小鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察

小鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察

姓名：学号：实验时间：2014.11.11

1.实验目的

1. 掌握线粒体的超活染色原理及方法

2. 观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量和分布

2.实验原理

超活细胞染色也称活体染色，是指对生命有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。

超活染色的目的是显示活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。

活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理病理状态。

活体染色根据染色剂的性质和染色方法的不同，分为：体内活染（注入、固定、堆积）、体外活染（分离、浸染、固定）

体内活染是以胶体状的染料溶液注入动植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内的某些特殊结构里，达到易于识别的目的。

体外活染又称活体染色，它是由活的动植物分离出部分西部或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在某种结构上而显色。

活体染料之所以能固定，堆积在细胞内某些特殊部分，主要是染料的“电化学“特性起重要作用：碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，被染的部分本身也具有阴离子或阳离子，这样他们彼此之间就发生了吸引作用，从而使样品着色。

不是任何染料都可作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性活毒性极小的染料。

活体染色剂选择原则：

对细胞无毒性或毒性极小的染料；具有电化学特性；配成稀淡的溶液来使用（如配成超低浓度Janus Green B1/5000）具有专一性(特异性)；一般是碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂类（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。

本实验常用活体染色剂—詹纳斯绿B

詹纳斯绿B（Janus Green B）是毒性较小的碱性染料，可专一性的对细胞活体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态—蓝绿色）而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）

3.实验材料和用品

小白鼠、Ringer液、Janus Green B

4.实验步骤

1.用断头法处死小鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝组织，选取边缘较薄的肝组织0.5cm3,放入小烧杯中，用Ringer液，冲洗去血污。

2.在干净的凹面载玻片的凹穴中，滴加1/5000Janus Green B,再将肝组织块

移入染液中，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上面部分半露在染液外，这样细胞内的线粒体酶系可充分得到氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即可（一般需染20-30min）

3.吸去染液，用眼科剪将组织块着色部分剪下重置小烧杯中，滴加Ringer溶液0.5ml，用剪刀充分剪碎制造悬液。

4.取上述细胞悬液滴片，加盖玻片，高倍镜下观察。

5.实验结果

Pic1

pic2

Pic1是超活染色后小鼠肝细胞线粒体，pic2是超活染色后小鼠精子。超活染料Janus Green B染色较浅，呈浅蓝绿色。

6.讨论与结论

a.在取小鼠肝细胞的时候，取小拇指1/4大，不要取太大，太大了不宜染色，使染色时间过长。

b.染色时不能让染液完全浸没组织块，因为活细胞需要呼吸，细胞呼吸需要氧气。

c.杀死小鼠后，应当把血排尽，否则观察肝细胞时红细胞比较多，影响观察。

d.在观察精子时，视野中精子很分散，并且都没有动了，可能是染色时间过长，虽然是活体染色，但是很可能染液还是有毒性，只不过毒性很小，染色时间过长对细胞不好，可能使细胞活性降低。精子分散可能是ringer液加得太多了使精液浓度偏低，导致精子分散。