一种简单分离成年小鼠肝细胞的方法

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目 前! 国内外鼠肝细胞培养多采用大鼠! 利用胶原酶灌 流 分 离! 但 灌 流 法 需 特 殊 装 置! 操 作 难 度 大! 胶原酶价格昂 故应用受到限制 贵!
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M 细胞浓度为 # 个N 接 种 于 另 一 培 养 瓶 内! 补充培 ’ 6 L# 4 ! DE
中! 分别 4 计数活细胞! = < 1密闭培养! & 0 & # 5小 时 取 培 养 液 ! 5 0 &9 # 0 ’ M FP M ’ M 0 : 7&9 < F ’ 0 0P X的 贴 壁 率 分 别 为 4 A ’ = = : 7& 9 A M ’ A = PA ’ M A : 7& 9 A F ’ 0 M P# ’ # 4 : 7% 5 ’ 0 传代培养 成 年 鼠 肝 细 胞 增 殖 较 慢! 需培养 F K# 4天 方 可 传 代%传 代 后 肝 细 胞 生 长 速 度 更 为 缓 慢! 5 4天 方 可 长 满! 继续 传 代 ! 第二次传代后细胞贴壁较少! 并逐渐出现聚缩 死亡等现象 % 成团 ! = 讨 论 故 目前国 内 外 普 遍 认 为 胰 蛋 白 酶 易 对 肝 细 胞 造 成 损 伤 !
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解! 过滤除菌! 调; 分装! *= 4 1保存2 >培养液8 ’ 5 ! ?@ ? +< 培养基 A 溶解! 分装! 高压灭菌! 临用时 ’ 0 C三蒸水 # 4 4 4 B DE 4 C小牛血清 5 4 C= 7谷 氨 酰 胺 # ! 6 7G, ?@ ?F DE DE DE +H ’ 5 % I J=调 ; + 值至 < # ’ 5 动物 昆明种成年小鼠 ! 体重 # 雌雄均可 ! 由湖 F K5 5 ! B 北医科大学动物实验中心提供 % # ’ = 肝细胞分离培养 小鼠断头放血! 无菌分离肝脏! 置) = 液中灌注冲洗肝脏至灰白色! 将肝剪成 # *+, . / DD 左 右 的组织块! 用) 液冲洗数次! 除去血细胞! 加入不同 *+, . / 浓度的胰蛋白酶 = 加培养液终止消化 % < 1 温孵消化 # 6分钟 ! 将经过消化的肝组织块贴壁于 = 培 养 瓶 中! 加少许培养 4 DE 液! 静 置 小 时 小 心 吸 取 悬 浮 液 取 计 数! 调整 = < 1 0 ! ! 4 ’ 6 DE
一种简单分离 e 传代培养成年小鼠肝细胞的方法
广西医科大学附属第一医院 A 南宁 武汉大学医学院 A 武汉市
摘要 g 目的 f
? T > > @ ^ B 黄杰安 E T > > ^ " B 丁 虹 曹
唐国都 歌
寻找肝细胞分离e 传代培养更简单方便的方法!方法
应用不同胰酶浓度e 不同消化时间消化成年小鼠
5 $ 常采用价格昂贵的胶原酶 " %罗树宏等认为胰蛋白酶造成肝 = $ 细胞损伤的原因是酶浓度太高! 消化时 间 过 长 所 致" %本研
计 算 贴 壁 率 %# 结果 4 5小 时 肝 细 胞 即 可 基 本 贴 壁 ! & 0 & F & # 5 &
养液至 0 放置于 I 每两天换 ! < 1密闭培 养! DE J5 培 养 箱 内 = 液 #次并观察细胞生长情况 % # ’ 0 传代培养 肝细胞长满瓶底 ! 即可传代 % 用4 ’ 5 6 7 胰蛋 白酶消化 ! 在倒置显微镜下观察 ! 细胞回缩即终止消化 % 加入 培养液轻轻吹打培 养 细 胞 成 细 胞 悬 液 ! 计数! 每瓶接种 5 5 DE M 个细胞继续培养 L# 4 % 5 结 影响 果 5 ’ # 胰蛋 白 酶 浓 度 及 消 化 时 间 对 肝 细 胞 产 量 及 细 胞 活 率 的 小鼠随机分组! 每 组 6只 ! 无菌分离肝脏! 观察不同浓 度胰蛋白酶 及 不 同 消 化 时 间 对 细 胞 产 量 及 活 率 的 影 响 ! 结果 显示! 细胞产量 较 高! 细胞活 4 ’ # 6 7胰蛋白酶及消化 # 6 ! DO 率不低于 A 结果见表 # 4 ’ 4 7! % 表 # 不同胰酶浓度 & 消化时间对细胞产量及活率的影响
M 新的培养瓶中9 个: 培养! 计数活 # ’ 6 L# 4 0 F小 时 胰 酶 消 化 !
%为此我们设计了一 种 简 单 的 用 胰 蛋
细 胞! 计算细胞倍增 Q 值8 : ! )9 ; R ; S E , T O R -U S V E O B Q )W 9 # N 4 ’ M A = 9 < 1培 养 GN G4: G4W 原 始 接 种 的 活 细 胞 数 ! GW = 洗去组织块和 0 F小时的活细胞数 : 3 原培养瓶 用 ) *+, . / 细胞碎片! 加培养液 0 继续培养! 0 F小 时 后 光 镜 下 观 察 细 DE 胞生长情况 % 结果可见! 悬浮液多为肝实质细胞! 肝细胞呈多边形! 核 清晰 ! 0 F小时 Q ’ F M P4 ’ 4 6 % 原培养瓶贴壁细胞多为 ) 值为 4 细胞形态不规则 ! 有许多丝状伪足 ! 枯否细胞 ! 0 F小时细胞已 融合成片 % 5 ’ = 肝细 胞 贴 壁 时 间 的 观 察 肝细胞悬浮液接种于培养瓶
白 酶 消 化& 组织块贴壁法对昆明成年小鼠肝细胞进行分离& 培养& 传代获得成功%此法操作简便! 不需要特殊装置! 酶耗 费少 ! 细胞采集量可满足一般实验要求 ! 现介绍如下 % # 材料与方法 # ’ # 试剂 液高压灭菌! () *+, 0 1保存2 34 ’ 5 6 7胰 . / 蛋白酶 8 胰蛋白酶9 上 海 化 学 试 剂 供 应 站: 用 )* +, . /溶
肝组织后进行组织块培养 ) 观察细胞的贴壁率 e 产量及活 力 ! 结 果 胰 蛋 白 酶 分 离 成 年 小 鼠 肝 细 胞 ) 于 (] 含@ > h小牛血 (A 培 养 液 中) 生 长 情 况 良 好) 并 已 传 至 第 二 代!胰 酶 浓 度 为 > 消化时间 清B T ^ i密 闭 培 养) " @小 时 左 右 即 可 完 全 贴 壁 ) 6 " ? h)
胰酶浓度 9 7: 4 ’ 4 6 4 ’ # 4 4 ’ # 6 4 ’ 5 4 4 ’ 5 6 消化时间 9 : DO # 6 # 6 # 6 # 6 # 6 细胞产量 <个 N 9 L# 4 # 4 : B 4 ’ = = P4 ’ 5 # 4 ’ 0 < P4 ’ = # 4 ’ F 0 P4 ’ # F # ’ 4 5 P4 ’ # 6 # ’ 5 F P4 ’ = # 活细胞产量 <个 N 9 L# 4 # 4 : B 4 ’ = # P4 ’ # F 4 ’ = F P4 ’ 5 A 4 ’ < M P4 ’ # A 4 ’ F < P4 ’ # < 4 ’ A 0 P4 ’ 5 F 细胞活率 9 7: A 5 ’ M < P5 ’ # # A 4 ’ 5 = P< ’ F # A 4 ’ M M P6 ’ < # F 0 ’ < F P0 ’ 5 5 < = ’ 0 M PF ’ A 0
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^ 细胞产量及活率较高 ) 每" 细胞活力为A 贴壁生长 E " ? ) > 6 ; E j> 6 > ; k" > ) : > 6 < < j? 6 ^ " B h) ;小 时 细 胞 Q+ & ’体重细胞产量为 >
组织块贴壁法是成年小鼠肝细胞分离 e 培养传代的简便方法 ) 不需要特殊装 倍增 I 6 ; < j> 6 > ? ! 结论 胰蛋白酶消化 e . 值为 > 置) 酶耗费少 ) 细胞采集可满足一般实验要求 ! 关键词 g 小鼠 l 肝细胞 l 培养 f 中图分类号 g M 文献标识码 g Y f 文章编号 g f E E < 6 ; f " > > T 3: ? @ A @ > > " B > E 3> E " ^ 3> @