临床免疫学自身抗体检测及应用

第二十章自身抗体检测及应用本章考点1.概念2.自身抗体的特性、概念3.常见自身抗体的检测4.自身抗体检测的临床应用自身免疫：当机体免疫系统受某种因素作用使自身免疫耐受削弱或破坏时，免疫系统会对自身成分包括：正常或变性的组织、器官、细胞、蛋白质或酶类等自身抗原产生免疫应答反应，出现自身抗体或致敏淋巴细胞的这种现象称为自身免疫。

自身免疫性疾病：当某种原因使自身免疫应答过分强烈时，也会导致相应的自身组织、器官损伤或功能障碍，这种病理状态称为自身免疫性疾病。

自身抗体；血循环中针对自身组织、器官、细胞及细胞内成分的抗体称为自身抗体。

正常人血清中可有多种微量的自身抗体或致敏淋巴细胞，它能清除体内衰老细胞而起到免疫稳定的效应。

第一节自身抗体的特性自身抗体是自身免疫性疾病的重要标志。

每种自身免疫性疾病都伴有特征性的自身抗体谱。

患者血液中存在高效价自身抗体是自身免疫性疾病的特点之一，也是临床确诊自身免疫性疾病的重要依据。

产生自身抗体的抗原包括以下几种：化学修饰的组织抗原；与自身组织成分存在交叉反应的外来抗原；隐蔽抗原；自身细胞HLA-DR抗原的表达以及低分化的组织抗原等，在一定条件下，均可刺激机体产生自身抗体。

自身抗体与疾病的关系：某些自身抗体对某种疾病的诊断具有高度特异性，已经成为该病的血清标记性抗体或特异性抗体；某些自身抗体与疾病的活动性有相关性；少数自身抗体参与了免疫病理性损伤。

测定自身抗体的意义：自身免疫性疾病的诊断；疾病活动性的判断；疗效的观察；指导临床用药等。

第二节常见自身抗体的检测自身抗体种类很多，这里只是简单介绍几种常见的自身抗体的检测。

一、类风湿因子（一）概念类风湿因子（rheumatoid factor，RF）是一种抗人或动物IgG分子Fc片段抗原决定簇的抗体，是以变性IgG为靶抗原的自身抗体。

可与人或动物的变性IgG结合，而不与正常IgG发生凝集，最多见于类风湿性关节炎患者。

Rose等1984年在RA（rheumatoid arthritis）患者血清中发现RF。

RF有IgM、IgG、IgA和IgE型，IgM型为主要类型。

（二）检测方法1.胶乳凝集试验：以IgG吸附于聚苯乙烯胶乳颗粒上，如血清中含有RF，可与乳胶颗粒出现凝集反应。

该法只能定性或半定量，灵敏度及特异性不高，只能检测IgM型RF。

2.速率散射比浊法：定量检测、准确、快速，准确性和敏感性高于胶乳凝集实验。

也只能检测IgM型RF。

3.ELISA法：可检出不同Ig类型的RF，在酶标记抗体时，分别标记IgG、IgA或IgM。

（三）临床应用RF主要见于类风湿，在类风湿性关节炎患者中的检出率很高，RF阳性支持早期RA的倾向性诊断，对年轻女性应进行RA和风湿热的鉴别；而对非活动期RA的诊断，需参考病史。

但RF也像ANA一样，并不是RA独有的特异性抗体。

在SLE患者约有50%RF阳性，在其他结缔组织病如SS、硬皮病、慢性活动性肝炎以及老年人中均可有不同程度的阳性率。

部分正常人也可出现。

但RF滴度或含量一般较低（<40IU／ml）。

RF无严格特异性，不是RA的唯一诊断标准。

RF阴性不能排除RA。

IgM型RF：>80IU／ml伴严重关节功能障碍者，提示预后不良。

IgG型RF：与患者滑膜炎、血管炎和关节的症状密切相关。

正常人以及非RA患者中很难检出。

IgA型RF：10%RA可检出，为RA临床活动的指标，与骨质破坏以及关节炎症状的严重程度显著相关。

IgE型RF：在关节液、胸水中高于血清水平。

二、抗核抗体抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）是以自身真核细胞成分作为靶抗原的一组自身抗体的总称，泛指各种核成分的抗体，是一种广泛存在的自身抗体。

迄今已发现20余种。

性质主要是IgG，也有IgM、IgA、IgD和IgE，可与不同来源的细胞核起反应，无器官特异性和种属特异性。

ANA主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液以及尿液等体液中。

ANA可见于多种疾病，主要存在于自身免疫性疾病患者血清中，如SLE、SS、MCTD、类风湿性关节炎等。

也可见于慢性肝病、病毒感染以及正常老年人、妊娠妇女等。

ANA阴性不能排除自身免疫性疾病的诊断；阳性也不一定是自身免疫性疾病。

由于细胞核成分的复杂性，不同成分的抗原性也不同；因此就会有多种不同类型的ANA。

ANA在不同的疾病中呈现不同的组合，不同的疾病有自己的抗核抗体谱。

有些ANA只是针对某一特定成分，只在某一疾病中出现，成为该病的血清标志性抗体。

ANA是一个重要的筛选试验。

分类：按理化特性和抗原分布部位分为四大类。

包括抗DNA抗体、抗组蛋白抗体、抗非组蛋白抗体、抗核仁抗体。

命名：1.根据抗原化学名称命名：例如抗dsDNA、抗RNP。

2.以第一位检出患者命名：例如抗Sm、抗Ro、抗La抗体。

3.以相关疾病命名：例如抗SSA、抗SSB抗体。

（一）检测方法由于ANA的复杂性及多样性，故测定方法繁多。

目前ANA常用的方法有免疫荧光法、放射免疫法、ELISA、免疫双扩散、对流免疫电泳及免疫印迹技术等。

常用间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence，IIF）作为总的ANA筛选试验。

鼠肝常用于检测抗核抗体，但近十年来多被HEp-2细胞所代替，这是因为HEp-2细胞具有以下特点：人源性；细胞核大；分裂期细胞多；可大批量培养。

当然，单个细胞不可能替代组织切片，所以鼠组织切片仍继续用于自身抗体的检测。

放射免疫法：常用于检测抗DNA抗体，有Farr法及过滤法。

①Farr法的原理为用同位素标记DNA，被标记的DNA和被检血清的抗DNA抗体结合，经50%硫酸铵饱和液沉淀，然后比较沉淀物和上清液中的放射活性，从而得出DNA结合活性，一般结合率大于20%为阳性。

②过滤法是在分离结合物时用纤维素酯薄膜滤器（孔径为0.45μm）进行过滤，游离的DNA被滤去而与抗体结合的复合物被阻留在滤膜上。

ELISA法：临床上主要是应用间接ELISA检测抗dsDNA抗体，其重复性及敏感性均较对流免疫电泳及双扩散为高。

目前已有试剂盒供应。

免疫印迹（immunoblotting）法：先将混合抗原作凝胶电泳，分离开不同的区带，然后将这些带转印到硝酸纤维素膜上，最后用酶标抗体或放射性同位素标记抗体进行检测和分析。

由于该试验不需纯化的单个抗原，可在同一固相上作多项分析检测，灵敏度高，特异性强。

故目前已广泛用于自身免疫病患者血清中多种自身抗体的检测，如检测抗Sm抗体、抗RNP抗体、抗SS-A抗体及SS-B抗体等。

另外，还可用传统的琼脂双向扩散法、对流免疫电泳法、间接血凝法和补体结合试验等。

这些试验要求的实验条件比较低，但敏感性也比较低。

均质型斑点型核仁型核膜型（二）常见ANA荧光图形及临床意义1.均质型：多是由抗DNP抗体所引起。

也可由核小体抗体和抗双链DNA抗体引起。

主要见于SLE，药物性狼疮。

2.斑点型：是由抗ENA抗体所引起。

主要见于SLE、MCTD、PSS、SS等。

高滴度的斑点型常见于MCTD。

3.周边型（又称核膜型）：主要由抗dsDNA的抗体所引起。

主要见于SLE。

特别是活动期患者。

4.核仁型：主要见于硬皮病。

相关抗体是抗核仁特异的低分子量RNA等。

5.着丝点型：主要见于局限性硬皮病及CREST综合征。

主要的靶抗原是着丝点B抗原。

（三）抗双链DNA抗体的检测方法检测抗DNA抗体的方法有多种，如ELISA、IIF、金标法、免疫印记法、放免法等。

其中最特异敏感的是应用锥虫或血鞭毛虫（如绿蝇短膜虫）作基质测定抗dsDNA抗体。

因为这些血寄生虫的动基体内含大量的纯dsNDA，无其他抗原干扰；在阳性结果时，可见鞭毛一端的动基体显示清晰的荧光。

因此该试验用于测定抗dsDNA抗体具有特异性强和敏感性高的优点。

另外，短膜虫对人畜无害，可以人工养殖，来源方便，值得推广。

抗dsDNA抗体是SLE的特征性标记抗体，是SLE活动期的重要指标。

抗体滴度的动态检测对疗效的监测提供了有价值的实验室手段。

抗dsDNA抗体对诊断SLE特异性较高；可达95%以上，但敏感性较低，仅为30%～50%，因此，抗dsDNA抗体阴性不能排除SLE的诊断。

抗dsDNA抗体在SLE的发病机制中起到重要作用。

如狼疮肾炎；血管炎；皮肤的蝶形红斑等均与该抗体有关。

三、抗ENA抗体谱（一）概述ENA（extractable nuclear antigens）是可提取性核抗原的总称。

ENA是细胞内许多小分子的RNA和多肽组成的非组蛋白的酸性核蛋白颗粒。

ENA主要包括Sm、RNP、SSA、SSB、Jo-1、Scb-70等抗原。

不同的自身免疫病可以产生不同的抗ENA抗体。

ENA抗体的检测对自身免疫性疾病的诊断和鉴别诊断具有重要意义。

（二）检测方法检测方法有多种，如免疫印迹法（immunoblotting，IBT）、ELISA、对流免疫电泳、双扩散、金标法等。

这里主要介绍免疫印迹技术。

免疫印迹技术属于膜载体酶免疫技术，其固相载体为吸附有抗原的硝酸纤维膜。

其基本原理为从小牛或兔胸腺提取ENA，经过SDS-PAGE电泳分成区带，然后转印至硝酸纤维膜上，将待检血清（含抗ENA抗体）加在硝酸纤维膜上，抗ENA抗体与ENA抗原结合，形成Ag-Ab复合物，加入酶标抗人IgG，形成Ag-Ab-酶标Ab复合物，然后加入底物显色。

与标准条带对比判读，可以确定不同的抗ENA抗体。

免疫印迹技术不需纯化抗原，灵敏度高，特异性强，操作简便，是广泛采用的检测抗ENA抗体的技术。

图1 ENA自身抗体谱标准对照带（三）抗ENA抗体的临床意义1.抗Sm抗体：是SLE的血清标志抗体，阳性率30%～40%。

阴性不能排除SLE的诊断。

抗Sm抗体水平与SLE活动性没有相关性，也不与临床表现相关，治疗后的SLE患者也可呈现抗Sm抗体阳性。

抗Sm抗体的检测对早期或不典型的SLE以及治疗后的SLE的回顾性诊断具有帮助。

2.抗核RNP抗体：高滴度的抗核RNP（nRNP）抗体是MCTD诊断的重要依据。

因其抗原为含有U1RNA的核蛋白复合物，故称U1RNP。

MCTD阳性率可高达95%。

也可见于其他自身免疫性疾病。

因为Sm与RNP为同一分子复合物（RNA-蛋白质颗粒）中的不同抗原位点，因此两种抗原具有相关性，常伴随出现，单一的抗Sm抗体阳性者较少见。

3.抗SSA／Ro／抗SSB／La：是干燥综合征（SS）最常见的自身抗体，抗SSB特异性较SSA高。

两者同时检测可提高SS的诊断率，抗SSA抗体也可见于SLE和其他自身免疫病，亚急性红斑狼疮患者、补体缺陷的SLE患者、新生儿狼疮患者可以出现抗SSA抗体。

IgG类抗SSA抗体通过胎盘进入胎儿后，可引起新生儿狼疮综合征，出现典型的SLE皮损。