原代小鼠肝细胞制备
小鼠肝细胞的分离与原代培养
Ｋｅ ｒ ｓ ｐ ｉ ｒ ｅ ｌｃ ｔ ｒ ｙ ｗｏ ｄ ｒｍａ ｙ ｃ ｌ ｕｌｕ ｅ；ｈ ｐａ ｏ ｙ ｅ ｅ ｔ ｃ ｔ ｓ；ｃ ｌ ｉｏｌ ｔｏ ｅ １ ｓ ａ ｉ ｎ；ｃ ｌ ｃ ｌｕｒ ｅ１ ｕｔ ｅ
肝 脏 作 为 机体 重要 的代 谢 器 官 ， 多 种 生 理 病 理 过 程 中 在 发 挥 重 要 作 用 ， 细 胞 行 使 了肝 脏 主 要 的功 能 ， 合 成 凝 血 肝 如 因子 和 血 清 白蛋 白 及 多 种 消 化 酶 、 与 内 分 泌 调 节 、 谢 多 参 代
态 变 化 进行 观察 ， 进 一 步 进 行 相 关研 究奠 定 基 础 。 为
赖 静 杨天 燕 韦锦斌 。 王乃平
南 宁 ５０ ０ ） ３ ０ １
（ 西 中医 学 院 药 学 院 广
摘 要 目的 ： 求 一 种 简 易 、 济 的小 鼠原 代 肝 细 胞 的 分 离 与 培 养 方 法 。方 法 ： 用 非 灌 注 法 分 离 小 鼠 肝 脏 ， 用 ０ ２ Ｉ 探 经 采 利 ． Ｖ型胶 原 酶 对 肝脏 消 化来 获 取肝 细胞 ， Ｄ 以 ＭＥ 培 养 基 对 肝 细 胞 进 行 单 层 培 养 。 结 果 ： 较 成 功 地 进 行 了 原 代 肝 细 胞 培 养 ， 进 行 Ｍ 比 并
４ ８ｇ Ｉ ． ／ ＨＥＰ ＥＳ， 胎 牛 血 清 （ 季 青 ） ５ ｍＬ Ｌ Ｌ 谷 氨 酰 ５ 四 ， ／
种 营 养 物 质 、 存 葡 萄 糖 、 除 毒 素 等 ， 代 培 养 的 肝 细 胞 广 储 清 原 泛 用 于 药 理 学 、 理 学 、 疫 学 、 子 生 物 学 、 胞 生 物 学 等 毒 免 分 细 相 关 的 研 究 ， 其 在 药 物 研 发 方 面 ， 用 原 代 肝 细 胞 可 较 经 尤 使 济 和 迅 速 地 阐 明 药 物对 药物 代 谢 酶 的 诱 导 或 抑 制 作 用 ， 而 从 避 免 采 用 大 量 动 物 进行 药理 效 应 筛 选 。但 是 ， 于 原 代 肝 细 由 胞 增 殖 能 力 差 ， 易 长 时 间 保 存 或 长 期 培 养 及 其 生 物 学性 状 不
小鼠提原代肝细胞原理
小鼠提原代肝细胞原理
小鼠提原代肝细胞是一种实验室技术，用于研究和探索肝脏生物学和疾病机制。
其原理主要包括以下几个步骤：
1. 鼠标准备：选取适合的小鼠作为实验对象，例如常用的实验小鼠品种如C57BL/6等。
2. 消化和分离：通过注射合适的麻醉药物使小鼠进入无意识状态，然后进行腹腔解剖，取出肝脏组织。
将肝脏组织切碎并进行酶消化，将肝细胞从其他细胞分离出来。
3. 培养和传代：将分离得到的原代肝细胞放入适当的培养基中，并提供适宜的营养物质和环境条件，使其在培养皿中继续生长和增殖。
当细胞充分增殖并达到一定密度时，可以进行传代，即将细胞从原培养皿中分离并重新分配到新的培养皿中。
4. 鉴定和确认：对传代后的细胞进行鉴定和确认，例如通过形态学观察、细胞计数、细胞功能检测等方法，确保细胞的纯度和活性。
同时，可使用特异性标记物如肝细胞特异性蛋白等进行免疫染色，确认细胞的特异性。
通过小鼠提原代肝细胞，科研人员可以获得高质量的原代肝细胞样本，用于开展各种疾病模型、药物筛选和机制研究等实验。
该技术为肝脏疾病的治疗和预防提供了重要的实验基础。
小鼠原代肝细胞分离方法
小鼠原代肝细胞分离方法引言：小鼠原代肝细胞分离是研究肝脏生理和病理过程中常用的实验手段。
本文将介绍一种常用的小鼠原代肝细胞分离方法，旨在为科研工作者提供参考和指导。
材料与仪器：- 小鼠- 75%乙醇- 磷酸盐缓冲盐水（PBS）- 培养基- 消化液- 离心管- 离心机- 显微镜- 细胞计数板方法：1. 准备工作a. 确保实验室环境干净，无细菌污染。
b. 消毒所需的仪器和材料，如离心管、培养皿等。
c. 准备所需的培养基和消化液，并将其预先加热至37℃。
2. 小鼠准备a. 使用75%乙醇对小鼠进行消毒，并将小鼠放置在消毒好的工作台上。
b. 使用显微镜观察小鼠的外部特征，确保小鼠健康无异常。
3. 小鼠肝脏采集a. 将小鼠固定在手术台上，用消毒的剪刀剪开腹腔。
b. 小心地将腹腔内的肝脏暴露出来，并使用消毒的注射器注入适量的PBS冲洗肝脏表面，以去除血液。
4. 肝脏消化a. 将肝脏放入含有预先加热至37℃的消化液的培养皿中。
b. 使用剪刀或刀片将肝脏切碎成小块，确保充分暴露细胞表面。
c. 将培养皿放入37℃恒温培养箱中，进行消化反应。
消化时间根据实验需要而定，通常为30-60分钟。
5. 细胞分离a. 用吸管轻轻吸取消化液中的细胞，转移到新的离心管中。
b. 将离心管放入离心机中，以1000rpm的速度离心5分钟，以沉淀细胞。
c. 倒掉上清液，保留细胞沉淀。
d. 加入适量的培养基，轻轻悬浮细胞，并进行细胞计数。
6. 细胞培养a. 将细胞悬浮液均匀地分配到预先消毒好的培养皿中。
b. 在37℃恒温培养箱中，以5% CO2的条件下培养细胞。
c. 定期观察细胞的形态和增长情况，并根据需要进行后续实验。
讨论：小鼠原代肝细胞分离是一项常见的实验技术，用于研究肝脏生理和病理过程。
本文介绍的方法是一种经典的分离方法，通过肝脏消化和离心沉淀的步骤，成功地获得了小鼠原代肝细胞。
该方法具有操作简单、高效可靠的特点，适用于多种实验需求。
小鼠原代肝细胞分离培养
小鼠原代肝细胞分离培养准备材料1.能够提供灌注速度为1-10mL/分钟的蠕动泵（我们用的是保定兰格的蠕动泵，某宝有售）；2.能够容纳50-100mL溶液的无菌容器；3.凹槽（可供放置操作台面并提供引流槽，我们用的是搪瓷实验盘+泡沫板的组合）；4.可维持37℃的水浴设备（即恒温水浴锅）；5.无菌100mL广口玻璃瓶；6.无菌50mL锥形管；7.一次性或可重复使用的70微米不锈钢过滤器（就是不锈钢滤网，查阅资料提示这里选用的滤网规格大概为200目左右）；8.细胞培养皿（直径10cm，即常说的大皿）；9.无菌器械，至少要有一把剪刀和两对细尖镊子；10.70%-75%酒精和去污剂（去污剂我们没有用过，只要小鼠备皮充分一般影响不大），均盛装于喷雾瓶中（碘剂可选）；11.麻醉剂，注射或吸入剂型均可（我们选用水合氯醛或戊巴比妥）；12.Vacutainer牌蝶型插管（我们选用BD公司的套管针）; 推荐小鼠体重：20g-40g（我们的建议是25g以上）；13.口罩；14. 每只小鼠2只吸水台垫（我们是用大量吸水纸代替吸水台垫铺在手术操作平台上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；15.动物操作台；16.胶带。
分离试剂1.前灌液：Hank's缓冲盐溶液（HBSS），使用不含钙镁离子、含0.5mM EGTA 的1x工作液；共需要大约 60ml-70ml；使用前预温至37℃；2.后灌液：IV型胶原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mM HEPES（低糖DMEM 和IV型胶原酶是必须的，HEPES缓冲液等等可以选择性加入）；共需要90ml。
注意确保所使用的DMEM含钙；使用前预温至37℃；3.分散液：IV型胶原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4℃预冷；4.IV型胶原酶;在消化液和分散液中，胶原酶的浓度至少要达到100胶原酶消化单位/ml（100CDU/ml）；（我们使用的是购自Gibco公司的IV型胶原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝细胞）；5.蒸馏水。
小鼠肝细胞原代培养
1. 处死及消毒：脱颈处死小鼠, 浸入75%酒精 中1min, 沥干。
2. 取材：剪开腹部皮肤,撕开皮肤,暴露腹膜,打 开腹腔,取出肝脏。
3. 解剖：修剪除去肝门区血管结缔组织,剪取 一块蚕豆大小的肝组织。
4. 剪切：把肝组织剪成1 ～ 2mm３小块, 用无 血清培养液淋洗2～3次。
5. 消化：将肝组织块移入小瓶中, 加8ml混合消化 液, 37℃、40min, 每隔5～10min顺时针摇匀。
6. 过滤：消化液过100目筛网, 收集滤液, 移入离 心管。
7.离心：离心800rpm, 5min, 吸弃上清液。
8. 洗涤：用无血清培养液离心洗涤１次。
9. 重悬浮及计数：用RPIM1640培养液(含10%胎牛 血清)重悬浮肝细胞, （取样计数）。
10.接种及培养：将细胞接种于培养瓶中, 密度为 106/ml (2×105/cm2), 37℃、5%CO2培养。
本内容仅供参考,如需使用，请根据自己实际情况更改后使用！
放映结束 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ谢各位批评指导！
谢 谢！
让我们共同进步
小鼠肝细胞原代培养实验
小鼠肝细胞原代培养实验一、实验材料准备1. 动物：小鼠。
2. 试剂：DMEM(含血清)、无血清DMEM 培养基、胰酶、PBS 。
3. 器械：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管(15/50 ml)、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器。
4. 准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
二、方法1. 将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS 的平皿中。
2. 剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有PBS 液的平皿中。
实验方法原理将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA ）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
实验材料小鼠试剂、试剂盒 DMEM 无血清DMEM 培养基胰酶PBS仪器、耗材饭盒纱布剪子镊子烧杯平皿研磨玻片滤网离心管6孔培养板吸管移液管手套微量加样器2.3 用手术剪将脏器剪成小块(大小约1mm2)，玻片研磨，转到离心管，离心(1 000 rpm，5 min)。
4. 视组织或细胞量加入5-6倍(3-5 ml)胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5. 加入3-5 ml含血清的培养液以中止胰酶消化作用。
6. 用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。
7. 再次离心5 min，弃上清液。
8. 加入无血清培养液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9. 加入含血清的培养液1-2 ml(视细胞量)，血球计数板计数。
10. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。
原代肝细胞培养方法
原代肝细胞培养方法原代肝细胞培养是一种重要的技术手段，它可以使我们更好地理解肝细胞的生物学特性和功能，同时也被广泛应用于药物筛选、毒性研究和肝脏疾病模型的建立。
本文将探讨原代肝细胞培养的方法。
原代肝细胞是从动物（如小鼠、大鼠、猪等）或人体新鲜肝组织中分离得到的肝细胞。
它们具有种独立性和细胞特异性功能，是进行体外研究的理想模型细胞。
原代肝细胞培养的主要步骤包括：肝组织的分离、肝细胞的分离和纯化、肝细胞的培养和维持。
首先，肝组织的分离是原代肝细胞培养的起始步骤。
一般来说，选择健康的动物或人体捐赠的新鲜肝组织，快速解剖分离，并将其置于含有冷蘸过消毒的生理盐水或缓冲液的离心管中。
然后，用小剪刀对肝组织进行切细，使其暴露于细胞分离液或酶溶液中。
常用的细胞分离液包括肝素-胰酶、胰酶、胶原酶、凝集酶及胰蛋白酶。
这些酶能够降解结缔组织，使肝细胞从肝组织中游离出来。
接下来，肝细胞的分离和纯化是确保原代肝细胞培养成功的关键一步。
一般而言，将细胞分离液转移至新离心管，并用对应的培养基对其停滞，使浮游的肝细胞顺应性地附着在组织培养器皿的底部。
在培养基的作用下，非肝细胞（如纤维细胞和非肝上皮细胞）会悬浮离开，而肝细胞则紧密附着在培养器皿上。
此时，我们可以通过控制等粘附时间、细胞数目、培养基的组分和浓度，使纯化程度达到最佳。
然后，肝细胞的培养和维持是原代肝细胞培养的持续关键步骤。
首先，选择合适的培养基是非常重要的。
常用的培养基包括DMEM、威利精简培养基和L-15培养基等。
这些培养基中会添加适量的营养物质（如葡萄糖、氨基酸和维生素）和生长因子（如胰岛素、胆固醇和转铁蛋白）。
其次，细胞密度的控制也非常重要。
通常，当细胞趋于稳定时，可以通过减少培养皿内细胞的数量来避免细胞互相竞争和过度分泌胺碱酸等蛋白质。
此外，保持培养环境的稳定也是原代肝细胞培养的重要环节。
温度、湿度、CO₂浓度和培养基的更新等因素都会对肝细胞的生长和功能有一定的影响。
小鼠原代肝细胞实验报告
一、实验目的1. 掌握小鼠原代肝细胞的分离和培养方法；2. 了解肝细胞在体外培养过程中的生物学特性；3. 探讨肝细胞培养条件对细胞生长和功能的影响。
二、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠（体重20-25g）；2. 培养基：RPMI 1640培养基（含10%新生牛血清、1%双抗、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺）；3. 试剂：0.25%胰蛋白酶、0.2%胶原酶、台盼蓝染色液；4. 仪器：超净工作台、倒置显微镜、离心机、培养箱等。
三、实验方法1. 小鼠原代肝细胞的分离（1）处死小鼠，取出肝脏；（2）将肝脏放入含有RPMI 1640培养基的培养皿中，用剪刀剪成1mm³左右的小块；（3）加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化10min；（4）加入0.2%胶原酶，37℃水浴消化30min；（5）消化过程中每隔5min轻轻摇动培养皿，使肝细胞充分释放；（6）消化结束后，将消化液过滤，收集肝细胞悬液；（7）用RPMI 1640培养基洗涤肝细胞悬液2次，去除未消化的组织碎片；（8）将肝细胞悬液离心（1000r/min，5min），弃去上清液；（9）用RPMI 1640培养基重悬肝细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。
2. 肝细胞培养（1）将肝细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养；（2）每隔2-3天更换新鲜培养基；（3）观察肝细胞的生长情况，记录细胞贴壁、伸长、伪足形成等过程；（4）利用台盼蓝染色法检测细胞存活率；（5）观察肝细胞在培养过程中的形态学变化。
3. 肝细胞功能检测（1）收集培养24h后的肝细胞，用RPMI 1640培养基洗涤2次；（2）加入0.5%台酚蓝染液，37℃水浴染色30min；（3）用RPMI 1640培养基洗涤细胞，去除未结合的染料；（4）用酶标仪检测吸光度（A）值，计算肝细胞对台酚蓝的摄取量。
四、实验结果1. 肝细胞分离与培养（1）分离得到的肝细胞形态为圆形、椭圆形或不规则形，细胞核清晰可见；（2）细胞存活率约为64.1%；（3）细胞在培养过程中呈典型的上皮样细胞形态，胞浆内有空泡和脂滴，相邻细胞伸长的伪足相互连接。
小鼠原代肝细胞提取步骤
小鼠原代肝细胞提取步骤1. 引言1.1 背景介绍小鼠原代肝细胞是一种非常重要的细胞类型，可以用于研究肝脏相关的生物学问题。
肝脏是人体最大的内脏器官，具有重要的生理功能，如代谢、解毒、合成蛋白等。
研究小鼠原代肝细胞提取方法对于深入了解肝脏生理功能具有重要意义。
在过去的研究中，科学家们通过提取小鼠原代肝细胞，成功地模拟了肝脏在体内的功能，为肝脏疾病的研究提供了重要工具。
小鼠原代肝细胞也被广泛应用于肝脏细胞培养、药物代谢与毒性研究等领域。
小鼠原代肝细胞的提取方法的改进和优化对于促进相关领域的发展具有积极作用。
通过对小鼠原代肝细胞提取方法进行研究，可以更好地理解肝脏生理功能、疾病发生机制以及药物代谢途径。
优化提取方法，提高细胞纯度和活力，将有助于更精确地进行实验研究，为临床治疗提供更有效的参考依据。
在这一背景下，研究小鼠原代肝细胞提取方法具有重要的意义和应用前景。
1.2 研究意义小鼠是常用的实验动物之一，其肝脏细胞具有一定的再生能力，并且与人类的肝脏细胞在生物学特性上有很多相似之处。
小鼠原代肝细胞提取具有重要的研究意义。
通过对小鼠原代肝细胞的提取和培养，可以更好地研究肝脏细胞的生长、增殖和功能。
这对于深入了解肝脏生理功能、疾病发生机制以及药物代谢具有重要意义。
小鼠原代肝细胞的提取可以为基因编辑技术、药物筛选等研究提供重要的工具和平台。
通过对小鼠原代肝细胞的提取和培养，可以更好地模拟体内情况，从而加深对相关疾病的认识、寻找新的治疗方法。
小鼠原代肝细胞的提取对于肝脏生物学研究和药物研发具有重要的意义，有助于推动相关领域的进步和发展。
2. 正文2.1 小鼠原代肝细胞提取前准备工作小鼠原代肝细胞提取前准备工作是成功提取肝细胞的关键步骤之一，其主要目的是为了确保提取到的肝细胞具有较高的活力和纯度。
在进行肝细胞提取前，需要进行以下准备工作：1. 选择合适的小鼠模型：选择健康、年龄相仿的小鼠作为实验材料，确保实验结果的可靠性。
小鼠肝细胞的原代和传代培养的研究
小鼠肝细胞的原代和传代培养的研究作者：李维维来源：《学校教育研究》2021年第07期一、实验原理细胞培养是用无菌操作的方法，将动物体内的组织取出，模拟体内的生理条件，在体外进行培养。
培养过程分为原代培养和传代培养。
原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞，组织和器官，用无菌操作的方法，经销化，分散成为单个游离的细胞。
在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。
传代培养是指细胞自从一个培养瓶以1：2比例转移，接种到另一培养瓶的培养。
这次实验我所用的抗生素瓶和小玻璃珠便用于细胞的传代培养。
本来这次实验用小玻璃珠，这种模式融汇了扩大贴壁面积和便于观察的优点，并且重演性好。
二、材料（一）实验动物乳鼠10只，体质量7～8g，刚出生三天，保持室温20℃～25℃;（二）实验器材空的抗生素瓶玻璃珠眼科剪眼科镊试管吸管等（三）实验试剂磷酸缓冲液（PBS）;平衡盐液：Hank原液 Hank液;细胞消化液：0.5%胰蛋白酶和0.4%EDTA钠盐液。
以上溶液经包装，灭菌后备用三、实验步骤（一）试剂的配制1.Hank原液与Hank液的配制配制程序：（1）称取1.4g Hank原液，溶于30～50ml的蒸馏水中。
（2）取1000ml烧杯及容量瓶各一个，先放蒸馏水800ml于烧杯中，然后逐一称取药品，但必须在前一药品溶解后，方可加入下一药品，充分混匀后，分装，盖紧瓶盖，写好标签，置于4°C冰箱保存。
2.胰蛋白溶液的配制3.0.02%的EDTA鈉盐溶液的配制4.水解乳蛋白—Hank液的配制5.E-MEM营养液的配制6.104U/ml青霉素、链霉素的配制（二）实验营养液的配制1.原代细胞营养液的配制2.传代细胞营养液的配制（三）培养器皿1.玻璃漏斗式滤器玻璃漏斗式滤器将滤板与玻璃漏斗烧结成一体，适用于各种培养用液的过滤除菌，但不宜血清等粘稠液体。
2.手术器械主要用于解剖动物，取材和原代培养中切割组织。
各种器械至少需配置两套3.培养瓶用于原代培养的需要卡氏瓶10～15瓶，而传代培养需用12～25个卡氏瓶，另准备5瓶抗生素瓶，每次用完后，清洗时一定要彻底，以防下次用时污染。
小鼠原代肝细胞的分离与培养
大黄和尿毒清对大 鼠肾组织抗氧化应激作 用的比较研 究▲
梁晓静 廖 蕴华 朱 荃 何 宝
（ 广西医科大学 ， 南宁市 ５０ ２ ；广西医科大学第一附属医院肾内科 ， ３０ １ 南宁市 ５ ０２ ； ３０ １
澳门科技大学 ， 门 ０ ８３ 广州康 臣药业肾病研究中心 ， 澳 ０５ ； 广州市 ５０ ３ ） １５ ０
【 ｅ ｏｄ 】 Ｃ ｌ ｒ ｏ ｐ ｍ ￣ｃｌ ；ｅａ ｃｔ ；ｅ ｏ ｔｎ Ｃ ｌＣ ｌ ｒ Ｋ ｙｗ ｒｓ ｕｔ ｅ ｆ ｒ ａ ｅ ｓＨ ｐｔ ｙ ｓＣ ｌＩ ｌ ｉ ；ｅ ｕ ｕｅ ｕ ｉ ｌ ｏ ｅ ｌｓ ａｏ ｌ ｔ
肝 脏作 为机 体 重要 的代 谢 器 官 ， 多 种 生理 病 理 过 程 在 中发挥 重要 作用 。肝 细 胞 行 使 了肝 脏 主 要 的 功能 ， 合 成 如 动物 实验 中心提 供 ） 。 １２ 主要试 剂 完全 Ｄ Ｅ ． Ｍ Ｍ培养基 ：． ｇＬ ３． ｍ ｌＬ ２８ ／ （３３ ｏ ） ｍ ／ 碳 酸氢钠 ，． Ｌ ２ ｍ ｌ ） Ｅ Ｅ ，％ 胎牛 血 清 （ ４８ （０ｍ ｏ Ｌ Ｈ Ｐ Ｓ５ ／ 四季 青 ）５ｍ／ （ ｍ ｏ ） 一 酰胺 ，０ｍ／ （ ｍ ￣Ｌ 丙 ， ｌＬ １ ｍ ￣Ｌ Ｌ谷氨 １ ｌＬ １ｍ ｏ ） 酮 酸钠 ； 型胶 原 酶 （ｉ ａ ， Ｖ Ｉ ｓ ｍ ） 浓度 ：．％ ； — ｎ ｓ不 含 钙 ｇ ０ ２ Ｄ ｈ ｋ， ａ 镁 ，ｓ ａ ｉ ；５ （ｏ ｂ ）７ ％酒精 。 ｌ ｏ ｒ １３ 主要 实验 器材 ． １４ 肝 细胞的 分 离 ． 眼科 剪 、 眼科镊 、 术剪 、 杯 、 管 、 手 烧 滴 断头处 死 小 鼠 ，５ ７ ％酒 精 浸泡 ５Ｓ剖 ， 离 心管 、 Ｌ培养 瓶 。 ５ ｍ ０ 腹取肝 脏 ， 于装有 适量 Ｄ ｈｎ ｓ 放置 — ｋ 的培养 皿 ， 除血管 、 ａ 去 血 污 、 膜 等 ， 移 至 装 有 Ｄｈｎｓ 小 烧 杯 ， 碎 组 织 ， 包 转 － ｋ的 ａ 剪 用 Ｄｈｎｓ －ａｋ 冲洗 ２次 ， 至离 心管 ， ００ｒｍ， 心 ５ｍｎ 弃 转移 １ ０ ｐ 离 ｉ，
小鼠原代肝细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用与制作流程
图片简介:本技术提供了一种小鼠原代肝细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用，涉及原代细胞分离技术领域。
小鼠原代肝细胞的分离方法，包括如下步骤：将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小鼠原代肝细胞；原位三步灌流依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流；第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；第二灌流，用第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；第三灌流，用第三灌流液进一步消化。
该小鼠原代肝细胞的分离方法缓解了现有技术中缺乏一种分离后细胞活性高、贴壁迅速、存活细胞收率高、分离成本低并且分离过程不易污染的小鼠原代肝细胞分离方法的技术问题。
技术要求1.一种小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小鼠原代肝细胞；所述原位三步灌流依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流；所述第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；所述第二灌流，用第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；所述第三灌流，用第三灌流液进一步消化。
2.按照权利要求1所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述原位灌流的灌流血管为肝门静脉。
三灌流液对小鼠肝脏进行灌流以后，还包括用PBS对小鼠肝脏进行灌流清洗的步骤；优选地，所述PBS的温度为36-37℃；优选地，所述小鼠原代肝细胞的分离方法还包括在第二灌流以后用37℃的PBS预热小鼠肝脏的步骤；优选地，所述第三灌流液为IV型胶原酶溶液，温度为37℃，所述IV型胶原酶溶液的浓度为0.03-0.05％；优选地，所述IV型胶原酶溶液的浓度为0.048％；优选地，所述第一灌流液、第二灌流液和第三灌流液分别灌流150-200mL。
4.按照权利要求1-3任一项所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述肝周管结扎，结扎的肝周管包括：胆总管、胃十二指肠动脉、脾动脉、胃左动脉和后腔动脉；优选地，所述肝周管结扎依次结扎胆总管、胃十二指肠动脉、脾动脉、胃左动脉和后腔动脉；优选地，所述肝周管结扎包括如下步骤：(1)结剪断十二指肠韧带；(2)结扎胆总管；(3)结扎胃十二指肠动脉，追踪肝总动脉血液流经方向，直到暴露脾动脉与胃左动脉；(4)结扎并剪断脾动脉与胃左动脉，暴露腹腔动脉干；(5)将肝脏下翻，暴露背侧肝脏与膈肌，分离肝脏镰状韧带与左右三角韧带；(6)结扎胃左静脉，并在胰腺颈部双重结扎，并在结扎之间剪断胰腺(7)结扎后腔静脉；(8)上翻肝脏，分离肝门静脉周围淋巴组织，暴露肝门静脉，然后注射肝素100U。
细胞生物学实验-小鼠肝细胞原代培养
小鼠肝细胞原代培养小鼠肝细胞原代培养实验目的：1.了解并掌握原代细胞培养的相关原理2.了解并掌握小鼠肝细胞原代培养的方法实验器材：二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿、烧杯、镊子、酒精棉、离心管、电动移液器、移液管、细胞计数板、幼鼠、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.125％胰蛋白酶（含0.1%胶原酶）、D-Hanks或者PBS等。
原代培养是从供体中取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。
原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织或细胞培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。
原代培养的组织或者细胞的生物学特性没有发生很大变化，仍具有二倍体遗传物质，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、基因表达测试、细胞分化等实验研究。
原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种成分组成，比较复杂，即使同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。
如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。
因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需要对原代培养的细胞进行短期传代后再进行（需要注意的是有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化）。
一般采用2-5代的细胞进行实验。
当然特殊情况和一些终端分化细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。
原代培养的方法很多，最基本和最常用的为组织块原代培养法和离散细胞原代培养法（消化法）。
组织块原代培养：组织块原代培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织，组织块原代培养法操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。
但由于培养过程中细胞移动受到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。
组织块培养的程序一般为：1.组织块修整：将组织块用平衡缓冲液反复冲洗，然后在灭菌的培养皿中剪碎至碎块的直径小于1mm3。
2.贴壁：将组织块间隔（小块之间的间隔为1cm）放在培养皿中，培养基需要浸没组织块底部但不能使组织块浮起。
小鼠肝脏细胞原代培养
1瓶
RPMI1640培养液 1瓶
废片缸
1
（四）实验步骤
1.75%酒精棉球擦拭超净台，将试验所 需试剂、耗材等置于超净台中紫外照 射30min后，关闭紫外灯打开照明，通 风15min。
2.取一只小鼠置于含乙醚的废片缸中使 其麻醉，脱臼处死，75%酒精中浸泡并 移置于超净工作台内，将小鼠放在无 菌平皿中，用手术剪和镊子撕开腹部 皮肤，再换一套手术剪和镊子剪开腹 膜暴露内脏。
3.取另一无菌平皿，倒入少许PBS置于 一旁备用 4.用镊子取出肝脏置于含有PBS的无菌 平皿内,清洗2次，除去杂物后，用手术 剪将肝脏剪成1mm³小块。
组织块法：
用镊子夹取组织块并将其转移到克氏 瓶底部，组织块之间有一定间隔（5mm 左右），等组织块粘在克氏瓶上不滑动， 将培养瓶翻转180度组织块朝上，加入 2ml含10%胎牛血清DMEM培养液，盖上 瓶盖，做好标记，37℃ 5% CO2培养箱中 静置培养4小时后待组织块完全粘在克氏 瓶上轻轻翻转克氏瓶，使组织块浸入培 养液中，隔天换一次液，观察细胞是否 贴壁。
3.吸取上层清液加入到1.5mlEP管中， 配平，800rpm，10min，离心。离心 后弃上清，沉淀用1mlPBS重悬，吹打 混匀，1000rpm离心10min，弃上清， 加入RPMI1640(10%胎牛血清)1ml重悬， 吸取20μl加入到含等体积0.4%台盼蓝 的1.5mlEP管中，混匀吸取20μl血球计 数板计数。
1.组织块法: 2.消化法:细胞数:
将细胞浓度调整到2*106个/ml， 细胞稀释 倍
细胞生长状态: 培养基颜色: 更换培养基次数:
（六）注意事项
1.工作台面上在实验前要用酒精棉擦， 用品要布局合理。 2.用过的培养瓶、离心管等需及时清洗。 3.实验结束后及时清洗用过的玻璃器材、 收拾台面、倒垃圾。
小鼠原代肝细胞培养
一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法1材料与方法1.1动物2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。
1.2试剂D-hank's液；消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)；消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP；基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）；小牛血清（BS，GIBCO公司提供）；培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。
1.3鼠肝组织块培养1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。
2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分；3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清，4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。
5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。
待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。
1.4鼠肝细胞单层培养动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。
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细胞培养室肝细胞原代培养标准操作规程
实验试剂
培养基：William’s E Medium(GiBCO 12551-032), 谷氨酰胺(GiBco 21051-024-100g)292mg/L，双抗（GiBco 15140-122 penicillin +10,000Units/mL, streptomycin +10,000μg /mL）5mL/500mL, 胰岛素(GiBCO 12585-014 4 mg/mL)8μg/mL, 地塞米松（中国药品生物制品检定所）5mg/L。
D-Hanks’液（CaCl2 0.55g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, Na2HPO4•7H2O 0.06g/L, NaHCO3 0.35g/L, 三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2-7.4, 4℃保存）
0.05%胶原酶Ⅳ溶液(（Sigma C5138-1G） D-Hanks’液溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃
保存）)
PBS预灌流溶液（NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L, KH2PO40.2g/L, Na2HPO4•7H2O 1.56g/L, EDTA 0.1mM, 三蒸水溶解, NaHCO3调pH 7.2-7.4, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存）
鼠尾胶原（GiBCO A10483-01 20mL/ 瓶）（0.05 mg/ mL）用0.02M 的醋酸稀释,临用现配）
0.02M 的醋酸：115μL的醋酸(大于99%)用水稀释至100mL
0.05 mg/ mL-200μL鼠尾胶原（5 mg/ mL）用0.02M的醋酸稀释至20 mL
Overlay(0.25 mg/ mL的Matrigel（BD 356237）(用William’s E Medium稀释，视具体批号而定稀释倍数，临用现配）
Hanks’液（CaCl2 0.14g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, MgCl2•6H2O 0.10g/L, MgSO4.7H2O 0.10g/L, Na2HPO4•7H2O 0.09g/L, NaHCO3 0.35g/L, D-葡萄糖 1.0 g/L，三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2附近，4℃保存）
实验仪器
CO2 恒温培养箱（日本SANYO 公司）；
Sigma高速离心机；
IX-51 型荧光倒置显微镜（日本尼康公司）；
DHL-A电脑恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）；
液相-质谱联用分析系统（LC/MS/MS）由美国Thermo系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、以及Thermo Finnigan LTQ线性离子阱质谱检测器，系统工作软件为XcaLibur（美国）；
Sigma5310离心机；
ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。
实验方法
实验准备
在24孔板底涂布鼠尾胶原（0.05 mg/ mL）300 μL/well，置于室温下成胶1h后吸出多余胶原，细胞悬液种板前用William’ s E Medium培养基洗去表面的酸性物质。
体外灌流
分别取PBS预灌流溶液和0.05%Ⅳ型胶原酶液在水浴中预温敷至37℃。
恒流蠕动泵接三号管，以6mL/min的速度匀速灌注75%酒精，PBS预灌流溶液。
腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠(0.5mL/100g)→仰卧固定，门静脉插入导管，动脉夹固定→剪断下腔静脉腹腔段，经门静脉插管以6mL/min的速度匀速灌注预温孵的PBS预灌流溶液以去除肝内血液及钙离子→当肝脏变苍白、下腔静脉流出液体变清时开始灌注预温的胶原酶液，流速约4mL/min，约6-10min→肝脏颜色变成土黄色、包膜下呈龟背状裂隙、压之凹陷不易恢复时停止灌注→完整摘除肝脏。
超净台内分离
在超净台中揭去被膜→将细胞混悬液用200目尼龙网筛过滤，滤液50g 低速离心3min→沉淀用William’s E Medium离心一次（50g，3min）→接着同法洗涤两次→最后加入William’s E Medium 制成细胞悬液，按1.5×106个/ml的细胞密度种板，每孔400μL，密度为1×106个/cm2，四小时后换William’s E Medium，间隔24小时换William’s E Medium（含0.25mg/mL的Matrigel）500 μL/well，以后每天换一次William’s E Medium(1000μL/well)，至第三天。
细胞计数和存活率判定
吸取50μL稀释悬液转到一EP管中，加入0.4%台盼蓝染液50μL（1:1）并混匀。
在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，在10×物镜下观察。
先计数一个大方格内的死细胞数（蓝染者）和总细胞数，再计数全部4个大方格内的细胞总数，据公式：活细胞率 = 活细胞数/1大方格细胞总数×100%和细胞密度（个/mL）= （4大方格细胞总数/4）×104×稀释倍数，计算活细胞率和细胞密度，随后计算出肝细胞总数（产量）。
肝细胞诱导实验
肝细胞换液（William’s E）至第三天，加入诱导剂（诱导剂用William’s E稀释），每天换液（诱导剂）至第六天，加药前各孔加入37℃的空白Hanks’（PH=7.1～7.3）1mL，置于37℃摇床中，10min后轻轻吸干孔内Hanks’，以期在不破坏其单层膜的基础上除去细胞表面的杂质。
将底物按设定浓度溶解于Hanks’液中，后加入各孔，（24孔板加入200μL/well， 12孔板加入400μL/well）置于37℃培养箱中，120min时迅速吸出药物，同时做空白对照（加入空白Hanks’）。
样品-20℃储存待测。
样品处理方法
取出一定量的样品，加入等体积的含Tid（10μg/m L）的ACN，混合10min沉淀蛋白，离心
（15300rpm,10min）一次，取50μL进板。