各生理指标实验步骤

1丙二醛(MDA)含量得测定

丙二醛在酸性与高温得条件下,可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色得三甲川,在５3２nm处有最大光吸收。植物组织中可溶性糖与TＢA得显色反应产物在4５0nm与532ｎm处也有吸收。测定时要排除可溶性糖得干扰,因此分别测定5３2nm与４５0nm处得吸光值,直接求得植物样品提取液中MＤA得浓度;MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定。

计算公式如下:

C(µｍol.Ｌ-１)=6。４5OD５3２-０、56OD4５0

进一步算出每克样品鲜重中丙二醛得含量(µmｏlg-1ＦＷ)、

试剂:

10%三氯乙酸(TCA) :10ｇ三氯乙酸定容于100ml

0。6％硫代巴比妥酸:０.６g用1０％三氯乙酸TCA定容于100ml

试验步骤:

(1)取植物材料用液氮迅速研磨成粉,取0、2ｇ左右材料,放入５ｍl离心管

内。

(2)加入5ml 10%得三氯乙酸,提取30mｉn后,1000０r／ｍin离心１5min。

(3)取上清液2ml,加入2ml 0、6％TBA,混匀,在100℃水浴中煮15min,

冷却,冷却后再测量。

(4)分别测定532nｍ与450nｍ处得吸光值、以２ml(加TBA,水)水代替

提取液作为对照管。

2蛋白质含量测定---—考马斯亮蓝G-２５0法

实验原理:考马斯亮蓝G-2５0在游离状态下呈红色,当它与蛋白质结合后变为青色,前者最大光吸收在46５nm,后者在5９5nm。在一定蛋白质浓度范围内,蛋白质一色素结合物在59５ｎm波长下得光吸收与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质得定量测定、

仪器与试剂:

牛血清白蛋白500微克/毫升:１0ｍｇ蒸馏水定溶至100mｌ

考马斯亮蓝G-２50:10mｇ溶于５mｌ90％乙醇中,加入１０ml85％得磷酸,用蒸馏水定溶于１００ml

操作步骤:

１.标准曲线得制作:

取4支试管,按下表配制不同浓度得牛血清白蛋白溶液各１毫升,加入5毫升考马斯亮蓝G－2５０试剂,摇匀,放置2分钟后用1０毫米光径得比色杯在５９5ｎm下比色。做出标准曲线。

管号１ 2 3 4

蛋白质含量(微克) ０50 100 １５0

５00微克/毫升牛血０0、１0.2０.３

清白蛋白量(毫升)

蒸馏水量(毫升)1、０0。9 0.8 0、7

考马斯亮蓝－G25０ 5 5 5 5

(毫升)

2。样品中可溶性蛋白质得提取测定:

称取植物叶片０、2克,用5ml蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后,过滤,取滤液ｌ.0ml(视蛋白质含量适当稀释)于试管中,加入5毫升考马斯亮蓝G—2５0试剂,摇匀,放置2分钟后用1０毫米光径得比色杯在595nm下比色,以空白管调零,测定吸光度。根据吸光度查标准曲线,求出样品中得蛋白质含量。

3、结果计算

样品中得蛋白质含量(ｍg/g)=(Ｃ·Vt)/(１0００Vs·ＷF)

式中:Ｃ--查标准曲线值(ug)

Ｖt一提取液总体积(ml)

WＦ一样品鲜重(g):

Vs一测定时加样量(mｌ)。

3脯氨酸(Ｐrｏ)含量得测定

药品:３%得磺基水杨酸:3ｇ磺基水杨酸溶在１0０ｍl水中。

２.5%酸性茚三酮显色液:冰乙酸与６mol／l磷酸以3:２混合,作为溶剂进行配制:即2.5ｇ茚三酮溶解在 60mｌ冰乙酸与40ml磷酸中,磷酸就是16.4ml与2３.6ml水中。

脯氨酸标准溶液:称取25mg脯氨酸,用蒸馏水定溶至250ｍl。

1。标准曲线制作

(1)取4支具塞刻度试管按下表加入各试剂。

试管号0 2 4 6

脯氨酸标准溶液(ml) 0０.2 0.6 1.0

水(ml) 1.0 0、8 0、4０

冰乙酸(mｌ) １ 1 １ 1

茚三酮显色液(ml) １、5 1.５1、51。5

脯氨酸含量(µg) 0 2 ６１0

混匀后在沸水中加热20miｎ。

(2)取出冷却后向各管加入５ｍl甲苯充分振荡,以萃取红色物质、静置待分

层后吸取甲苯层以０号管为对照在５20nm波长下比色。

(3)以消光值为纵坐标,脯氨酸含量为横坐标,绘制标准曲线,求线性回归方程。

２.样品提取测定(l)提取:剪碎叶片0.2g,置于大试管中,加入５ｍ1 3％磺基水杨酸溶液,管口加盖保鲜膜,于沸水浴中浸提l０min。

(２)取出试管,待冷却至室温后,吸取上清液２ｍｌ,加2m1冰乙酸、２m1水与４ml显色液,于沸水浴中加热４0min,下步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取与比色。以甲苯为对照

从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度,按下式计算样品中脯氨酸含量

脯氨酸含量(µg•g-1)(鲜重)＝(Ｃ·V)·(a·W)—1

式中:C一提取液中脯氨酸含量,由标准曲线求得;

V一提取液总体积(mｌ);

a一测定时所吸取得体积(ｍｌ):

W一样品重(g)

4相对电导率得测定

1、取已处理得叶片,用打孔器取小圆叶片２0片(或称取0．５克) ,放入小烧杯中, 每个处理三次重复。

2。向烧杯中各加入25ml蒸馏水浸半小时、

3、用电导仪测各个处理松针外渗液得电导率与蒸馏水电导率。

４。各烧杯用保鲜膜盖上,于水浴锅中沸水浴半小时,冷却补充蒸馏水25ml,测

定煮沸电导率。令测蒸馏水电导率

叶绿素含量得测定:丙酮乙醇混合法

1 将丙酮、无水乙醇按照１:１=5ｍl:5ml比例配成混合浸提液。2。称取0．2克叶片,剪成细丝于盛有混合液得试管中,加保鲜膜盖于暗处,浸提,隔一定时间观察浸提情况,以材料完全变白为准,用混合液作空白调零,测定663nm、645nm处光密度,一般隔夜测定。

1取叶片剪碎0.2克,用少量80%得丙酮研磨至匀浆,过滤,用80%丙酮定溶至 25MＬ,测测定663nｍ、645nm处光密度、每次测量做3次重复。