细胞毒理学实验六细胞微核的检测
实验三、微核试验
3．固定：
将推好晾干的骨髓片放进染色缸中，甲醇固定15分钟， 取出晾干。
4．染色(建成试剂盒Giemsa染液)
用染液一3滴，染色8min，再加染液二6滴，洗耳球混 匀5min。细流水冲掉玻片染色液，晾干。
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5．观察计数
先用低倍镜观察，选择分布均匀的区域，再在油镜下观察 计数。 PCE细胞呈灰蓝色，正染红细胞（NCE）桔黄色。 细胞中的微核大半呈圆形，边缘光滑，嗜色性与核质一致， 一个细胞内可以出现一个或多个微核。
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注意事项：
1. 注意不要把股骨剪断 2. 挤出骨髓处的肌肉要剔除干净 3. 滴到玻片上的生理盐水不要太多，涂时要涂匀，
以便推片 4. 染色前可以先看一下整体涂片情况，细胞分散度
是否良好 5. 关键步骤是制作良好的骨髓涂片以及优良的染色
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MN（微核） NCE
正染红细胞 ( 成熟红细胞 ）
显微镜下微核观察 13
微核试验是观察受试物能否产生微核的试验。主要可检出
DNA断裂剂和非整倍体诱变剂(染色体损伤)。 传统的微核试验是体内试验, 常用细胞小鼠骨髓多染红细胞(PCE)
3
微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常 核的分叶及核突出物相区别。由于红细胞在成熟之前最后一 次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中，
计数1000个PCE中含微核的PCE数，并计算200个细胞中 PCE/NCE的比值。
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6. 结果分析与评价
• 本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示。 • PCE／NCE为评价细胞毒性的指标。 • 正常的PCE/NCE比值为1（0.6-1.2），
如果＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制； 如果＜0.05，则表示受试物剂量过大，结果不可靠。
骨髓细胞微核实验
•实验原理
机理： 1 有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点的染色体 环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞质中 2 断片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向移动， 从而遗留在细胞质中 结论：
微核试验能检测化学或其他物质因素诱导产生的染色 体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点
•有核细胞中
•微核难与正常核分叶
•及核突出物区别
•微
•核
•实
•无核细胞
•验
•红细胞
红细胞的分化成熟过程
小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成
环磷酰胺（CTX）
❖ 最常用的烷化剂类抗肿瘤药。
❖ 在体外无抗肿瘤活性，进入体内经转化、分解，生成酰 胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用。
❖ 副作用明显，有恶心、食欲减退、脱发、白细胞减少、 中毒性膀胱炎、肝功能损伤等。
❖ 具有显著的遗传、生殖毒性：停经或精子缺乏，妊娠初 期时给予可致畸胎。
❖ 用药后24-30小时，骨髓中微核形成达峰。
•8
结果
•示小鼠骨髓正常 嗜多染红细胞
•示小鼠骨髓嗜多染 红细胞中一个微核
•9
•示小鼠骨髓嗜多染红细胞中两个微核
•10
•示小鼠骨髓嗜多染红细胞中多个微核
•11
Giemsa染色
染 毒
•推片：30度角；
后
操
•晾干：一定要干；
作
步
•固定：甲醇固定10min,
骤
需要晾干； •染色：Gimesa染液染
色（10~15min） •冲洗：蒸馏水冲洗，晾
干•阅片: 观察微核。
推片方法
实验方法和步骤
观察与计数：低倍镜下选择分布均匀，染 色较好的区域
油镜下观察计数
骨髓细胞微核实验报告
骨髓细胞微核实验报告1. 背景骨髓细胞微核实验是一种常用的细胞遗传毒性检测方法，用于评估物质对人体细胞的影响。
该实验可以通过观察细胞核中的微核数量来判断物质是否具有诱发染色体损伤的能力。
在临床研究和毒理学评价中，骨髓细胞微核实验被广泛应用于药物筛选、环境污染物评估和职业危害监测等领域。
2. 实验目的本次实验旨在通过骨髓细胞微核实验，对不同浓度的化学物质进行评估，分析其对人体细胞的遗传毒性作用，并提出相应的建议。
3. 实验方法3.1 实验材料和设备•骨髓细胞培养基•不同浓度的化学物质溶液•细胞培养器•显微镜•细胞计数板•玻璃干片3.2 实验步骤1.采集实验对象的骨髓细胞，并将其接种在含有培养基的细胞培养器中，保持适宜的温度和湿度。
2.将不同浓度的化学物质溶液分别加入不同培养器中，同时设置对照组。
3.在一定时间后，将细胞样本离心并进行固定处理。
4.制备玻璃干片，并使用吉姆萨染色法染色。
5.在显微镜下观察细胞核中的微核数量，并记录下来。
4. 数据分析根据实验结果，我们可以得出以下结论：1.不同浓度的化学物质对骨髓细胞核中微核数量产生了影响。
随着化学物质浓度的增加，微核数量呈现出明显的上升趋势。
2.与对照组相比较，实验组细胞核中微核数量明显增加，表明该化学物质具有一定的遗传毒性作用。
5. 结果讨论本次实验结果表明该化学物质具有一定的遗传毒性作用。
微核是染色体损伤的指示器之一，其数量的增加可能意味着染色体断裂、染色体片段丢失或整个染色体的缺失。
这些染色体损伤与遗传突变和癌症等疾病的发生相关。
基于实验结果，我们建议：1.避免长时间接触该化学物质，特别是高浓度的暴露。
2.在工作场所进行必要的防护措施，如佩戴防护口罩、手套和工作服等。
3.进一步深入研究该化学物质的毒性机制和致突变潜能，以便更好地评估其对人体健康的风险。
6. 结论通过骨髓细胞微核实验，我们评估了一种化学物质对人体细胞的遗传毒性作用，并得出结论该化学物质具有一定的遗传毒性。
微核实验PPT
五：实验步骤
1、浸种催芽：选饱满蚕豆种 子，放于蒸馏水中浸泡24小 时，此间换水两次。待种子 吸胀后，转入铺有脱脂棉的 培养皿中培养，每天换水一
次培养三天，初生根长1~2
厘米待用。
2、处理根尖：取1.25克香烟
丝于烧杯中加入250毫升 蒸馏水加热热煮沸
6、染色：截下1-2mm长的根尖，滴加石炭酸品红染液， 染色10min，加盖玻片，压片，镜检观察。
★注意事项： ★培养蚕豆时需勤换水 ★处理蚕豆时要将根部浸没于处理 液中 ★固定液要现配现用
六，实验成果
对照组
实验组
有丝分裂前期
有丝分裂中期
有丝分裂后期
有丝分裂末期
分裂后的细胞
七，结论分析
MCN‰=18‰左右，浓度太大，导致根尖不生长，在此忽略此结果
微核出现与烟汁浓度变化图
120 100
MCN‰
80 60 40 20 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
1表示对照组蒸馏水 2表示烟汁：蒸馏水=1：5 3表示烟汁：蒸馏水=1：1
经实验观察： ☆对照组未出现微核。 MCN‰=7‰左右
☆烟水：蒸馏水=1：5出现的微核较少。MCN‰=60‰左右，污染指标
（PI）=8.57 ☆烟水：蒸馏水=1：1的处理液微核出现的最明显。MCN‰=100‰左右， 污染指标（PI）=14.29 ☆未稀释的烟水和烟水：蒸馏水：茶水=1：1：1的根尖长势不好。
冷却后过滤待用
• 取6只培养皿，铺上 脱脂棉，将检测液分 别加入培养皿中，并 且编号，另取一组加 蒸馏水的培养皿做对 照组，分别选取4枚 蚕豆放于脱脂棉上， 培养24小时
培养皿编号：
1：未稀释的烟汁
2：烟汁：蒸馏水=1：1 3：烟汁：蒸馏水=1：3 4：烟汁：蒸馏水=1：5 5: 烟汁：茶水：蒸馏水 =1：1：1 6：蒸馏水
毒理学 实验三、微核试验
两次染毒：第一次染毒后24小时进行第二次染毒， 6小时后取样；
多次染毒：每天染毒1次，连续染毒5天， 末次染毒后24小时取样。
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2．骨髓液的制备和涂片
处死：颈椎脱臼法 处理： 取股骨，去掉血污和肌肉，用弯止血钳将骨髓
挤于预先滴有生理盐水的清洁载玻片上，混合均匀后推片
微核试验是观察受试倍体诱变剂(染色体损伤)。 传统的微核试验是体内试验, 常用细胞小鼠骨髓多染红细胞(PCE)
3
微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常 核的分叶及核突出物相区别。由于红细胞在成熟之前最后一 次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中，
实验三、小鼠骨髓细胞微核试验
1
微核(Micronucleus)的概念
微核的产生与染色体损伤有关，是染色体或染色单 体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色 体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单 独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质 内，因比主核小，故称微核。
2
微核试验(Micronucleus test，MNT)的概念
计数1000个PCE中含微核的PCE数，并计算200个细胞中 PCE/NCE的比值。
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6. 结果分析与评价
• 本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示。 • PCE／NCE为评价细胞毒性的指标。 • 正常的PCE/NCE比值为1（0.6-1.2），
如果＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制； 如果＜0.05，则表示受试物剂量过大，结果不可靠。
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3．固定：
将推好晾干的骨髓片放进染色缸中，甲醇固定15分钟， 取出晾干。
4．染色(建成试剂盒Giemsa染液)
微核的检测
注意事项
• 正确掌握微核的形态特征，避免假阳性。 • 以有核细胞形态是否完好作为判断制片优劣的标
准
实验（四）
细胞内微核的检测
原理
环境中有害物质可导致细胞中染色体或纺 锤体的损伤，产生的染色单体或无着丝粒片断 染色体在细胞分裂末期滞留于子细胞胞质中， 形成微核。
原理
本实验选用培养细胞，用顺铂作诱导剂 （或射线、环磷酰胺等） ，促使细胞中染色体 断裂，产生微核。
微核经Giemsa染色后呈紫红色，胞质被染 成淡灰蓝色。
微核的计算
先用低倍镜粗检，后用高倍镜，选细胞 分布均匀，细胞无损，着色适当的区域，计数。
每张玻片计数100-200个细胞，按“1‰”计 算微核的出现率，微核计数以“细胞”为单位， 即一个细胞中出现2个或2个以上微核时，也只 按“1”计算。
结果
微核大多数呈单个圆形，边缘光滑整齐，嗜色 性与核质相一致，呈紫红色或蓝紫色。
器材与试剂
• 显微镜、载玻片、染色缸、滴管等 • 培养细胞（PC12，小盖片） • 顺铂(终浓度20umol/l、40umol/l、60umol/l） • 甲醇固定液 • PBS（pH7.4） • Giemsa应用液（临用现配）
Giemsa原液：PBS＝1：9混合而成。
操作
培养细胞（小盖片）——加顺 铂—24—h PBS洗涤3次——甲醇固定 5min—— Giemsa染色5min——自 来水冲洗——显微镜下观察——计 数
细胞生物实验：微核实验
实验器材
离心机，显微镜，擦镜纸，二甲 苯，香柏油，手术剪，手术镊子， 刻度离心管，1ml注射器，Giemsa 染色液，75%酒精纱布块，甲醇， 生理盐水。
实验内容和方法
1.骨髓细胞液制备：取小鼠股骨，剔
Hale Waihona Puke 净肌肉制备骨髓细胞悬液。 2.离心：1000r/min离心5分钟。 3.涂片 4.甲醇固定5分钟 5.染色：Giemsa染液中染色10分钟。 6.显微镜观察
作业与思考
1.画一个具有微核的嗜多染红细胞。 2.计算出平均微核率，并与自发微核
率（1~3‰）比较，说明微核增加的 原因。
小鼠骨髓嗜多染红细胞 微核试验
实验目的
通过对用已知诱变剂（环磷酰胺） 处理的小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的 测定，初步掌握微核试验的方法和制片 技术。
实验原理
微核是染色体断裂后由遗留下来 的无着丝粒片断演化而来的次核，其 直径通常为红细胞的1/20~1/5，在骨髓 和外周血液的各类型细胞中均可见到， 但在有核细胞中，微核常难以与核叶 相鉴别，而在嗜多染红细胞中，因主 核已排除，若有微核发生则非常容易 辨认。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核自 发率很低（1~3‰），但在致变剂 的作 用下，微核发生率可明显增高，因而 微核试验是检测致畸因子的有效的手 段。
植物细胞微核检测技术 ppt课件
微核法：直接涂片法、培养法、CB法；
微核仅出现在诱发后经过一次分裂的间期细胞传统微核 法不能分辨未转化、分裂一次和一次以上的淋巴细胞,影 响微核测试的准确性；
CB法计数CB细胞中的微核,可显著提高微核检测的灵敏度 和准确性。
MN
CB法优点：方法简单,分析快速,易于掌握, 有利于自动化分析,尤其在核事故涉及的人 员较多时更显示具优越性。
3、恢复培养：处理后的根尖用自来水浸洗3次，每 次 2-3min，洗净后在水中恢复培养24h。
4、固定：用甲醛：冰醋酸（3：1）固定液固定24h后弃去 固定液，或换入70％酒精中保存。
5、酸解：弃去固定液，用清水漂洗2-3次，吸净水，加入 6M盐酸，于室温解离10min，弃去盐酸，漂洗根尖2-3 次，彻底洗净盐酸。
3、每一处理观察3个根尖，每个根尖计数100个细胞，统计 其中含微核的细胞数，计算平均数，即为该处理的 MCN‰，即微核千分率。
样品实测MCN‰平均值 污染指标（PI）=
对照组（标准水）MCN‰平均值
微核
微核
MN NCE
改良：
CB法微核:
微核（micronuclear）：无着丝粒断片（染色体碎片）或 在分裂后期落后的整条染色体，在分裂末期不能纳入主核， 当进入下一个间期时，它们在细胞质内浓缩成小于主核1/3， 着色与主核相同或略浅的小核。
缺点：不像双着丝粒体对辐射敏感、特异； 自发率高，1％－2％；个体差异大，自发 率与性别无关，与年龄呈正相关，估算剂 量下限的不确定性高；衰减速度比双着丝 粒体快。
进展：
稳定性染色体畸变（易位）分析：荧光原位 杂交(FISH)技术
利用生物素(biotin)标记的已知碱基序列的核酸作为 探针,按照碱基互补的原则,与标本上染色体同源序列 进行特异性结合（原位杂交）,然后用荧光标记的生物 素亲和蛋白 (avidin)和抗亲和蛋白的抗体进行免疫监 测和放大,使探针杂交区发出荧光(显色),形成可监测的 杂交双链核酸,最后在荧光显微镜下检查探针存在与否。 结合了探针的染色体呈现出特定的颜色,未结合探针的 染色体不着色,如着色与未着色的染色体间发生了互换, 这种异常的染色体在荧光显微镜下非常容易鉴别。
毒理学实验技术总结
毒理学实验技术总结毒理学作为一门研究外源性化学物质对生物体产生有害作用的学科，其实验技术的发展对于评估化学物质的安全性和风险至关重要。
以下是对常见毒理学实验技术的总结。
一、急性毒性实验急性毒性实验是评估化学物质在短时间内（通常 24 小时至 2 周）对生物体造成的毒性效应。
实验动物通常选用小鼠或大鼠，通过不同的给药途径（如经口、经皮、吸入等）给予一定剂量的受试物。
观察指标包括动物的死亡情况、临床症状（如行为异常、呼吸困难等）、体重变化等。
根据实验结果，可以计算出半数致死剂量（LD50）或半数致死浓度（LC50），这是衡量化学物质急性毒性的重要指标。
二、亚急性和亚慢性毒性实验亚急性毒性实验的时间通常为 28 天至 90 天，亚慢性毒性实验则为90 天至 180 天。
这些实验旨在观察化学物质在较长时间内低剂量暴露下对生物体的潜在毒性。
除了观察一般症状和体重变化外，还会检测血液生化指标（如肝功能、肾功能指标）、组织病理学变化（如肝脏、肾脏、心脏等器官的组织形态改变）等。
三、慢性毒性实验慢性毒性实验的周期较长，一般为 1 年以上，甚至可能持续动物的整个生命周期。
这种实验更能反映化学物质长期暴露对生物体的影响，包括致癌性、致畸性、致突变性等。
检测指标与亚急性和亚慢性毒性实验类似，但更加注重对肿瘤发生、生殖系统影响以及遗传物质损伤的评估。
四、遗传毒性实验遗传毒性实验用于检测化学物质对生物体遗传物质（DNA）的损伤作用。
常见的方法包括：1、细菌回复突变试验（Ames 试验）：通过观察受试物是否能引起细菌基因突变来评估其遗传毒性。
2、染色体畸变试验：观察细胞染色体结构和数量的变化。
3、微核试验：检测细胞中微核的形成，反映染色体的损伤。
五、生殖毒性实验生殖毒性实验主要研究化学物质对生殖系统的影响，包括对生殖器官、生殖细胞、胚胎发育等方面的作用。
实验分为三段：1、Ⅰ段：生育力与早期胚胎发育毒性实验，评估对雌雄动物生殖能力和早期胚胎发育的影响。
毒理学实验微核试验
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操作步骤
5、观察计数 • 先在低倍镜下进行观察，选择分布均
匀．染色较好的区域，再在油镜下观察计 数，PCE细胞呈灰蓝色，正染红细胞(NCE) 呈橘黄色。细胞中含有的微核多数呈圆形， 边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫 红色或蓝紫色。一个细胞内可出现一个或 多个微核。计数1000个PCE中含微核的PCE 数，并且计数200个细胞中PCE与NCE的比 值。
实验一
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实验目的
1 学习小鼠骨髓微核试验原理 2 掌握微核试验的制片方法 3 学习掌握微核的观察计数 4 掌握微核试验的结果分析评价
2
实验原理
微核(Micronucleus)的产生与染色体损伤有关 微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进 入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染 色单体或染色体的无着丝粒断片或环。它在末期 以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含 在细胞的胞质内而形成，由于比核小得多故称微 核。
3、固定 将推好晾干的骨髓片放入染色缸中、
用甲醇溶液固定15min取出晾干。不能及时 染色的涂片也应固定后保存。
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操作步骤
4、染色 将固定晾干后的涂片、用新鲜配制的
Giemsa应用液(Giemsa储备液1份加PH6.8的 磷酸盐缓冲液9份)染色10~15min，然后冲洗 掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。
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MN NCE
Illustration of a binuclear human lymphocyte containing a micronucleus (arrow). Nuclear material appears in yellow, cytoplasm in red. Acridin-Orange staining, fluorescence microscopy, enlargement 1000 fold
微核检测试验
诱变物质的微核检测摘要微核（micronucleus, 简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。
在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。
一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。
微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的，而且与细胞所受到的不良刺激成正相关，因此可以通过观察植物组织中细胞的微核发生率来确定细胞所受到的污染情况。
1.引言微核（micronucleus, 简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。
微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。
在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。
微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。
一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。
有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。
这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。
当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。
已经证实，微核率的大小是和作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点与染色体畸变的情况一样。
所以许多人认为可用简易的周期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。
含有微核的细胞数占观察细胞总数的比率称为微核细胞率（千分率），简称微核率。
①微核细胞率可以用来反映遗传物质受损伤的程度；②在一定的剂贝范困内，微核率与环坡因子的剂量呈正相关③人们常用微核率来反映环境有害毒物的污染程度：一般认为，微核率在10‰以下时无污染；10-18‰时，有轻度污染；18-30‰时，有中度污染；>30‰，有中度污染。
微核检测技术灵敏度高，技术简单，在辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面都有所应用。
微核测定实验报告
1. 掌握微核检测的基本原理和方法。
2. 了解微核形成的原因及其与遗传毒性的关系。
3. 通过实验，验证不同处理条件下细胞微核率的差异。
二、实验原理微核检测是一种快速、简便的遗传毒性检测方法，主要用于评估化学物质、物理因素等对生物体遗传物质的损伤。
实验原理是：在细胞分裂过程中，染色体发生断裂或畸变，导致染色体片段或整个染色体未能正常分配到子细胞中，形成微核。
通过显微镜观察细胞核形态，计数含微核的细胞数量，计算微核率，从而评估遗传毒性。
三、实验材料1. 细胞培养液2. 细胞培养皿3. 不同处理组的试剂（如溶剂、药物等）4. 显微镜5. 计数板6. 染色剂7. 计数器四、实验方法1. 将细胞培养至对数生长期。
2. 将细胞分为不同处理组，分别加入溶剂、药物等试剂，设置对照组。
3. 在不同处理条件下培养细胞24小时。
4. 收集细胞，用染色剂染色，制片。
5. 在显微镜下观察细胞核形态，计数含微核的细胞数量。
6. 计算微核率，并统计分析各组数据。
1. 对照组微核率：5.0% ± 0.5%2. 溶剂处理组微核率：4.5% ± 0.3%3. 药物处理组微核率：7.5% ± 0.8%六、实验分析1. 对照组微核率较低，说明正常细胞分裂过程中微核形成较少。
2. 溶剂处理组微核率略有下降，可能与溶剂对细胞的轻微损伤有关。
3. 药物处理组微核率明显升高，说明该药物具有一定的遗传毒性。
七、实验结论1. 微核检测是一种快速、简便的遗传毒性检测方法。
2. 本实验结果表明，该药物具有一定的遗传毒性，需要进一步研究其作用机制。
八、实验讨论1. 微核形成的原因可能与染色体断裂、畸变、缺失等因素有关。
2. 微核检测结果受多种因素影响，如实验条件、细胞类型、处理时间等。
3. 在实际应用中，应结合其他遗传毒性检测方法，全面评估物质的遗传毒性。
九、实验改进1. 在实验过程中，可增加实验重复次数，提高实验数据的可靠性。
骨髓细胞微核实验报告
骨髓细胞微核实验报告骨髓细胞微核实验是一项常用的毒理学检测方法，可以有效地评价某种物质对DNA损伤的影响，具有重要的毒性评价价值。
本文将对骨髓细胞微核实验进行详细的介绍和解读，为相关研究人员提供指导。
一、骨髓细胞微核实验原理骨髓细胞微核实验是通过体外培养动物骨髓细胞，观察其亚微米级大小的微核（Micronucleus，MN）形成情况来评价物质对DNA损伤的影响。
在骨髓细胞分裂时，如果染色体发生异常分离或断裂，就会产生一个或多个亚微米级的小核结构，称为微核。
微核中包含未被分离的染色体片段或全染色体，它们将被保留在新细胞核内，从而形成有两个或多个核的细胞。
形成微核的细胞与正常细胞相比，DNA的稳定性已经受到了不同程度的损伤。
因此，骨髓细胞微核实验通过检测细胞中微核的数量和形态，可以初步判断某种物质对DNA的损伤程度，进而评价其毒性。
二、骨髓细胞微核实验步骤1. 骨髓细胞培养：将动物骨髓细胞取出，利用适当的培养基进行体外培养。
通常可以采用罗氏61#或麦戈文液等培养基，具体选择应根据实验需要确定。
2. 处理检测物质：将待检测物质加入到骨髓细胞培养基中，通常需要设立不同的浓度梯度，以便观察物质对骨髓细胞DNA损伤的剂量效应。
3. 细胞收集：培养一定时间后，用适当的方法收集细胞，可选择离心法或离心浓缩法等，通常可在离心时加入适当的溶解剂溶解红细胞。
4. 细胞扩增：将收集到的细胞加入到分装好的培养皿中，加入细胞生长因子，推动细胞继续增殖。
5. 制片染色：取适当量的细胞悬液，制作染色片并染色。
一般情况下，常用的染色方法包括单盐酸染色、儿茶酚蓝染色和吉姆萨染色等。
6. 观察分析：观察所制的染色片，采用恒定镜观察和计数，并对微核数量和形态进行统计分析。
为了获得稳定可靠的数据，一个实验通常需要做多组重复测定。
三、常见问题解答1. 什么因素会影响骨髓细胞微核实验的结果？骨髓细胞微核实验受多种因素影响，如细胞染色质特征、培养时间和环境温度等，需要掌握合适的技术方法和实验环境。
微核试验
五、结果与分析 1.柔顺剂对蚕豆初生根的影响 2.柔顺剂浓度对蚕豆根尖细胞染色体畸变率 （CAF%）影响 3 .柔顺剂浓度对蚕豆根尖细胞微核率 （MCN‰）的影响
5.解离 用蒸馏水浸洗固定好的材料，吸干， 1mol/L的HCl溶液酸解10～15min。 6.染色 用蒸馏水浸洗幼根，切取0.5cm的根尖， 用改良的石炭酸品红溶液染色5-10min。 7.压片与镜检 常规压片法制作临时装片，观察统计 细胞的染色体畸变百分率，微核千分率并 用NikonYS100显微镜和Nikon 数码相机进 行显微摄影。
三、仪器、试剂和材料 1.仪器：烧杯、培养皿、纱布、显微摄影系 统 2.试剂：各种被测试剂 3.材料：蚕豆
四、实验步骤 1.浸种催芽 将蚕豆用蒸馏水浸泡24h，使其充分吸 胀，在此期间换水一次，然后将它们用干净 的湿纱布松散包裹置于瓷盘中，25±1℃恒 温培养，每隔12h换水一次。 2.处理 选取根尖长度为1~2cm的蚕豆，随机分 组，分别在浓度为0.05%、0.10%、0.25%、 0.50%、1.00%（V/V）的浓度中处理6h， 以蒸馏水作对照处理。
一、实验目的
二、实验原理
微核试验是以动植物为材料利用细胞生物学 方法观察材料出现的微核率（micronucleus frequency,MNF）来表示材料受遗传损伤程度的一 种检测遗传毒物的方法，是遗传毒理学常用的方法 之一。微核试验已发展为多种试验种类，植物微核 检测技术是国际上常用的环境化学物质毒性检测剂， 具有灵敏、简便、快速的特点。蚕豆是经典的遗传 学研究材料，蚕豆根尖细胞微核试验作为一种环境 致突变物的有效检测手段，得到了广泛的应用。
• 蚕豆根尖细胞微核技术是一种以染色体损 伤及纺锤丝毒性为测试终点的植物体细胞 检测方法。它作为染色体诱变剂和环境致 癌污染物的检测方法已得到广泛应用。
微核试验
一、意义和目的•学习小鼠骨髓多染红细胞（PCE）微核测定方法，了解环磷酰胺对骨髓细胞染色体的损伤作用。
二、原理•基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学毒物的致突变性,是评价化学毒物致突变性唯一可靠的方法。
还有许多试验所观察到的现象并不反映基因突变,染色体畸变和染色体分离异常，而仅反映致突变过程中发生的其他事件。
因此，将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点(genetic endpoint )。
• 国际环境致突变物致癌物防护委员会(ICPEMC)于1983年提出致突变试验的遗传学终点分为5类:①DNA完整性的改变(形成加合物、断裂、交联)；②DNA重排或交换；③DNA碱基序列改变；④染色体完整性改变；⑤染色体分离改变。
其中③实际上指基因突变；④指染色体畸变。
•微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。
微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，其染色与细胞核一致，大小相当于细胞直径的l／20～l ／5，呈圆形或杏仁状，在间期细胞中可以出现一个或多个。
• 一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质(染色体断片或迟滞的染色体)。
所以，微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点，用于检测断裂剂及非整倍体诱发剂。
微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别，故常计数PCE细胞中的微核，因为当成红细胞发展为红细胞时，主核排出，成为PCE，这些细胞保持其嗜碱性约24小时，然后成为正染红细胞（NCE），并进入外周血。
在主核排出时，但微核仍保留于PCE细胞中。
操作步骤• 动物选择首选物种是小鼠和大鼠。
以小鼠使用最为广泛，要求体重18～20g，7～12周龄。
每组小鼠数量10只，雌雄各半。
无首选品系，通常用实验室品系。
• 染毒途径根据研究目的或受试化学毒物性质的不同，可分别选用经口、经皮、经呼吸道及注射等染毒途径。
微核试验法
微核试验法－检测环境污染微核(micronuclei)简称(MCN)是真核类生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。
微核是在间期细胞时能观察到的染色体畸变后遗留产物。
微核试验(Micronuclei Test) 是一种快速、简便检测环境诱变物的方法。
可用来检测水体环境诱变物，为环境监测提供细胞学方面的依据。
在细胞间期可见微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。
微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。
一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片产生的。
实验证实，整条的染色体也能形成微核。
这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所排斥便形成了第三个核块。
已经证实，在一定范围内，微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点和染色体畸变的情况一样。
现有的微核测试系统多数是用哺乳动物的骨髓细胞或外周血细胞。
缺点是需要一定培养条件与时间、细胞同步化困难、微核率低，一般只在0.2％左右。
[实验方法及步骤]重金属镉离子(cd2+)诱导黄鳝外周血细胞微核实验方法。
1．实验用水准备实验用水，可用曝气数天的自来水。
2．实验用容器可用实验室内的水槽，清洗后，加入定量曝气的自来水。
3．试剂诱导配实验用试剂CdCl2·2.5H2O，设20mg/L、2mg/L、0.2mg/L、0.02mg/L四个培养终浓度梯度。
把规格一致的黄鳝放入含试剂的溶液中七天，期间可换水重新补充试剂。
另设同样条件的空白对照，可用曝气的自来水作为对照饲养。
4．断尾取血，做血涂片取黄鳝，断尾后，取出外周血，滴于载玻片上，做均匀涂片。
注意掌握动作要领，涂片均匀。
涂片空气干燥。
5．外周血涂片固定把干燥后的涂片，插入染色缸的插槽中固定10分钟后取出，气干。
6．Giemsa染色固定后的涂片，采用骨髓染色体制备的染色体扣染法，染色15分钟后，取出载片。
在小水流下冲片，小心擦干玻片，注意不要碰到细胞面。
微核试验实验报告
一、实验背景微核试验是一种常用的遗传毒理学检测方法，用于评估化学物质、药物或其他环境因素对生物体的遗传毒性。
本实验采用小鼠骨髓细胞微核试验，旨在检测某化学物质对小鼠骨髓细胞的遗传毒性。
二、实验目的1. 观察某化学物质对小鼠骨髓细胞微核形成的影响。
2. 评估该化学物质的遗传毒性。
3. 探讨该化学物质对小鼠骨髓细胞DNA损伤的机制。
三、实验材料与仪器1. 实验动物：清洁级雄性昆明小鼠，体重18-22g。
2. 实验试剂：某化学物质、生理盐水、小牛血清、RPMI-1640培养基、吖啶橙染液等。
3. 实验仪器：显微镜、细胞培养箱、细胞培养板、电子天平等。
四、实验方法1. 实验分组：将小鼠随机分为对照组和实验组，每组10只。
2. 给药：实验组小鼠按0.5ml/只的剂量给予某化学物质，对照组小鼠给予等体积的生理盐水。
3. 采样：给药后24小时，处死小鼠，取骨髓细胞。
4. 细胞培养：将骨髓细胞接种于细胞培养板，置于细胞培养箱中培养。
5. 染色：细胞培养至适宜时期，用吖啶橙染液染色。
6. 观察与计数：显微镜下观察骨髓细胞，记录微核细胞数。
7. 数据处理：采用SPSS软件进行统计学分析，比较各组间微核率差异。
五、实验结果1. 对照组小鼠骨髓细胞微核率为（5.6±1.2）%，实验组小鼠骨髓细胞微核率为（10.8±2.5）%。
2. 实验组小鼠骨髓细胞微核率显著高于对照组（P<0.05）。
六、实验结论1. 某化学物质对小鼠骨髓细胞具有遗传毒性。
2. 该化学物质可能导致小鼠骨髓细胞DNA损伤，进而引发微核形成。
七、实验讨论1. 微核试验是一种简单、快速、灵敏的遗传毒理学检测方法，可用于评估化学物质、药物等对生物体的遗传毒性。
2. 本实验结果表明，某化学物质对小鼠骨髓细胞具有遗传毒性，可能与DNA损伤有关。
3. 进一步研究应探讨该化学物质对小鼠骨髓细胞DNA损伤的机制，为该化学物质的安全性评价提供依据。
微核的检测
微核的计算
先用低倍镜粗检，后用高倍镜，选择 细胞分布均匀，细胞无损，着色适当的区 域，计数。 每张玻片计数100-200个细胞，按 “1‰”计算微核的出现率，微核计数以 “细胞”为单位，即一个细胞中出现2个 或2个以上微核时，只按“1”计算。
结果
微核大多数呈单个圆形，边缘光滑整齐， 嗜色性与核质相一致，呈紫红色或蓝紫色。
注意事项
正确掌握微核的形态特征，避免假阳性。 以有核细胞形态是否完好作为判断制片优劣 的标准
器材与培养细胞（PC12，小盖片） 顺铂(40umol/l ) 甲醇固定液 PBS（pH7.4） Giemsa应用液（临用现配） Giemsa原液：PBS＝1：9混合而成。
操作
培养细胞（小盖片）——加顺 24h 铂(40umol/l )——PBS洗涤3次— —甲醇固定5min—— Giemsa染色 5min——自来水冲洗——显微镜 下观察——计数
实验（ 实验（四）
细胞内微核的检测
原理
环境中有害物质可导致细胞中染色体 或纺锤体的损伤，产生的染色单体或无着 丝粒片断染色体在细胞分裂末期滞留于子 细胞胞质中，形成微核。
原理
本实验选用培养细胞，用顺铂作诱导 剂（射线、环磷酰胺等） ，促使细胞中染 色体断裂，产生微核。 微核经Giemsa染色后呈紫红色，胞质被 染成淡灰蓝色。
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预冷的玻片
有丝分裂指数（mitoticindex）：某一 分裂组织或细胞群中，处于有丝分裂M 期的细胞数占其总细胞数的百分数。
分裂相细胞数 有丝分裂指数 = ————————
细胞总数
有丝分裂指数
实验组（环磷酰胺）
对照组
平均值
取秋水仙素不同剂量组染色体制片，各随机选取3-5个视 野，统计各视野内的有丝分裂指数，并可对结果进行统计 学分析（独立样本T检验），比较两组数据有无显著性差 异。
镜检时，你能在视野中看到几种类型的细胞？ 计算吞噬细胞的吞噬指数和吞噬百分数。
吞噬百分数=
活化的吞噬细胞的数量 100个吞噬细胞
活化的吞噬细胞中吞噬的鸡红细胞的总量
吞噬指数=
100个活化的吞噬细胞
吞噬百分数
实验组
对照组
吞噬百分数平均 值
吞噬指数
吞噬指数平均值
在实验组和对照组小鼠腹腔液涂片上各随机选取多个视 野，统计各视野内的吞噬百分数和吞噬指数，并对结果 进行统计学分析（独立样本T检验），比较两组数据有无 显著性差异。
纺锤体毒物作用也可以产生微核，主核未能形成而 形成了一组小核。该微核往往比一般典型的微核稍 大。
骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微核容易辨认，而 且微核自发率低，是微核试验常用的细胞样本。
1．器材：解剖器具、注射器、离心机、离心管、恒 温水浴箱、载玻片、酒精灯等.
2．试剂 0.1%秋水仙素溶液、Carnoy固定液（甲醇： 冰醋酸＝3：1;甲醇：冰醋酸＝1：1 ）、0.075 mol / L KCI溶液、Giemsa染液、小牛血清等。
小鼠解剖残渣不要放入下水道。
实验结束后，请将实验用小鼠及垃圾放入垃圾袋， 值日生务必带走。
实验中使用的过滤细胞的尼龙滤网请勿丢弃，实验 完毕后放入白瓷盘并用玻璃漏斗或试剂瓶压住。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
将小鼠分成实验组和对照组，实验组小鼠大剂量注射环磷酰胺溶 液一次。实验前三天，每天向小鼠（实验组和对照组）腹腔注射 2%的蛋白胨溶液1ml，实验前30min，向腹腔内注射1%鸡红细胞 1ml。
1. 染色体畸变的类型有哪些？ 2. 秋水仙素诱导小鼠产生染色体畸变的主要机制？
3．材料：小鼠（7-12周龄，25-30克，两种性别小鼠 各5只。）
将小鼠随机 分成两组
实验组 对照组
实验前24小时200mg/kg 环磷酰胺
实验前1-2小时 0.5%秋水仙素
0.1ml/只
实验前1-2小时 0.5%秋水仙素
0.1ml/只
实验步骤
❖注射量随动物种类 不同而异。秋水仙 素的主要作用是使 分裂细胞阻断在有 丝分裂中期，增加 中期分裂相的比例。
引颈处死
吸取腹腔液
分别取实验组和对照组小鼠各1只，同时准备好玻片，做 好标记，分别取材，制备腹腔液涂片。
在干净的载玻片上滴加一滴生理盐水，向其中滴加一滴 腹腔液，静置10分钟，使腹水细胞贴壁，弃去生理盐水， 待其稍干后，进行瑞氏染色(浓染1-2min，淡染3-5min)。
未被吞噬的鸡红细胞
吞噬了鸡红细胞 的吞噬细胞
1. 了解微核试验在毒理学评价中的作用。 2. 了解微核试验的染色方法。 3. 基本掌握小鼠骨髓多染性红细胞微核试验的实验
设计、操作步骤及结果评价。
微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的外源 化学物的快速检测方法。
微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律的进入子细 胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或者染 色体的无着丝粒断片或环。它在末期以后，单独形成一 个或者几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内而形 成，由于比核小的多而名为微核。微核的出现往往是染 色体断裂剂作用的结果。