中，加2克碘化钾及20ml 4N的硫酸。
待碘化钾溶解后，于暗处放置10min，加250ml水，用0.1 N硫代硫酸钠溶液滴定，近终点时加3ml 0.5%淀粉指示剂，继续滴定至溶液由蓝色转变成亮蓝绿色。
同时作空白试验校正结果。
硫代硫酸钠标准溶液当量浓度N按下式计算：N= G/0.04903V式中： G——重铬酸钾的重量（克）V——硫代硫酸钠溶液的用量（ml）0.04903——每毫克当量重铬酸钾的克数（2） 4N的硫酸溶液边搅拌边将56ml的浓硫酸小心地加入到约350ml蒸馏水中，并定容至500ml。
（3） 0.5%淀粉溶液1.25g可溶性淀粉，加少量水调成糊状，在不断搅拌下注入200ml沸水中，微沸2min，冷却，加水稀释成250ml。
05-02-004教学课件-蛋白酶活力测定(精)
质生成胨、月示、多肽、氨基酸的一类酶的总称。
存在：动物内脏、 植物茎叶、果实
微生物细胞
不同种类的生物，分泌蛋白酶的种类和性质不同， 因此，利用外源蛋白质类物质的能力也不同。
人体内外源蛋白质的消化过程 食物中的大分子蛋白质经胃蛋白酶分解成 较小 分子的多肽经十二指肠分泌胰蛋白酶、糜蛋白酶、
羧肽酶和氨肽酶等分解成短链的肽和部分游离氨
基酸。 短链的肽经羧肽酶和氨肽酶分解成游离氨基酸。
外源蛋白质经上述消化器官内各种酶的协同作用， 最后全部转变为游离氨基酸。
蛋白酶分类：按来源分类 （1）动物蛋白酶: 如胰蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳酶
（2）植物蛋白酶：
木瓜蛋白酶：最适 pH5-7，作用pH范围3-9；最适温度 65℃，作用温度范围30-70℃，生成产物：氨基酸。 菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶 （3）微生物蛋白酶： 霉菌蛋白酶、细菌蛋白酶
蛋白酶分类：按蛋白酶作用位点分 （1）内肽酶(endopeptidase)：从蛋白质或多肽内部水解
肽键产生各种短肽的酶。
（2）外(端)肽酶(exopeptidase)：从蛋白质或多肽一端水 解肽键，每次水解放出一个氨基酸。又分为氨肽酶、羧
肽酶。
（3）二肽酶：水解二肽中的肽键，生成单个氨基酸的酶。
蛋白酶活力测定方法：紫外分光光度法
子情境：酶制剂发酵产品检验- 蛋白酶活力测定
蛋白质：由20多种天然氨基酸通过肽键（―CO―NH―）
连接成为多肽，再由多肽聚合成生物大分子的物质。
外源蛋白质—胞外蛋白酶 内源蛋白质—溶酶体中的蛋白酶 蛋白酶：催化蛋白质类化合物中肽键水解，分解蛋白 质生成胨、腙、多肽、氨基酸的一类酶的总称。
蛋白酶：催化蛋白质类化合物中肽键水解，分解蛋白
蛋白酶K活性检测方法建立
*通讯作者 收稿日期：2012-06-06 基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目(2009BAK61B04)。 作者简介：林霖(1987—)，女，硕士，工程师，研究方向为食品生化检测。
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食品科技
2013年 第 38卷 第 2期 FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
食品安全与检测
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 2013年 第 38卷 第 2期
蛋白酶K活性检测方法建立
林 霖，李 淅，潘兰芳，张 宇，兰全学，杨国武* (深圳市计量质量检测研究院，深圳 518131)
摘要：蛋白酶K常用于核酸提取实验中，其作用为去除基因组中的组蛋白以及去除核酸中的DNA 酶和 RNA 酶 。 目前已有许多国家标准采用分子生物学技术检测食品中的转基因成分 、 动物属 性、食源性致病菌、病毒等，其中核酸提取均需使用蛋白酶K。然而由于目前缺乏统一的蛋白酶 K活性检测标准，各个厂家均有各自的活性检测方法，其采用的底物、缓冲液、pH值、温度均 大不相同，这也导致了酶活性定义大不相同，这使得所购买的蛋白酶K酶活性不统一，间接也影 响了核酸提取的质量导致影响了检测结果。在现有国标蛋白酶活性检测标准基础上对检测方法 进行改进，使其更接近使用的条件和温度，为标准建立提供参考。 关键词：蛋白酶K；活性检测；丝氨酸蛋白酶；紫外分光光度法 中图分类号：TS 207 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2013)02-0266-05
Method for proteinase K activity detection
LIN Lin, LI Xi, PAN Lan-fang, ZHANG Yu, LAN Quan-xue, YANG Guo-wu*
蛋白酶活力的测定
实验:蛋白酶的活力测定一、实验目的1、学习蛋白酶活力的测定方法。
2、深入了解酶的活力和比活力的概念。
二、实验原理1、酶活力的大小，是以该酶在适宜的温度和pH下，酶催化一定时间后，反应底物的减少量或者反应产物的增加量来表示。
2、本实验蛋白酶的活力大小是以分解出的酪氨酸的量来表示，其单位为：每分钟内分解出1微克酪氨酸的酶量称为1单位。
3、本实验采用福林-酚与蛋白质水解出的酪氨酸生成兰色物，从兰色的深浅程度可以求知酪氨酸的多少，从而确定酶活力的大小。
4、在测酶活力前，先用福林-酚与用已知的不同浓度的酪氨酸作用，作出兰色深浅程度（用光密度表示）与酪氨酸浓度关系的标准曲线。
5、将酶与底物反应产生的产物与福林-酚试剂作用后测光密度，从标准曲线上查出相当于多少微克的酪氨酸，就可以计算出酶的单位了。
三、实验材料、仪器和试剂1.实验材料1398中性蛋白酶粗酶粉（上海新型发酵厂）、滤纸2.仪器（1）试管（1.5*15cm*24) (2)移液管（3）电热恒温水浴（4）721型分光光度计3.试剂（1）福林-酚试剂B（2）标准酪氨酸溶液称取50毫克酪氨酸（预先在105摄氏度烘至恒重），加0.2MHCL溶液后定容至100ml，在加水稀释5倍得到100微克/毫升的酪氨酸溶液。
（3）酪蛋白溶液称取酪蛋白2克，置150ml三角烧瓶中，加入0.2M磷酸氢二钠61ml，在水浴上搅拌使溶解，再加入39ml0.2M磷酸二氢钠，得到pH7的酪蛋白液，倾出上清液备用。
（4）0.4M三氯醋酸溶液（TCA）（5）0.4M碳酸钠溶液四、操作步骤1、酪氨酸标准曲线制作：按下列次序加入试剂，混合均匀，保温，然后在分光光度计上进行比色，测出650nm处的光密度值。
以酪氨酸浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。
管号 1 2 3 4 5 62、蛋白酶活力测定 （1）浸出酶液称取0.5克酶粉加入40ml 水，在室温下放置1小时并时加搅动。
将酶浸出液过滤，取滤液1ml 用水稀释至20ml ，即为稀释1600倍的酶液。
蛋白酶活性的测定
华南农业大学综合实验报告实验项目名称：酶活力测定实验项目性质：综合实验计划学时：所属课程名称：食品与发酵工业分析实验完成时间：2013.05.10糖化酶活力测定（直接滴定法）1、原理采用可溶性淀粉为底物，在一定的pH值与温度下，使之水解为葡萄糖 (还原糖)，以直接滴定法测定。
2、试剂及仪器（1）碱性酒石酸铜钾溶液（使用时等体积混合甲、乙溶液）：甲液：称取15.693g硫酸铜(Cu2SO4·5H2O)，0.05g次甲基蓝，用水溶解并稀释定容至1000mL；乙液：称取50g酒石酸钠钾，54g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释定容至1000mL（2） 0.1%标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先在100-1050C 烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。
（3） pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液：0.2mol/L乙酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀释至1000mL；0.2mol/L 乙酸钠溶液：称取27.2g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），用水定容至1000mL；pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸钠溶液等体积混合。
（4） 0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL。
（5） 2%可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉（预先于10-105 0C烘干），加少量水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。
（6）固体曲（7）滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶3、测定步骤（1） 5%固体曲浸出液制备：称取5.0g固体曲（以绝干曲计），置于250mL 烧杯中，加90mL水和10mL pH4.6乙酸－乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30℃水浴中保温浸1小时，每隔15min搅拌一次。
用脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。
（2）固体曲糖化液的制备：吸取25mL 2％可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶中，于30℃水浴预热10min。
蛋白酶活性的测定
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二、实验原理蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。
本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。
在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力。
三、实验试剂①微生物蛋白酶萃取液（0.01g/ml）：称取1.0g酶制剂，加100ml蒸馏水搅拌30min，在4℃下离心分离后，将上层清夜置于冰箱中保存，使用前稀释一定倍数；②0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.5）；③1%酪蛋白溶液：取1.0g酪蛋白，加100ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.5），加热并搅拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存；④5%三氯醋酸（TCA）溶液。
四、实验步骤1、将5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37℃下保温。
2、取四支15ml具塞试管，分别标上记号A1、A0、B1和B0。
在A1和A0试管中各吸入0.20ml酶液，在B1和B0试管中各吸入0.40ml酶液，分别用0.2mol/L磷酸盐缓冲液定容至2.00ml。
在A0和B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液，上述四支试管都置于37℃水浴中保温。
测定蛋白酶活力实验
测定蛋白酶活力实验一、实验目的1.加深了解酶活力的概念。
2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。
二、实验原理酶活力指酶催化某一特定反应的能力。
其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。
酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。
本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。
实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。
产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。
因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。
三、仪器和试剂仪器:恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。
原料枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.02mol/L，pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。
使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。
试剂1. Folin-酚试剂：在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。
再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。
冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。
使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。
2. 0.2mol/L 盐酸溶液3. 0.04mol/L 氢氧化钠溶液4. 0.55mol/L 碳酸钠溶液5. 10%三氯乙酸溶液6. 0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 . 12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A 液)；称取磷酸二氢钠(Na2HPO4.12H2O)3.12g，用水定容至100mL(B 液)。
蛋白酶及其活力的测定
第３ ５卷 第 ６期 ２Ｏ０ ８年 ｌ １月 文章编号：ｏ ２ ８ １ （０ ８Ｏ — １ Ｏ ０ ｌ０ — ｌ０３５ № ． ｌ ． ６ Ｎ０ ． ２ ｏ８ ｖ． ０
Ｌ Ｕ Ｒ ＭＡ ＩＧ Ｉ ０ Ｑ Ｋ Ｎ
蛋 白酶及 其活 力的测定
张学英
（ 瑚 南农业大学食 品科技学 院， １ 长沙 ４０２ ； ２ １１ ８ ． 自治州产商 品监督检验所， 湘西 湖南 吉首 ４６０ ） ｌ Ｏ ｏ
摘
要 ： 白质是生物生长繁殖氮源的重要 来源， 白质 为复 杂大分子物质。 白质被蛋 白酶在生化反 应 中水 蛋 蛋 蛋
解为多种 ｄ一氨基酸等 ， 才可被机体吸收或被微生物利用。 白酶分解能 力大小的指 标是蛋 白酶活力的 大小 。 蛋 测定蛋 白酶活力的大小是评判蛋 白酶质量的关键 ， 可用于指导生产（ 以酿酒生产为例 ） 。同时通过控 制蛋 白酶 活力的影响 因素 ， 完善蛋 白酶生化反应环境。 关键词 ： 白质 ； 白酶 ； 蛋 蛋 活力测定 ； 影响 因素
中 图分 类 号 ： Ｑ９ ５ ；ｓＯ ． Ｔ ２．Ｔ ２７ ２ ３ 文献 标 识 码 ： Ｂ
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蛋白酶活性的测定
实验四蛋白酶活力得测定一、实验目得1、了解蛋白酶活力测定得原理;2、掌握蛋白酶活力测定得方法。
二、实验原理蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中得肽键,也能够水解酰胺键与酯键,因此可用蛋白质或人工合成得酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶得活力、本实验选用酪蛋白为底物,测定微生物蛋白酶水解肽键得活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后,降解成相对分子质量较小得肽与氨基酸,在反应混合物中加入三氯醋酸溶液,相对分子质量较大得蛋白质与肽就沉淀下来,相对分子质量较小得肽与氨基酸仍留在溶液中,溶解于三氯醋酸溶液中得肽得数量正比于酶得数量与反应时间。
在２８0ｎm波长下测定溶液吸光度得增加,就可计算酶得活力。
三、实验试剂①微生物蛋白酶萃取液(0、01g/ml):称取１。
0ｇ酶制剂,加１00ｍl蒸馏水搅拌30min,在4℃下离心分离后,将上层清夜置于冰箱中保存,使用前稀释一定倍数;② 0。
０2mol/L磷酸盐缓冲液(ｐH7.5);③ 1％酪蛋白溶液:取1、0g酪蛋白,加10０ml 0。
2mｏl/L磷酸盐缓冲液(PＨ7。
５),加热并搅拌使它完全分散,然后置于冰箱中保存;④ 5%三氯醋酸(TCA)溶液。
四、实验步骤1、将5％TCA溶液与1％酪蛋白溶液在37℃下保温。
２、取四支1５ml具塞试管,分别标上记号A1、Ａ０、Ｂ1与B０、在A１与A ０试管中各吸入0、20ml酶液,在Ｂ１与B0试管中各吸入0.４0ml酶液,分别用0.2mｏl/L磷酸盐缓冲液定容至２、00ml。
在A0与B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液,上述四支试管都置于37℃水浴中保温、3、在各试管中吸入2。
00mｌ1％酪蛋白溶液,在３7℃下保温10ｍin(准确计时)后,再向A1与Ｂ1试管中吸入6。
00ml５％三氯醋酸溶液。
4、将试管从水浴中取出,在室温下放置1h,用少量上清液润湿滤纸后过滤,保留滤出液。
5、在2８０ｎｍ波长下,分别以A0与B0滤液为空白,测定A1与B１滤液得吸光度。