基因克隆与表达

2）. DNA的甲基化程度
dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。
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3
3）. 温度
不同的限制性内切酶的最适反应温度不 同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。
4）. 缓冲液(Buffer)
是影响限制酶活性的重要因素。 商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。
浓度 分辨范围(bp)
3.5 1000-2000
5
90-500
8.0 60-400
12
40-200
15
25-160
20
6-100
凝胶浓度的选择：取决于待. 检测的DNA的大小
原来如 此！
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电泳缓冲液
pH值：偏碱性，带负电荷 离子浓度：离子浓度高 电流大
发热快胶溶解
种类：
TAE （Tris+EDTA+醋酸）:电流大，易产生离子富集
2）开环质粒DNA：如果质粒DNA两条链中 有一条链发生一处或多处断裂，分子就能 旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状 分子，称开环DNA。
3）线状质粒DNA：如果质粒DNA的两条链在 同一处断裂，则形成线状DNA。
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15
抽提出的质粒三种构型 电泳结果：
1）开 环 2）线 状 3）超螺旋
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-
向电 泳 方
• 多种酶进行酶切时，先低盐后高盐缓冲 液；
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5
1、连接
连接、转化与重组子鉴定
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6
（2）. 连接条件
（1）必须是两条双链DNA。
（2）DNA 3’ 端有游离的-OH， 5’端有一个磷酸基团（P）。
（3）需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+
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7
2）连接温度：
连接效果最好在37 ℃，但形成的互补 不稳定; 最佳连接温度：12-16 ℃，较好的连 接效果，互补又较稳定;
插入片段的大小：插入片段越大，转化 效率越低； 受体细胞的类型及预处理；
转化方法：电击法高于化学法。
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11
3、转化子的筛选和鉴定
限制性酶切图谱法
Pvu I Pst I
EcoR I
Cla I
Pst I
Hind III
BamH I
Apr
Tcr
pBR322
Sal I
4363 bp
ROI
ori
ROP
13
ⅰ质粒DNA提取方法： 碱裂解法、煮沸法、 SDS法等
ⅱ 碱裂解法原理：
在碱性条件下，双连DNA氢键断裂， 结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分 变性。在中性条件下变性质粒恢复原来 构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈 不溶物而经离心除去。
.
14
ⅲ 抽提出质粒的构型：
1）超螺旋质粒DNA:在提取质粒过程中，超 螺旋DNA占大部分。
增加插入片段与载体的接触机会，减少 载体自我连接的现象。
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9
2、转化
化学法（CaCl2法)： 转化原理：是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下 形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作 用，使细胞膜出现空隙，质粒或DNA重组分 子便可进入细胞内（感受态细胞）。
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10
影响转化率的主要影响因素:
载体本身的性质及其空间构象：超螺 旋构象转化率最高；
蛋白原核表达
卫文强
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2015.112
目的基因-T
表达载体
酶切， 胶回收，连接
转化到克隆用细胞（Top10)
提质粒，酶切验证
转化到表达用细胞（BL21（DE3)）
百度文库
诱导表达
SDS-PAGE .
2
影响限制性内切酶活性的因素
1）. DNA的纯度
DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、 SDS、EDTA等都会影响酶的活性。
3）反应液中的成分：
ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解度 不高，连接缓冲液宜分装； 单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果； PEG：5%以下可以提高连接效率
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8
4）插入片段与载体的浓度比例
载体DNA与外源DNA的分子摩尔比通
常为1﹕3左右，甚至1﹕10 或更高。
目的或作用：
MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度；
Tris-HCl：
维持pH；
二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；
牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；
β－巯基乙醇：保持酶的稳. 定性，防止酶失活。
4
使用时注意事项：
• 用时在冰上操作；
关心小 贴士告
诉你
• 取酶用干燥、灭菌、新的枪头
• 酶用量不能超过酶切总体积的10%；
TBE （Tris+ EDTA+硼酸）:缓冲能力最强
TPE （Tris+ EDTA+磷酸）:缓冲能力低
TNE （Tris+ EDTA+醋酸钠）
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19
pET表达载体
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20
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21
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22
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• pET表达载体的启动子是T7噬菌体基因10启动子（T7启动 子），需要T7RNA聚合酶才能转录。
• T7RNA聚合酶转录机制十分有效并具有选择性：充分诱导 时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；在非诱导 条件下，几乎可以使目的基因完全处于沉默而不转录。
• T7RNA聚合酶基因插入由大肠杆菌lacUV5启动子控制、 λDE3溶原状态下的大肠杆菌染色体上。
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T7 表达系统
转录调控的机理 化学诱导型 噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生
株，一段含有 lacI、lacUV5 启
动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中
Bal I
Hind II
.
12
质粒DNA的提取
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传 因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环 的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细 胞中。
质粒具有自主复制
和转录能力，能在子
代细胞中保持恒定的
拷贝数，并表达所携 带的遗传信息。
基因组DNA
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质粒DNA
用噬菌体 DE3 的溶源菌作为表 达载体的宿主菌，调控方式为 化学诱导型，类似于 Lac 表达 系统。
E.Coli （DE3）
T7 启动子
目的基因
IPTG 诱导
T7 RNA 聚合酶
lac 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
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菌株种类
BL21 :lon, ompT BL21(DE3) : T7 polymerase Rosetta: optimal codons Origami : thioredoxin reductase (trxB) , glutathione
+
16
凝胶电泳技术
电泳目的：对核酸分子进行分离和检测
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凝胶浓度:
浓度大，筛孔小，适合小分子电泳；
浓度小，筛孔大，适合大分子电泳
♦ 凝胶分辨DNA的能力：
琼脂糖
浓度 分辨范围(kb)
0.3%
5-60
0.6%
1-20
0.7%
0.8-10
0.9%
0.5-7
1.2%
0.4-6
1.5%
0.2-3
聚丙烯酰胺凝胶