原代小鼠肝细胞制备
小鼠肝细胞的分离与原代培养
Ｋｅ ｒ ｓ ｐ ｉ ｒ ｅ ｌｃ ｔ ｒ ｙ ｗｏ ｄ ｒｍａ ｙ ｃ ｌ ｕｌｕ ｅ；ｈ ｐａ ｏ ｙ ｅ ｅ ｔ ｃ ｔ ｓ；ｃ ｌ ｉｏｌ ｔｏ ｅ １ ｓ ａ ｉ ｎ；ｃ ｌ ｃ ｌｕｒ ｅ１ ｕｔ ｅ
肝 脏 作 为 机体 重要 的代 谢 器 官 ， 多 种 生 理 病 理 过 程 中 在 发 挥 重 要 作 用 ， 细 胞 行 使 了肝 脏 主 要 的功 能 ， 合 成 凝 血 肝 如 因子 和 血 清 白蛋 白 及 多 种 消 化 酶 、 与 内 分 泌 调 节 、 谢 多 参 代
态 变 化 进行 观察 ， 进 一 步 进 行 相 关研 究奠 定 基 础 。 为
赖 静 杨天 燕 韦锦斌 。 王乃平
南 宁 ５０ ０ ） ３ ０ １
（ 西 中医 学 院 药 学 院 广
摘 要 目的 ： 求 一 种 简 易 、 济 的小 鼠原 代 肝 细 胞 的 分 离 与 培 养 方 法 。方 法 ： 用 非 灌 注 法 分 离 小 鼠 肝 脏 ， 用 ０ ２ Ｉ 探 经 采 利 ． Ｖ型胶 原 酶 对 肝脏 消 化来 获 取肝 细胞 ， Ｄ 以 ＭＥ 培 养 基 对 肝 细 胞 进 行 单 层 培 养 。 结 果 ： 较 成 功 地 进 行 了 原 代 肝 细 胞 培 养 ， 进 行 Ｍ 比 并
４ ８ｇ Ｉ ． ／ ＨＥＰ ＥＳ， 胎 牛 血 清 （ 季 青 ） ５ ｍＬ Ｌ Ｌ 谷 氨 酰 ５ 四 ， ／
种 营 养 物 质 、 存 葡 萄 糖 、 除 毒 素 等 ， 代 培 养 的 肝 细 胞 广 储 清 原 泛 用 于 药 理 学 、 理 学 、 疫 学 、 子 生 物 学 、 胞 生 物 学 等 毒 免 分 细 相 关 的 研 究 ， 其 在 药 物 研 发 方 面 ， 用 原 代 肝 细 胞 可 较 经 尤 使 济 和 迅 速 地 阐 明 药 物对 药物 代 谢 酶 的 诱 导 或 抑 制 作 用 ， 而 从 避 免 采 用 大 量 动 物 进行 药理 效 应 筛 选 。但 是 ， 于 原 代 肝 细 由 胞 增 殖 能 力 差 ， 易 长 时 间 保 存 或 长 期 培 养 及 其 生 物 学性 状 不
小鼠提原代肝细胞原理
小鼠提原代肝细胞原理
小鼠提原代肝细胞是一种实验室技术，用于研究和探索肝脏生物学和疾病机制。
其原理主要包括以下几个步骤：
1. 鼠标准备：选取适合的小鼠作为实验对象，例如常用的实验小鼠品种如C57BL/6等。
2. 消化和分离：通过注射合适的麻醉药物使小鼠进入无意识状态，然后进行腹腔解剖，取出肝脏组织。
将肝脏组织切碎并进行酶消化，将肝细胞从其他细胞分离出来。
3. 培养和传代：将分离得到的原代肝细胞放入适当的培养基中，并提供适宜的营养物质和环境条件，使其在培养皿中继续生长和增殖。
当细胞充分增殖并达到一定密度时，可以进行传代，即将细胞从原培养皿中分离并重新分配到新的培养皿中。
4. 鉴定和确认：对传代后的细胞进行鉴定和确认，例如通过形态学观察、细胞计数、细胞功能检测等方法，确保细胞的纯度和活性。
同时，可使用特异性标记物如肝细胞特异性蛋白等进行免疫染色，确认细胞的特异性。
通过小鼠提原代肝细胞，科研人员可以获得高质量的原代肝细胞样本，用于开展各种疾病模型、药物筛选和机制研究等实验。
该技术为肝脏疾病的治疗和预防提供了重要的实验基础。
小鼠原代肝细胞分离方法
小鼠原代肝细胞分离方法引言：小鼠原代肝细胞分离是研究肝脏生理和病理过程中常用的实验手段。
本文将介绍一种常用的小鼠原代肝细胞分离方法，旨在为科研工作者提供参考和指导。
材料与仪器：- 小鼠- 75%乙醇- 磷酸盐缓冲盐水（PBS）- 培养基- 消化液- 离心管- 离心机- 显微镜- 细胞计数板方法：1. 准备工作a. 确保实验室环境干净，无细菌污染。
b. 消毒所需的仪器和材料，如离心管、培养皿等。
c. 准备所需的培养基和消化液，并将其预先加热至37℃。
2. 小鼠准备a. 使用75%乙醇对小鼠进行消毒，并将小鼠放置在消毒好的工作台上。
b. 使用显微镜观察小鼠的外部特征，确保小鼠健康无异常。
3. 小鼠肝脏采集a. 将小鼠固定在手术台上，用消毒的剪刀剪开腹腔。
b. 小心地将腹腔内的肝脏暴露出来，并使用消毒的注射器注入适量的PBS冲洗肝脏表面，以去除血液。
4. 肝脏消化a. 将肝脏放入含有预先加热至37℃的消化液的培养皿中。
b. 使用剪刀或刀片将肝脏切碎成小块，确保充分暴露细胞表面。
c. 将培养皿放入37℃恒温培养箱中，进行消化反应。
消化时间根据实验需要而定，通常为30-60分钟。
5. 细胞分离a. 用吸管轻轻吸取消化液中的细胞，转移到新的离心管中。
b. 将离心管放入离心机中，以1000rpm的速度离心5分钟，以沉淀细胞。
c. 倒掉上清液，保留细胞沉淀。
d. 加入适量的培养基，轻轻悬浮细胞，并进行细胞计数。
6. 细胞培养a. 将细胞悬浮液均匀地分配到预先消毒好的培养皿中。
b. 在37℃恒温培养箱中，以5% CO2的条件下培养细胞。
c. 定期观察细胞的形态和增长情况，并根据需要进行后续实验。
讨论：小鼠原代肝细胞分离是一项常见的实验技术，用于研究肝脏生理和病理过程。
本文介绍的方法是一种经典的分离方法，通过肝脏消化和离心沉淀的步骤，成功地获得了小鼠原代肝细胞。
该方法具有操作简单、高效可靠的特点，适用于多种实验需求。
小鼠原代肝细胞分离培养
小鼠原代肝细胞分离培养准备材料1.能够提供灌注速度为1-10mL/分钟的蠕动泵（我们用的是保定兰格的蠕动泵，某宝有售）；2.能够容纳50-100mL溶液的无菌容器；3.凹槽（可供放置操作台面并提供引流槽，我们用的是搪瓷实验盘+泡沫板的组合）；4.可维持37℃的水浴设备（即恒温水浴锅）；5.无菌100mL广口玻璃瓶；6.无菌50mL锥形管；7.一次性或可重复使用的70微米不锈钢过滤器（就是不锈钢滤网，查阅资料提示这里选用的滤网规格大概为200目左右）；8.细胞培养皿（直径10cm，即常说的大皿）；9.无菌器械，至少要有一把剪刀和两对细尖镊子；10.70%-75%酒精和去污剂（去污剂我们没有用过，只要小鼠备皮充分一般影响不大），均盛装于喷雾瓶中（碘剂可选）；11.麻醉剂，注射或吸入剂型均可（我们选用水合氯醛或戊巴比妥）；12.Vacutainer牌蝶型插管（我们选用BD公司的套管针）; 推荐小鼠体重：20g-40g（我们的建议是25g以上）；13.口罩；14. 每只小鼠2只吸水台垫（我们是用大量吸水纸代替吸水台垫铺在手术操作平台上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；15.动物操作台；16.胶带。
分离试剂1.前灌液：Hank's缓冲盐溶液（HBSS），使用不含钙镁离子、含0.5mM EGTA 的1x工作液；共需要大约 60ml-70ml；使用前预温至37℃；2.后灌液：IV型胶原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mM HEPES（低糖DMEM 和IV型胶原酶是必须的，HEPES缓冲液等等可以选择性加入）；共需要90ml。
注意确保所使用的DMEM含钙；使用前预温至37℃；3.分散液：IV型胶原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4℃预冷；4.IV型胶原酶;在消化液和分散液中，胶原酶的浓度至少要达到100胶原酶消化单位/ml（100CDU/ml）；（我们使用的是购自Gibco公司的IV型胶原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝细胞）；5.蒸馏水。
小鼠肝细胞原代培养
1. 处死及消毒：脱颈处死小鼠, 浸入75%酒精 中1min, 沥干。
2. 取材：剪开腹部皮肤,撕开皮肤,暴露腹膜,打 开腹腔,取出肝脏。
3. 解剖：修剪除去肝门区血管结缔组织,剪取 一块蚕豆大小的肝组织。
4. 剪切：把肝组织剪成1 ～ 2mm３小块, 用无 血清培养液淋洗2～3次。
5. 消化：将肝组织块移入小瓶中, 加8ml混合消化 液, 37℃、40min, 每隔5～10min顺时针摇匀。
6. 过滤：消化液过100目筛网, 收集滤液, 移入离 心管。
7.离心：离心800rpm, 5min, 吸弃上清液。
8. 洗涤：用无血清培养液离心洗涤１次。
9. 重悬浮及计数：用RPIM1640培养液(含10%胎牛 血清)重悬浮肝细胞, （取样计数）。
10.接种及培养：将细胞接种于培养瓶中, 密度为 106/ml (2×105/cm2), 37℃、5%CO2培养。
本内容仅供参考,如需使用，请根据自己实际情况更改后使用！
放映结束 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ谢各位批评指导！
谢 谢！
让我们共同进步
小鼠肝细胞原代培养实验
小鼠肝细胞原代培养实验一、实验材料准备1. 动物：小鼠。
2. 试剂：DMEM(含血清)、无血清DMEM 培养基、胰酶、PBS 。
3. 器械：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管(15/50 ml)、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器。
4. 准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
二、方法1. 将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS 的平皿中。
2. 剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有PBS 液的平皿中。
实验方法原理将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA ）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
实验材料小鼠试剂、试剂盒 DMEM 无血清DMEM 培养基胰酶PBS仪器、耗材饭盒纱布剪子镊子烧杯平皿研磨玻片滤网离心管6孔培养板吸管移液管手套微量加样器2.3 用手术剪将脏器剪成小块(大小约1mm2)，玻片研磨，转到离心管，离心(1 000 rpm，5 min)。
4. 视组织或细胞量加入5-6倍(3-5 ml)胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5. 加入3-5 ml含血清的培养液以中止胰酶消化作用。
6. 用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。
7. 再次离心5 min，弃上清液。
8. 加入无血清培养液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9. 加入含血清的培养液1-2 ml(视细胞量)，血球计数板计数。
10. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。
原代肝细胞培养方法
原代肝细胞培养方法原代肝细胞培养是一种重要的技术手段，它可以使我们更好地理解肝细胞的生物学特性和功能，同时也被广泛应用于药物筛选、毒性研究和肝脏疾病模型的建立。
本文将探讨原代肝细胞培养的方法。
原代肝细胞是从动物（如小鼠、大鼠、猪等）或人体新鲜肝组织中分离得到的肝细胞。
它们具有种独立性和细胞特异性功能，是进行体外研究的理想模型细胞。
原代肝细胞培养的主要步骤包括：肝组织的分离、肝细胞的分离和纯化、肝细胞的培养和维持。
首先，肝组织的分离是原代肝细胞培养的起始步骤。
一般来说，选择健康的动物或人体捐赠的新鲜肝组织，快速解剖分离，并将其置于含有冷蘸过消毒的生理盐水或缓冲液的离心管中。
然后，用小剪刀对肝组织进行切细，使其暴露于细胞分离液或酶溶液中。
常用的细胞分离液包括肝素-胰酶、胰酶、胶原酶、凝集酶及胰蛋白酶。
这些酶能够降解结缔组织，使肝细胞从肝组织中游离出来。
接下来，肝细胞的分离和纯化是确保原代肝细胞培养成功的关键一步。
一般而言，将细胞分离液转移至新离心管，并用对应的培养基对其停滞，使浮游的肝细胞顺应性地附着在组织培养器皿的底部。
在培养基的作用下，非肝细胞（如纤维细胞和非肝上皮细胞）会悬浮离开，而肝细胞则紧密附着在培养器皿上。
此时，我们可以通过控制等粘附时间、细胞数目、培养基的组分和浓度，使纯化程度达到最佳。
然后，肝细胞的培养和维持是原代肝细胞培养的持续关键步骤。
首先，选择合适的培养基是非常重要的。
常用的培养基包括DMEM、威利精简培养基和L-15培养基等。
这些培养基中会添加适量的营养物质（如葡萄糖、氨基酸和维生素）和生长因子（如胰岛素、胆固醇和转铁蛋白）。
其次，细胞密度的控制也非常重要。
通常，当细胞趋于稳定时，可以通过减少培养皿内细胞的数量来避免细胞互相竞争和过度分泌胺碱酸等蛋白质。
此外，保持培养环境的稳定也是原代肝细胞培养的重要环节。
温度、湿度、CO₂浓度和培养基的更新等因素都会对肝细胞的生长和功能有一定的影响。
小鼠原代肝细胞实验报告
一、实验目的1. 掌握小鼠原代肝细胞的分离和培养方法；2. 了解肝细胞在体外培养过程中的生物学特性；3. 探讨肝细胞培养条件对细胞生长和功能的影响。
二、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠（体重20-25g）；2. 培养基：RPMI 1640培养基（含10%新生牛血清、1%双抗、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺）；3. 试剂：0.25%胰蛋白酶、0.2%胶原酶、台盼蓝染色液；4. 仪器：超净工作台、倒置显微镜、离心机、培养箱等。
三、实验方法1. 小鼠原代肝细胞的分离（1）处死小鼠，取出肝脏；（2）将肝脏放入含有RPMI 1640培养基的培养皿中，用剪刀剪成1mm³左右的小块；（3）加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化10min；（4）加入0.2%胶原酶，37℃水浴消化30min；（5）消化过程中每隔5min轻轻摇动培养皿，使肝细胞充分释放；（6）消化结束后，将消化液过滤，收集肝细胞悬液；（7）用RPMI 1640培养基洗涤肝细胞悬液2次，去除未消化的组织碎片；（8）将肝细胞悬液离心（1000r/min，5min），弃去上清液；（9）用RPMI 1640培养基重悬肝细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。
2. 肝细胞培养（1）将肝细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养；（2）每隔2-3天更换新鲜培养基；（3）观察肝细胞的生长情况，记录细胞贴壁、伸长、伪足形成等过程；（4）利用台盼蓝染色法检测细胞存活率；（5）观察肝细胞在培养过程中的形态学变化。
3. 肝细胞功能检测（1）收集培养24h后的肝细胞，用RPMI 1640培养基洗涤2次；（2）加入0.5%台酚蓝染液，37℃水浴染色30min；（3）用RPMI 1640培养基洗涤细胞，去除未结合的染料；（4）用酶标仪检测吸光度（A）值，计算肝细胞对台酚蓝的摄取量。
四、实验结果1. 肝细胞分离与培养（1）分离得到的肝细胞形态为圆形、椭圆形或不规则形，细胞核清晰可见；（2）细胞存活率约为64.1%；（3）细胞在培养过程中呈典型的上皮样细胞形态，胞浆内有空泡和脂滴，相邻细胞伸长的伪足相互连接。
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细胞培养室肝细胞原代培养标准操作规程
实验试剂
培养基：William’s E Medium(GiBCO 12551-032), 谷氨酰胺(GiBco 21051-024-100g)292mg/L，双抗（GiBco 15140-122 penicillin +10,000Units/mL, streptomycin +10,000μg /mL）5mL/500mL, 胰岛素(GiBCO 12585-014 4 mg/mL)8μg/mL, 地塞米松（中国药品生物制品检定所）5mg/L。
D-Hanks’液（CaCl2 0.55g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, Na2HPO4•7H2O 0.06g/L, NaHCO3 0.35g/L, 三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2-7.4, 4℃保存）
0.05%胶原酶Ⅳ溶液(（Sigma C5138-1G） D-Hanks’液溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃
保存）)
PBS预灌流溶液（NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L, KH2PO40.2g/L, Na2HPO4•7H2O 1.56g/L, EDTA 0.1mM, 三蒸水溶解, NaHCO3调pH 7.2-7.4, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存）
鼠尾胶原（GiBCO A10483-01 20mL/ 瓶）（0.05 mg/ mL）用0.02M 的醋酸稀释,临用现配）
0.02M 的醋酸：115μL的醋酸(大于99%)用水稀释至100mL
0.05 mg/ mL-200μL鼠尾胶原（5 mg/ mL）用0.02M的醋酸稀释至20 mL
Overlay(0.25 mg/ mL的Matrigel（BD 356237）(用William’s E Medium稀释，视具体批号而定稀释倍数，临用现配）
Hanks’液（CaCl2 0.14g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, MgCl2•6H2O 0.10g/L, MgSO4.7H2O 0.10g/L, Na2HPO4•7H2O 0.09g/L, NaHCO3 0.35g/L, D-葡萄糖 1.0 g/L，三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2附近，4℃保存）
实验仪器
CO2 恒温培养箱（日本SANYO 公司）；
Sigma高速离心机；
IX-51 型荧光倒置显微镜（日本尼康公司）；
DHL-A电脑恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）；
液相-质谱联用分析系统（LC/MS/MS）由美国Thermo系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、以及Thermo Finnigan LTQ线性离子阱质谱检测器，系统工作软件为XcaLibur（美国）；
Sigma5310离心机；
ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。
实验方法
实验准备
在24孔板底涂布鼠尾胶原（0.05 mg/ mL）300 μL/well，置于室温下成胶1h后吸出多余胶原，细胞悬液种板前用William’ s E Medium培养基洗去表面的酸性物质。
体外灌流
分别取PBS预灌流溶液和0.05%Ⅳ型胶原酶液在水浴中预温敷至37℃。
恒流蠕动泵接三号管，以6mL/min的速度匀速灌注75%酒精，PBS预灌流溶液。
腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠(0.5mL/100g)→仰卧固定，门静脉插入导管，动脉夹固定→剪断下腔静脉腹腔段，经门静脉插管以6mL/min的速度匀速灌注预温孵的PBS预灌流溶液以去除肝内血液及钙离子→当肝脏变苍白、下腔静脉流出液体变清时开始灌注预温的胶原酶液，流速约4mL/min，约6-10min→肝脏颜色变成土黄色、包膜下呈龟背状裂隙、压之凹陷不易恢复时停止灌注→完整摘除肝脏。
超净台内分离
在超净台中揭去被膜→将细胞混悬液用200目尼龙网筛过滤，滤液50g 低速离心3min→沉淀用William’s E Medium离心一次（50g，3min）→接着同法洗涤两次→最后加入William’s E Medium 制成细胞悬液，按1.5×106个/ml的细胞密度种板，每孔400μL，密度为1×106个/cm2，四小时后换William’s E Medium，间隔24小时换William’s E Medium（含0.25mg/mL的Matrigel）500 μL/well，以后每天换一次William’s E Medium(1000μL/well)，至第三天。
细胞计数和存活率判定
吸取50μL稀释悬液转到一EP管中，加入0.4%台盼蓝染液50μL（1:1）并混匀。
在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，在10×物镜下观察。
先计数一个大方格内的死细胞数（蓝染者）和总细胞数，再计数全部4个大方格内的细胞总数，据公式：活细胞率 = 活细胞数/1大方格细胞总数×100%和细胞密度（个/mL）= （4大方格细胞总数/4）×104×稀释倍数，计算活细胞率和细胞密度，随后计算出肝细胞总数（产量）。
肝细胞诱导实验
肝细胞换液（William’s E）至第三天，加入诱导剂（诱导剂用William’s E稀释），每天换液（诱导剂）至第六天，加药前各孔加入37℃的空白Hanks’（PH=7.1～7.3）1mL，置于37℃摇床中，10min后轻轻吸干孔内Hanks’，以期在不破坏其单层膜的基础上除去细胞表面的杂质。
将底物按设定浓度溶解于Hanks’液中，后加入各孔，（24孔板加入200μL/well， 12孔板加入400μL/well）置于37℃培养箱中，120min时迅速吸出药物，同时做空白对照（加入空白Hanks’）。
样品-20℃储存待测。
样品处理方法
取出一定量的样品，加入等体积的含Tid（10μg/m L）的ACN，混合10min沉淀蛋白，离心
（15300rpm,10min）一次，取50μL进板。