一种简单分离成年小鼠肝细胞的方法
小鼠肝细胞的分离与原代培养
Ｋｅ ｒ ｓ ｐ ｉ ｒ ｅ ｌｃ ｔ ｒ ｙ ｗｏ ｄ ｒｍａ ｙ ｃ ｌ ｕｌｕ ｅ；ｈ ｐａ ｏ ｙ ｅ ｅ ｔ ｃ ｔ ｓ；ｃ ｌ ｉｏｌ ｔｏ ｅ １ ｓ ａ ｉ ｎ；ｃ ｌ ｃ ｌｕｒ ｅ１ ｕｔ ｅ
肝 脏 作 为 机体 重要 的代 谢 器 官 ， 多 种 生 理 病 理 过 程 中 在 发 挥 重 要 作 用 ， 细 胞 行 使 了肝 脏 主 要 的功 能 ， 合 成 凝 血 肝 如 因子 和 血 清 白蛋 白 及 多 种 消 化 酶 、 与 内 分 泌 调 节 、 谢 多 参 代
态 变 化 进行 观察 ， 进 一 步 进 行 相 关研 究奠 定 基 础 。 为
赖 静 杨天 燕 韦锦斌 。 王乃平
南 宁 ５０ ０ ） ３ ０ １
（ 西 中医 学 院 药 学 院 广
摘 要 目的 ： 求 一 种 简 易 、 济 的小 鼠原 代 肝 细 胞 的 分 离 与 培 养 方 法 。方 法 ： 用 非 灌 注 法 分 离 小 鼠 肝 脏 ， 用 ０ ２ Ｉ 探 经 采 利 ． Ｖ型胶 原 酶 对 肝脏 消 化来 获 取肝 细胞 ， Ｄ 以 ＭＥ 培 养 基 对 肝 细 胞 进 行 单 层 培 养 。 结 果 ： 较 成 功 地 进 行 了 原 代 肝 细 胞 培 养 ， 进 行 Ｍ 比 并
４ ８ｇ Ｉ ． ／ ＨＥＰ ＥＳ， 胎 牛 血 清 （ 季 青 ） ５ ｍＬ Ｌ Ｌ 谷 氨 酰 ５ 四 ， ／
种 营 养 物 质 、 存 葡 萄 糖 、 除 毒 素 等 ， 代 培 养 的 肝 细 胞 广 储 清 原 泛 用 于 药 理 学 、 理 学 、 疫 学 、 子 生 物 学 、 胞 生 物 学 等 毒 免 分 细 相 关 的 研 究 ， 其 在 药 物 研 发 方 面 ， 用 原 代 肝 细 胞 可 较 经 尤 使 济 和 迅 速 地 阐 明 药 物对 药物 代 谢 酶 的 诱 导 或 抑 制 作 用 ， 而 从 避 免 采 用 大 量 动 物 进行 药理 效 应 筛 选 。但 是 ， 于 原 代 肝 细 由 胞 增 殖 能 力 差 ， 易 长 时 间 保 存 或 长 期 培 养 及 其 生 物 学性 状 不
小鼠肝脏窦状内皮细胞分离及培养的一种新方法
小鼠肝脏窦状内皮细胞分离及培养的一种新方法小鼠肝脏窦状内皮细胞是肝脏微环境中的一种重要细胞类型，能够分泌多种生物活性物质，对肝脏功能的维持和调控起着重要作用。
为了研究小鼠肝脏窦状内皮细胞的生理功能以及相关疾病的发生发展机制，研究人员提出并优化了一种新的肝脏窦状内皮细胞的分离及培养方法。
该方法主要包括以下几个步骤：1.小鼠肝脏收集：选择4-6周龄的健康小鼠，进行麻醉后，用消毒好的手术刀进行腹部切口，取出肝脏后放入含有PBS缓冲液的培养皿中。
2. 肝脏组织分离：将肝脏分成小块，用显微镊子和剪刀细致地分离组织。
将分离好的肝脏组织放入50 ml离心管中。
3. 细胞悬浮：将分离好的肝脏组织用离心管尖端碾碎，加入含有PBS缓冲液的培养皿中，并用5 ml移液器不断悬浮，使细胞充分分散。
4.细胞预培养：将悬浮的细胞转移到一个新的含有PBS缓冲液的培养皿中，在37℃的恒温培养箱中进行预培养，以去除不能黏附的细胞。
5.分离窦状内皮细胞：将预培养的细胞转移到含有相应酶切剂的培养液中，如胰酶或胰酶/利巴韦林混合液，用37℃恒温培养箱恒温消化。
消化时间根据实验需要进行调整，通常为30-60分钟。
6. 细胞收获：将消化后的细胞和消化液转移到含有培养基的离心管中，用离心机进行离心，将上清液抽出。
重悬细胞并加入适量培养基，细胞密度通常为2-4×10^5个/ml。
7.细胞培养：将收获的窦状内皮细胞转移到预先涂覆了基质（如胶原、明胶、陶瓷片等）的培养皿中，加入适量的培养基，并将培养皿放回恒温培养箱中进行培养。
培养基的选择和配方可以根据实验需要进行调整。
8. 细胞鉴定：通过免疫荧光染色或免疫组化方法，使用窦状内皮细胞特异性标记物（如CD31、VE-Cadherin等）对分离的细胞进行鉴定，确认其为窦状内皮细胞。
通过这种新的小鼠肝脏窦状内皮细胞分离及培养方法，可以获得纯度较高的窦状内皮细胞，为后续研究窦状内皮细胞的生理功能和相关疾病的发生发展机制提供了可靠的实验材料。
一种易操作的小鼠肝细胞的分离及培养方法
一种易操作的小鼠肝细胞的分离及培养方法鵬臟臟。
永玲郑江第三军医大学第一附属医院中心实验室摘要：目的在传统肝细胞提取方法的棊础上，优化一种易操作、快速实用获取小鼠肝细胞的方法，为从事肝脏功能相关研宂人员提供改良的实验方法参考。
方法以肝脏分离液逆向灌注小鼠肝脏后，剪碎，肝脏酶消化后密度梯度离心分离肝细胞，转入培养基培养。
采用台盼蓝染色计算细胞活力，流式细胞检测技术计算纯度，倒置显微镜观察细胞形态。
结果获得较高纯度和活力的肝细胞，具备肝细胞的典型形态特征。
结论通过逆向灌注，降低/灌注的难度，同时获得较高纯度、较高活力的肝细胞，经多次实验证明该方法确实是一种易操作、高效适用的肝细胞提取方法。
关键词：C57BL/6J小鼠;肝细胞;逆向灌注;活力;纯度;作者简介：范仕郡（1983-）,男，助理研究员，研究方向:脓毒症的发病机制与拮抗措施研宄。
E-mail:574472439@qq. com作者简介：郑江（1961-）,男，研究员，研究方向:脓毒症的发病机制与拮抗措施研究。
E-mail:收稿日期：2017-03-20基金：国家自然科学基金项FI （编号:81372089）A simplified method for isolation and culture of primary mouse hepatocytesFAN Shi-jun LIU Xin YANG Dong ZHU Yuan-feng LU Yong-ling ZHENG JiangMedical Research Center, First Affiliated Hospital， Third Military Medical University; Abstract：Objective To simplify and optimize the method for isolation and culture of primary mouse hepatocytes on the basis of conventional extraction method, and to provide a reference for related research. Methods Mouse liver was reversely perfused with the isolation solution ( i. e., through the vena cava inferior in, and portal vein out)，cut into small pieces and digested with enzymes. Then the hepatocytes were isolated by density gradient centrifugation and transferred into culture medium. The cell viability was detected by trypan blue staining. The purity of the hepatocytes was analyzed by flow cytometry and the cell morphology was observed with an inverted microscope. Results The hepatocytes obtained by this improved method showed high viability and purity, with typical characteristics of cell morphology. Conclusions The liver perfusion is facilitated by reversed perfusion, and the isolated hepatocytes are with high viability and purity confirmed by many times of experiments. This optimized procedure is an easy and efficient method for isolation of primary mouse hepatocytes.Keyword：C57BL/6J mice; Hepatocytes; Reversed perfusion; Viability; Purity; Received： 2017-03-20肝脏是人体最大的实质器官和重要的排毒器官。
小鼠原代肝细胞分离方法
小鼠原代肝细胞分离方法引言：小鼠原代肝细胞分离是研究肝脏生理和病理过程中常用的实验手段。
本文将介绍一种常用的小鼠原代肝细胞分离方法，旨在为科研工作者提供参考和指导。
材料与仪器：- 小鼠- 75%乙醇- 磷酸盐缓冲盐水（PBS）- 培养基- 消化液- 离心管- 离心机- 显微镜- 细胞计数板方法：1. 准备工作a. 确保实验室环境干净，无细菌污染。
b. 消毒所需的仪器和材料，如离心管、培养皿等。
c. 准备所需的培养基和消化液，并将其预先加热至37℃。
2. 小鼠准备a. 使用75%乙醇对小鼠进行消毒，并将小鼠放置在消毒好的工作台上。
b. 使用显微镜观察小鼠的外部特征，确保小鼠健康无异常。
3. 小鼠肝脏采集a. 将小鼠固定在手术台上，用消毒的剪刀剪开腹腔。
b. 小心地将腹腔内的肝脏暴露出来，并使用消毒的注射器注入适量的PBS冲洗肝脏表面，以去除血液。
4. 肝脏消化a. 将肝脏放入含有预先加热至37℃的消化液的培养皿中。
b. 使用剪刀或刀片将肝脏切碎成小块，确保充分暴露细胞表面。
c. 将培养皿放入37℃恒温培养箱中，进行消化反应。
消化时间根据实验需要而定，通常为30-60分钟。
5. 细胞分离a. 用吸管轻轻吸取消化液中的细胞，转移到新的离心管中。
b. 将离心管放入离心机中，以1000rpm的速度离心5分钟，以沉淀细胞。
c. 倒掉上清液，保留细胞沉淀。
d. 加入适量的培养基，轻轻悬浮细胞，并进行细胞计数。
6. 细胞培养a. 将细胞悬浮液均匀地分配到预先消毒好的培养皿中。
b. 在37℃恒温培养箱中，以5% CO2的条件下培养细胞。
c. 定期观察细胞的形态和增长情况，并根据需要进行后续实验。
讨论：小鼠原代肝细胞分离是一项常见的实验技术，用于研究肝脏生理和病理过程。
本文介绍的方法是一种经典的分离方法，通过肝脏消化和离心沉淀的步骤，成功地获得了小鼠原代肝细胞。
该方法具有操作简单、高效可靠的特点，适用于多种实验需求。
小鼠肝脏提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 熟悉小鼠肝脏解剖方法。
2. 掌握小鼠肝脏提取和保存方法。
3. 学习组织样品的制备和储存技术。
二、实验原理肝脏是人体重要的代谢器官，具有合成、储存、解毒等多种功能。
本实验通过解剖小鼠，提取肝脏组织，旨在为后续的实验研究提供材料。
三、实验材料与仪器1. 实验动物：健康成年小鼠一只。
2. 仪器：解剖剪、解剖针、手术刀、剪刀、镊子、培养皿、酒精棉球、生理盐水、福尔马林固定液、冰盒、解剖显微镜等。
四、实验步骤1. 实验动物处死：用酒精棉球擦拭小鼠，使其昏迷，然后迅速用剪刀剪断小鼠颈部，使小鼠死亡。
2. 解剖：将小鼠放入解剖盘中，用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹腔。
3. 提取肝脏：用解剖剪剪开肝脏周围的结缔组织，用镊子将肝脏轻轻夹出，放入培养皿中。
4. 清洗：用生理盐水冲洗肝脏表面，去除杂质。
5. 固定：将肝脏放入装有福尔马林固定液的培养皿中，浸泡固定。
6. 保存：将固定好的肝脏取出，放入装有酒精的容器中，密封保存。
五、实验结果与分析1. 成功解剖小鼠并提取肝脏组织。
2. 肝脏表面有明显的红褐色，质地柔软，易于夹取。
3. 肝脏表面无明显杂质，清洗过程中保持肝脏组织完整。
六、实验讨论1. 实验过程中，解剖操作要轻柔，避免损伤肝脏组织。
2. 肝脏固定过程中，福尔马林固定液浓度不宜过高，以免影响后续实验结果。
3. 实验动物处死过程中，要确保小鼠死亡，避免实验过程中出现意外。
七、实验结论本实验成功解剖小鼠并提取肝脏组织，为后续实验研究提供了可靠的组织样品。
在实验过程中，掌握了组织样品的制备和储存技术，为今后相关实验奠定了基础。
八、实验改进1. 在解剖过程中，可使用解剖显微镜观察肝脏结构，提高解剖效率。
2. 在肝脏固定过程中，可选用其他固定液，如4%多聚甲醛，以提高固定效果。
3. 在实验动物选择上，可根据实验需求，选用不同品种、年龄的小鼠。
第2篇一、实验目的1. 学习小鼠肝脏的解剖方法。
2. 掌握肝脏细胞的提取方法。
小鼠原代肝细胞分离培养
小鼠原代肝细胞分离培养准备材料1.能够提供灌注速度为1-10mL/分钟的蠕动泵（我们用的是保定兰格的蠕动泵，某宝有售）；2.能够容纳50-100mL溶液的无菌容器；3.凹槽（可供放置操作台面并提供引流槽，我们用的是搪瓷实验盘+泡沫板的组合）；4.可维持37℃的水浴设备（即恒温水浴锅）；5.无菌100mL广口玻璃瓶；6.无菌50mL锥形管；7.一次性或可重复使用的70微米不锈钢过滤器（就是不锈钢滤网，查阅资料提示这里选用的滤网规格大概为200目左右）；8.细胞培养皿（直径10cm，即常说的大皿）；9.无菌器械，至少要有一把剪刀和两对细尖镊子；10.70%-75%酒精和去污剂（去污剂我们没有用过，只要小鼠备皮充分一般影响不大），均盛装于喷雾瓶中（碘剂可选）；11.麻醉剂，注射或吸入剂型均可（我们选用水合氯醛或戊巴比妥）；12.Vacutainer牌蝶型插管（我们选用BD公司的套管针）; 推荐小鼠体重：20g-40g（我们的建议是25g以上）；13.口罩；14. 每只小鼠2只吸水台垫（我们是用大量吸水纸代替吸水台垫铺在手术操作平台上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；15.动物操作台；16.胶带。
分离试剂1.前灌液：Hank's缓冲盐溶液（HBSS），使用不含钙镁离子、含0.5mM EGTA 的1x工作液；共需要大约 60ml-70ml；使用前预温至37℃；2.后灌液：IV型胶原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mM HEPES（低糖DMEM 和IV型胶原酶是必须的，HEPES缓冲液等等可以选择性加入）；共需要90ml。
注意确保所使用的DMEM含钙；使用前预温至37℃；3.分散液：IV型胶原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4℃预冷；4.IV型胶原酶;在消化液和分散液中，胶原酶的浓度至少要达到100胶原酶消化单位/ml（100CDU/ml）；（我们使用的是购自Gibco公司的IV型胶原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝细胞）；5.蒸馏水。
一种简易小鼠原代肝细胞分离方法
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｃ ｈ ｅ ｎ ｇ ｄ ｕ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ （ Ｎ ａ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ）
成 都 大 学 学 报（ 自然 科 学 版）
Ｖ＿ ｏ １ ． ３ ５ Ｎ Ｏ ． ４
方法适用于大鼠以及较大动物肝细胞 的分离 ． 近年 来， 在Ｓ ｅ ｇ ｌ ｅ ｎ 两步原位灌注法基础上发展而来的适 用于小 鼠肝 细胞 分 离 方 法 有 门静 脉 灌 流 Ｌ ２ ］ 、 下 腔 静 脉灌流＿ ３ 』 、 心脏逆行灌 流＿ ４ Ｊ ． 在实验 中发现， 因小 鼠
门静 脉血 管细 小 ， 壁薄 易被 输 液 针 扎 破而 导 致 灌 流 失败 或灌 注不 均匀 较 难 穿 刺并 置 管 成 功 ， 但 小 鼠 的
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 动 物
原代肝细胞 ， 小鼠原代肝细胞更经济且易获取 ． 肝细
实 验所 用动 物为 ： Ｋ Ｍ小 鼠 ４ ０只 （ ２ ２ ±２ ｇ ， 雌雄 不限） ， 由成都达硕实验动物有限公司提供 ， 饲养 于 Ｓ Ｐ Ｆ系统 中 ．
１ ． ２ 试 剂
胞 的经典分 离方法是 Ｓ ｅ ｇ ｌ ｅ ｎ 两步原位灌注法＿ １ Ｊ ， 该
Ｄｅ ｃ ．２０ｌ ６
文章编号： １ ０ ０ ４—５ ４ ２ ２ （ ２ ０ ｌ ６ ） ０ ４ —０ ３ ２ ８ —０ ３
一
种 简 易 小 鼠原 代肝 细胞 分 离 方 法
周 萍 ， 樊 静， 梁 鞲
６ １ ０ ０ ５ ２ ）
（ 成都 大学 四川抗 菌素 工业研 究所，四川 成都 摘
第 ４期
一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法与流程
一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法与流程小鼠肝脏是重要的免疫细胞来源地之一，其免疫细胞种类繁多，包括各类淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。
因此，高效获取小鼠肝脏中的全免疫细胞对于免疫学研究具有重要意义。
下面将介绍一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法与流程。
一、试验动物的选取首先需要选择健康的小鼠作为实验动物。
通常可以选择8-12周龄、体重20-25g的小鼠进行实验。
此外，实验前需要确保小鼠处于良好的生理状态，无任何疾病或感染。
二、材料准备1.小鼠静脉采血脉管采血针及离心管2.无菌手术器械3.生理盐水4.乙醚5. 70%乙醇6.无菌培养皿和离心管三、操作步骤1.术前准备将实验所需材料进行无菌处理，保证操作环境无菌。
2.麻醉利用乙醚对小鼠进行麻醉，待小鼠完全麻醉后，进行下一步操作。
3.打开腹腔将小鼠放在无菌操作台上，采用无菌手术器械进行皮肤消毒和切开小鼠腹腔。
4.采集肝脏在麻醉状态下，将小鼠的肝脏从腹腔中取出放入无菌盛皿中。
5.分离肝脏细胞将取出的小鼠肝脏放入含有生理盐水的离心管中，用离心机进行离心，将肝脏中的细胞分离出来。
6.细胞培养取出离心管中的肝脏细胞，放入无菌培养皿中，加入适量的培养基，进行培养。
7.细胞鉴定通过显微镜检查培养后的细胞，进行鉴定和分析。
通过以上步骤，就可以高效获取小鼠肝脏中的全免疫细胞。
这种方法不仅简单易行，而且获取到的免疫细胞种类繁多，可用于免疫学研究中的各种实验。
在操作过程中，需要严格遵守无菌操作规范，确保实验结果的准确性和可靠性。
同时，也需要尽量减少对小鼠的伤害和痛苦，符合动物实验伦理要求。
希望这种方法能对相关研究工作提供帮助，推动免疫学领域的进步。
动物细胞工程实验
实验一机械法分离培养动物细胞及计数一.实验目的1.掌握机械法分离培养动物细胞的原理及方法2.掌握细胞计数的方法二.实验原理在机体中，器官通常由几种组织构成，组织又由细胞通过紧密连接锚定连接、通讯连接构成组织。
采用机械法破坏细胞间的连接，能获得单个细胞。
本实验采用剪碎小白鼠肝组织的方法获取单个肝细胞，该方法简单易行。
三.实验材料1.动物：小白鼠（成年）2.试剂：PBS缓冲液，RPMI-1640培养液3.器材：手术器械、试管、滤网、离心管、离心机、显微镜等；四.实验方法1.无菌获取肝组织取成年小白鼠一只，断颈处死，腹部向上置于解剖盘中，碘酒消毒1-2次，75%酒精洗碘。
剪开腹壁，暴露肝脏组织，换手术器材，剪取0.3mm3肝脏组织块，置于培养皿中。
2.获取细胞剔除脂肪组织，加PBS缓冲液1ml，反复冲洗2-3次，剪碎组织块至1mm3，加RPMI-1640培养液，滤网过滤至离心管。
平衡、离心（1000rpm,5min），弃上清，加培养液1ml，吹打均匀，成细胞悬液。
3.细胞计数取细胞计数板一个，盖上盖玻片，去细胞悬液，沿盖玻片便于滴1滴，显微镜下计细胞数，原则：计上不计下，计左不计右4.细胞培养加细胞培养液，稀释至1X105个/ml，移入培养皿，37℃，CO25%培养箱中培养四.实验结果实验二酶消化法分离培养小鼠胎儿成纤维细胞一.实验目的掌握消化分离培养小鼠胎儿成纤维细胞的基本方法二.实验原理胰蛋白酶是一种消化酶，它通过作用于精氨酸或赖氨酸之剑的肽键，能破坏细胞间的连接，进而从组织块中分离获得单个细胞；细胞之间是通过CAM相连，而很多粘性分子只有在+2价金属离子，如Ca2+,Mg2+的存在下，才能行使这种功能，在胰蛋白酶中加EDTA的作用是熬合这些二价例子，使细胞被消成单细胞状态；本实验就是采用胰蛋白酶和EDTA消化小鼠胎儿肌肉细胞获得单个细胞。
三.实验器材1.试剂：10%犊牛血清（NBS）的1640培养液，0.25%胰蛋白酶，0.04%EDTA，PBS2.器械：离心机，滴管，普通天平，手术器械，血球计数板，离心管等3.材料：怀孕13-17天母鼠四.实验步骤1.取材：断颈处死怀孕小鼠，腹部向上置于解剖盘中，碘酒消毒1-2次，75%酒精脱碘，剪开腹壁，更换手术器械，取胎儿置培养皿中2.剔除和清洗：从子宫中挤出胎儿，剪去胎儿头、尾、四肢、内脏和脊柱后，反复用PBS冲洗3-4次3.剪碎：将冲洗干净后的胎儿组织块置另一培养皿中，剪碎至1mm3（剪15-20min）4.消化：加入4ml0.25%胰蛋白酶消化液，37℃消化5-7min5.终止：加入4ml含10%NBS的1640培养液终止消化6.收集细胞：离心用100目滤纱将细胞悬液过滤至离心管中，平衡离心（1000rpm,5min）7.制备细胞悬液：弃上清，加1ml1640培养液，吹打成细胞悬液8.细胞形态观察：取载玻片一张，滴细胞悬液一滴，盖上盖玻片，显微镜下观察9.细胞计数：按上一实验介绍方法计数10.培养细胞：将稀释至1X105个/ml细胞悬液加入培养皿中，置于5%CO2，37℃，75%湿度培养箱中培养实验三牛镜子细胞冷冻与活率检验一.实验目的1.掌握细胞冷冻解冻原理及方法2.掌握细胞活率检验原理及方法二.实验原理细胞培养液中加冷冻保护剂，并通过一定的冷冻程序冷冻细胞，一方面使细胞内形成的结晶体积较少，减少对细胞的机械性损坏；另一方面缓解细胞内因结晶引起的局部高渗对细胞的伤害。
小鼠原代肝细胞实验报告
一、实验目的1. 掌握小鼠原代肝细胞的分离和培养方法；2. 了解肝细胞在体外培养过程中的生物学特性；3. 探讨肝细胞培养条件对细胞生长和功能的影响。
二、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠（体重20-25g）；2. 培养基：RPMI 1640培养基（含10%新生牛血清、1%双抗、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺）；3. 试剂：0.25%胰蛋白酶、0.2%胶原酶、台盼蓝染色液；4. 仪器：超净工作台、倒置显微镜、离心机、培养箱等。
三、实验方法1. 小鼠原代肝细胞的分离（1）处死小鼠，取出肝脏；（2）将肝脏放入含有RPMI 1640培养基的培养皿中，用剪刀剪成1mm³左右的小块；（3）加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化10min；（4）加入0.2%胶原酶，37℃水浴消化30min；（5）消化过程中每隔5min轻轻摇动培养皿，使肝细胞充分释放；（6）消化结束后，将消化液过滤，收集肝细胞悬液；（7）用RPMI 1640培养基洗涤肝细胞悬液2次，去除未消化的组织碎片；（8）将肝细胞悬液离心（1000r/min，5min），弃去上清液；（9）用RPMI 1640培养基重悬肝细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。
2. 肝细胞培养（1）将肝细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养；（2）每隔2-3天更换新鲜培养基；（3）观察肝细胞的生长情况，记录细胞贴壁、伸长、伪足形成等过程；（4）利用台盼蓝染色法检测细胞存活率；（5）观察肝细胞在培养过程中的形态学变化。
3. 肝细胞功能检测（1）收集培养24h后的肝细胞，用RPMI 1640培养基洗涤2次；（2）加入0.5%台酚蓝染液，37℃水浴染色30min；（3）用RPMI 1640培养基洗涤细胞，去除未结合的染料；（4）用酶标仪检测吸光度（A）值，计算肝细胞对台酚蓝的摄取量。
四、实验结果1. 肝细胞分离与培养（1）分离得到的肝细胞形态为圆形、椭圆形或不规则形，细胞核清晰可见；（2）细胞存活率约为64.1%；（3）细胞在培养过程中呈典型的上皮样细胞形态，胞浆内有空泡和脂滴，相邻细胞伸长的伪足相互连接。
小鼠肝原代细胞分离
小鼠肝原代细胞分离(Hong Tang Lab_ZC_20110709) 准备: D-Hanks, Hanks, Percoll, PBS, 1640培养基（10% FBS, 1% P/S）, William E培养基（10% FBS, 1% P/S），胶原酶IV, 麻醉剂, 无菌手术器械，10cm培养板，15mL, 50mL 离心管, 70um滤网，20mL注射器，头皮针，小鼠固定架，移液器，70%酒精操作流程：a.37o C预热D-hanks(不含钙镁离子，补加5mM EDTA)及Hanks(含0.025% 胶原酶IV)溶液；b.麻醉小鼠，用75%酒精进行体表消毒；c.将小鼠四肢固定，打开腹腔，从下腔静脉进针，剪开肝门静脉，用预热的D-Hanks溶液进行灌注；（打开腹腔后，向上翻开肠道及左叶肝脏，即能很清晰暴露肝门静脉和下腔静脉。
进针后，先缓推液体，确认液体流入血管，再剪开肝门静脉，低速均匀进行灌注，约20mL/10min, 以灌干净血液为准）d.换20mL含0.025%胶原酶IV的Hanks溶液进行灌注，完成后原位消化3-5min;（消化好的肝脏表现为按压后，回弹变慢）e.取下肝脏，放入加入10mL预冷1640培养基的10cm皿中，用镊子或注射器头敲碎肝组织; （轻柔）f.滤网过滤，用适量培养基清洗残余组织块，控制总体积约30mL；g.50g离心3min @ 4o C, 上清为非实质细胞，沉淀主要为实质细胞；h.（可选）用20mL预冷35% percoll（13mL 1640培养基+6.3mL Percoll+0.7mL 10XPBS）重悬沉淀，1500rpm离心8min@4 o C。
i.吸去上清，用10mL培养基重悬沉淀，800 rpm离心5min。
重复一次；j.计数，将细胞稀释至2*105/mL铺板。
（一般一个小鼠肝脏能分得5-10*107实质细胞）k.3小时或隔夜后，吸掉培养上清，去除未贴壁细胞，换用William E培养基培养。
小鼠原代肝细胞的分离与培养
大黄和尿毒清对大 鼠肾组织抗氧化应激作 用的比较研 究▲
梁晓静 廖 蕴华 朱 荃 何 宝
（ 广西医科大学 ， 南宁市 ５０ ２ ；广西医科大学第一附属医院肾内科 ， ３０ １ 南宁市 ５ ０２ ； ３０ １
澳门科技大学 ， 门 ０ ８３ 广州康 臣药业肾病研究中心 ， 澳 ０５ ； 广州市 ５０ ３ ） １５ ０
【 ｅ ｏｄ 】 Ｃ ｌ ｒ ｏ ｐ ｍ ￣ｃｌ ；ｅａ ｃｔ ；ｅ ｏ ｔｎ Ｃ ｌＣ ｌ ｒ Ｋ ｙｗ ｒｓ ｕｔ ｅ ｆ ｒ ａ ｅ ｓＨ ｐｔ ｙ ｓＣ ｌＩ ｌ ｉ ；ｅ ｕ ｕｅ ｕ ｉ ｌ ｏ ｅ ｌｓ ａｏ ｌ ｔ
肝 脏作 为机 体 重要 的代 谢 器 官 ， 多 种 生理 病 理 过 程 在 中发挥 重要 作用 。肝 细 胞 行 使 了肝 脏 主 要 的 功能 ， 合 成 如 动物 实验 中心提 供 ） 。 １２ 主要试 剂 完全 Ｄ Ｅ ． Ｍ Ｍ培养基 ：． ｇＬ ３． ｍ ｌＬ ２８ ／ （３３ ｏ ） ｍ ／ 碳 酸氢钠 ，． Ｌ ２ ｍ ｌ ） Ｅ Ｅ ，％ 胎牛 血 清 （ ４８ （０ｍ ｏ Ｌ Ｈ Ｐ Ｓ５ ／ 四季 青 ）５ｍ／ （ ｍ ｏ ） 一 酰胺 ，０ｍ／ （ ｍ ￣Ｌ 丙 ， ｌＬ １ ｍ ￣Ｌ Ｌ谷氨 １ ｌＬ １ｍ ｏ ） 酮 酸钠 ； 型胶 原 酶 （ｉ ａ ， Ｖ Ｉ ｓ ｍ ） 浓度 ：．％ ； — ｎ ｓ不 含 钙 ｇ ０ ２ Ｄ ｈ ｋ， ａ 镁 ，ｓ ａ ｉ ；５ （ｏ ｂ ）７ ％酒精 。 ｌ ｏ ｒ １３ 主要 实验 器材 ． １４ 肝 细胞的 分 离 ． 眼科 剪 、 眼科镊 、 术剪 、 杯 、 管 、 手 烧 滴 断头处 死 小 鼠 ，５ ７ ％酒 精 浸泡 ５Ｓ剖 ， 离 心管 、 Ｌ培养 瓶 。 ５ ｍ ０ 腹取肝 脏 ， 于装有 适量 Ｄ ｈｎ ｓ 放置 — ｋ 的培养 皿 ， 除血管 、 ａ 去 血 污 、 膜 等 ， 移 至 装 有 Ｄｈｎｓ 小 烧 杯 ， 碎 组 织 ， 包 转 － ｋ的 ａ 剪 用 Ｄｈｎｓ －ａｋ 冲洗 ２次 ， 至离 心管 ， ００ｒｍ， 心 ５ｍｎ 弃 转移 １ ０ ｐ 离 ｉ，
小鼠原代肝细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用与制作流程
图片简介:本技术提供了一种小鼠原代肝细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用，涉及原代细胞分离技术领域。
小鼠原代肝细胞的分离方法，包括如下步骤：将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小鼠原代肝细胞；原位三步灌流依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流；第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；第二灌流，用第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；第三灌流，用第三灌流液进一步消化。
该小鼠原代肝细胞的分离方法缓解了现有技术中缺乏一种分离后细胞活性高、贴壁迅速、存活细胞收率高、分离成本低并且分离过程不易污染的小鼠原代肝细胞分离方法的技术问题。
技术要求1.一种小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小鼠原代肝细胞；所述原位三步灌流依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流；所述第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；所述第二灌流，用第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；所述第三灌流，用第三灌流液进一步消化。
2.按照权利要求1所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述原位灌流的灌流血管为肝门静脉。
三灌流液对小鼠肝脏进行灌流以后，还包括用PBS对小鼠肝脏进行灌流清洗的步骤；优选地，所述PBS的温度为36-37℃；优选地，所述小鼠原代肝细胞的分离方法还包括在第二灌流以后用37℃的PBS预热小鼠肝脏的步骤；优选地，所述第三灌流液为IV型胶原酶溶液，温度为37℃，所述IV型胶原酶溶液的浓度为0.03-0.05％；优选地，所述IV型胶原酶溶液的浓度为0.048％；优选地，所述第一灌流液、第二灌流液和第三灌流液分别灌流150-200mL。
4.按照权利要求1-3任一项所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述肝周管结扎，结扎的肝周管包括：胆总管、胃十二指肠动脉、脾动脉、胃左动脉和后腔动脉；优选地，所述肝周管结扎依次结扎胆总管、胃十二指肠动脉、脾动脉、胃左动脉和后腔动脉；优选地，所述肝周管结扎包括如下步骤：(1)结剪断十二指肠韧带；(2)结扎胆总管；(3)结扎胃十二指肠动脉，追踪肝总动脉血液流经方向，直到暴露脾动脉与胃左动脉；(4)结扎并剪断脾动脉与胃左动脉，暴露腹腔动脉干；(5)将肝脏下翻，暴露背侧肝脏与膈肌，分离肝脏镰状韧带与左右三角韧带；(6)结扎胃左静脉，并在胰腺颈部双重结扎，并在结扎之间剪断胰腺(7)结扎后腔静脉；(8)上翻肝脏，分离肝门静脉周围淋巴组织，暴露肝门静脉，然后注射肝素100U。
小鼠肝脏淋巴细胞分离
肝脏淋巴细胞分离protocol
1. 腹腔注射100uL/只小鼠麻醉;
2. 用约20mL PBS从下腔静脉处灌洗(肾,肺,肝均变白,肝脏灌注也可);
3. 取10cm细胞培养皿,加入10mL 10% FBS+DMEM,将滤网浸于其中,取出的肝组织置于滤网中;
4. 用1mL注射器的内芯研磨,制备细胞悬液;
5. 从皿中吸取细胞悬液到50mL离心管,补加PBS至30mL;
6. 50g离心3min,上清转移至新管;
7. 1500rpm X 5min离心,2.5mL DMEM重悬细胞。
8. 准备percoll:
6mL 100% percoll + 660uL 10X PBS配成90% percoll
4mL 90% percol + 1.12mL DMEM配成70% percoll
2.5mL细胞重悬液+ 2mL 90% percoll配成40% percoll;
9. 将40% percoll细胞悬液沿管壁缓缓加入70% percoll中;
10. 2000rpm离心20min,brake和accelerate都设为level 1;
11. 吸取中间层细胞,PBS补加到10mL,400g离心10分钟;
12. 弃上清,加1mL红细胞裂解液,裂解2min
13. 补加PBS到10mL,终止裂解,400g离心10分钟
14. 将细胞重悬到合适体积,计数,用于下游分析。
小鼠肝实质细胞提取方法
小鼠肝实质细胞提取方法下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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一种简单分离、传代培养成年小鼠肝细胞的方法
一种简单分离、传代培养成年小鼠肝细胞的方法黄杰安;唐国都;丁虹;曹歌【期刊名称】《微创医学》【年(卷),期】2001(020)004【摘要】目的寻找肝细胞分离、传代培养更简单方便的方法。
方法应用不同胰酶浓度、不同消化时间消化成年小鼠肝组织后进行组织块培养，观察细胞的贴壁率、产量及活力。
结果胰蛋白酶分离成年小鼠肝细胞，于MEM(含20%小牛血清)培养液中，37℃密闭培养，生长情况良好，12小时左右即可完全贴壁，并已传至第二代。
胰酶浓度为0.15%，消化时间15min，细胞产量及活率较高，每10g体重细胞产量为0.84±0.08×10 7 ，细胞活力为(90.66±5.71)%，贴壁生长48小时细胞倍增PD值为0.86±0.05。
结论胰蛋白酶消化、组织块贴壁法是成年小鼠肝细胞分离、培养传代的简便方法，不需要特殊装置，酶耗费少，细胞采集可满足一般实验要求。
【总页数】2页(P417-418)【作者】黄杰安;唐国都;丁虹;曹歌【作者单位】广西医科大学附属第一医院南宁 530027;广西医科大学附属第一医院南宁 530027;武汉大学医学院武汉市 430071;武汉大学医学院武汉市 430071【正文语种】中文【中图分类】R446.8【相关文献】1.一种简单的肝细胞分离、培养和鉴定方法 [J], 谢华福;甘淋;李娟;刘晓燕;宋杰;李洪2.一种易操作的小鼠肝细胞的分离及培养方法 [J], 范仕郡;刘鑫;杨东;祝元锋;鲁永玲;郑江3.一种改良的简易灌注分离小鼠肝细胞的方法 [J], SONG Rongjing;SI Xia;CHEN Yue;FENG Wanyu4.一种改良的简易灌注分离小鼠肝细胞的方法 [J], 宋荣景;司霞;陈月;冯婉玉;5.一种分离新生小鼠肝细胞的简单方法 [J], 王琳;徐建波;田元;吴河水因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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组织块贴壁法是成年小鼠肝细胞分离 e 培养传代的简便方法 ) 不需要特殊装 倍增 I 6 ; < j> 6 > ? ! 结论 胰蛋白酶消化 e . 值为 > 置) 酶耗费少 ) 细胞采集可满足一般实验要求 ! 关键词 g 小鼠 l 肝细胞 l 培养 f 中图分类号 g M 文献标识码 g Y f 文章编号 g f E E < 6 ; f " > > T 3: ? @ A @ > > " B > E 3> E " ^ 3> @
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目 前! 国内外鼠肝细胞培养多采用大鼠! 利用胶原酶灌 流 分 离! 但 灌 流 法 需 特 殊 装 置! 操 作 难 度 大! 胶原酶价格昂 故应用受到限制 贵!
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解! 过滤除菌! 调; 分装! *= 4 1保存2 >培养液8 ’ 5 ! ?@ ? +< 培养基 A 溶解! 分装! 高压灭菌! 临用时 ’ 0 C三蒸水 # 4 4 4 B DE 4 C小牛血清 5 4 C= 7谷 氨 酰 胺 # ! 6 7G, ?@ ?F DE DE DE +H ’ 5 % I J=调 ; + 值至 < # ’ 5 动物 昆明种成年小鼠 ! 体重 # 雌雄均可 ! 由湖 F K5 5 ! B 北医科大学动物实验中心提供 % # ’ = 肝细胞分离培养 小鼠断头放血! 无菌分离肝脏! 置) = 液中灌注冲洗肝脏至灰白色! 将肝剪成 # *+, . / DD 左 右 的组织块! 用) 液冲洗数次! 除去血细胞! 加入不同 *+, . / 浓度的胰蛋白酶 = 加培养液终止消化 % < 1 温孵消化 # 6分钟 ! 将经过消化的肝组织块贴壁于 = 培 养 瓶 中! 加少许培养 4 DE 液! 静 置 小 时 小 心 吸 取 悬 浮 液 取 计 数! 调整 = < 1 0 ! ! 4 ’ 6 DE
白 酶 消 化& 组织块贴壁法对昆明成年小鼠肝细胞进行分离& 培养& 传代获得成功%此法操作简便! 不需要特殊装置! 酶耗 费少 ! 细胞采集量可满足一般实验要求 ! 现介绍如下 % # 材料与方法 # ’ # 试剂 液高压灭菌! () *+, 0 1保存2 34 ’ 5 6 7胰 . / 蛋白酶 8 胰蛋白酶9 上 海 化 学 试 剂 供 应 站: 用 )* +, . /溶
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一种简单分离 e 传代培养成年小鼠肝细胞的方法
广西医科大学附属第一医院 A 南宁 武汉大学医学院 A 武汉市
摘要 g 目的 f
? T > > @ ^ B 黄杰安 E T > > ^ "e 传代培养更简单方便的方法!方法
应用不同胰酶浓度e 不同消化时间消化成年小鼠
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