细胞毒理学实验一小鼠肝细胞原代培养
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仪器：培养箱（调整至37℃）、培养皿、解剖器 械、倒置相差显微镜。
材料：胎鼠或新生小鼠。 试剂：DMEM培养基（含血清10%）、0.25%胰蛋白
酶、75%消毒酒精。
1. 实验前将无血清培养基和含血清培养基分装并进 行温育（37℃）。
以温度计实际显 示温度为准！
2. 将胎鼠或新生小鼠引颈处死，置于75%消毒酒精浸 泡2~3s，带入超净工作台。
3. 将小鼠腹面朝上，置于灭菌的大培养皿中。
4. 取出灭菌的解剖器械，解剖小鼠，取出肝脏。
5. 将小鼠肝脏置于灭菌的大培养皿皿盖上，剔除脂 肪和结缔组织，并用无血清培养基反复冲洗3次， 每次2-3ml。。
6. 用手术剪将肝脏剪成小块（1mm3）,无血清培养基 冲洗三次。
7. 将组织转移到一次性培养皿中，排列贴附于皿底。 组织块间间隔约0.5-1cm,静置数分钟。
待组织变得疏松，略发白时，加入1ml含血清的DMEM培养 基，终止胰蛋白酶的消化作用。
1000rpm离心10min,加入含血清DMEM培养基3ml，充分吹 打，混匀。
细胞悬液过细胞筛网(100um孔径)到一次性培养皿中(中皿)， 标记并转入二氧化碳培养箱培养，2-3天后镜检观察。
① 实验完毕，将培养基瓶口迅速过酒精灯火焰消毒，拧 紧后，封口膜密封。拿出超净台，放入冰箱。
1. 掌握原代培养的一般方法和步骤以及培养过程中 的无菌操作技术。
2. 熟悉原代培养细胞的观察方法。
直接从生物体内获取组织细胞进行的首次培养称为 原代培养。
原代培养是建立各种细胞系的第一步，是从事培养 工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。
根据培养方法不同原代培养分为组织块培养法和单 层细胞培养法。
8. 待组织粘附后，缓缓加入含血清的培养基，切勿 将组织块冲起，做好标记，转入培养箱培养，镜 检观察。
取出的剩余肝组织充分剪碎后，用剪过的蓝枪头将其转入离心 管，1000rpm离心5min，弃上清，根据组织量的多少加入 0.25%胰蛋白酶1-1.5ml。
37℃水浴消化约10-15min，每间隔5min，振荡一次，促使 细胞分离。
2. 绘图表示所观察到的实验结果，并对其予以分析。
1. 你认为原代培养中最关键的步骤是什么？为什么？ 2. 在毒理实验的检测中，原代培养细胞具有什么样
的优势？
② 实验后，请将解剖器械、离心管冲洗干净（自来水-去 离子水-三蒸水），放入烘箱烘干，超净工作台内擦拭 干净，酒精喷洒消毒，并将酒精擦干净，打开紫外灯 灭菌。
③ 各个实验小组的同学负责将垃圾带走，值日生打扫实 验室卫生。
光源
目镜 光亮度调节
电源开关
环状光阑
物镜 粗/细准焦螺旋
1. 总结原代培养的实验步骤以及在操作过程中需要 注意的问题。
仪器：培养箱（调整至37℃）、培养皿、解剖器 械、倒置相差显微镜。
材料：胎鼠或新生小鼠。 试剂：DMEM培养基（含血清10%）、0.25%胰蛋白
酶、75%消毒酒精。
1. 实验前将无血清培养基和含血清培养基分装并进 行温育（37℃）。
以温度计实际显 示温度为准！
2. 将胎鼠或新生小鼠引颈处死，置于75%消毒酒精浸 泡2~3s，带入超净工作台。
3. 将小鼠腹面朝上，置于灭菌的大培养皿中。
4. 取出灭菌的解剖器械，解剖小鼠，取出肝脏。
5. 将小鼠肝脏置于灭菌的大培养皿皿盖上，剔除脂 肪和结缔组织，并用无血清培养基反复冲洗3次， 每次2-3ml。。
6. 用手术剪将肝脏剪成小块（1mm3）,无血清培养基 冲洗三次。
7. 将组织转移到一次性培养皿中，排列贴附于皿底。 组织块间间隔约0.5-1cm,静置数分钟。
待组织变得疏松，略发白时，加入1ml含血清的DMEM培养 基，终止胰蛋白酶的消化作用。
1000rpm离心10min,加入含血清DMEM培养基3ml，充分吹 打，混匀。
细胞悬液过细胞筛网(100um孔径)到一次性培养皿中(中皿)， 标记并转入二氧化碳培养箱培养，2-3天后镜检观察。
① 实验完毕，将培养基瓶口迅速过酒精灯火焰消毒，拧 紧后，封口膜密封。拿出超净台，放入冰箱。
1. 掌握原代培养的一般方法和步骤以及培养过程中 的无菌操作技术。
2. 熟悉原代培养细胞的观察方法。
直接从生物体内获取组织细胞进行的首次培养称为 原代培养。
原代培养是建立各种细胞系的第一步，是从事培养 工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。
根据培养方法不同原代培养分为组织块培养法和单 层细胞培养法。
8. 待组织粘附后，缓缓加入含血清的培养基，切勿 将组织块冲起，做好标记，转入培养箱培养，镜 检观察。
取出的剩余肝组织充分剪碎后，用剪过的蓝枪头将其转入离心 管，1000rpm离心5min，弃上清，根据组织量的多少加入 0.25%胰蛋白酶1-1.5ml。
37℃水浴消化约10-15min，每间隔5min，振荡一次，促使 细胞分离。
2. 绘图表示所观察到的实验结果，并对其予以分析。
1. 你认为原代培养中最关键的步骤是什么？为什么？ 2. 在毒理实验的检测中，原代培养细胞具有什么样
的优势？
② 实验后，请将解剖器械、离心管冲洗干净（自来水-去 离子水-三蒸水），放入烘箱烘干，超净工作台内擦拭 干净，酒精喷洒消毒，并将酒精擦干净，打开紫外灯 灭菌。
③ 各个实验小组的同学负责将垃圾带走，值日生打扫实 验室卫生。
光源
目镜 光亮度调节
电源开关
环状光阑
物镜 粗/细准焦螺旋
1. 总结原代培养的实验步骤以及在操作过程中需要 注意的问题。