小鼠肝细胞原代培养ppt课件
遗传学实验课：实验一肝细胞的原代分离与培养
血球计数板使用方法
• 静置片刻，待细胞沉降到计数板，不再随液 体漂流
• 如细胞位于大方格的双线上，计数时则数上 线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
血球计数板使用方法
• 计数重复3次，取其平均值 • 使用完毕，用自来水清洗血球计数板，勿用
硬物洗刷
• 计数板计算公式
细胞数/ml=(4个大方格内的细胞数/4)×104×稀释倍数
细胞存活率计算
• 细胞存活率=活细胞数/细胞总数×100%
思考题
• 1、什么是细胞的原代培养与传代培养？ • 2、除了台酚蓝染液，还有哪些染液可用于细胞死活
的鉴定？ • 3、简述采用灌流方法分离肝细胞的技术有哪些？ • 4、血球计数板的使用方法及注意事项？并计算本实
验中的细胞数量。
操作步骤
3、用手术剪将肝脏剪成小块（约1mm3）， 再用玻片充分研磨，转移到离心管，离心 1000 rpm，5min。
注意：玻片研磨既需要充分又不能用力太大
操作步骤
4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5mL）胰酶， 37℃水浴中消化20分钟，每隔5分钟振荡一 次，或用吸管轻柔吹打一次，使细胞分离。
操作步骤
2、用针头将小鼠四肢固定在泡沫板上,腹部朝上。镊 子捏起腹部皮肤，剪刀剪一小口，暴露腹壁。
注意：不要一刀剪破腹壁，这样毛容易进入腹腔， 里面就不是无菌的了。 镊子夹起腹壁，剪开腹腔，取出肝脏，置于培养 皿中，剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移 到另一个盛有PBS液的平皿中。
镊子捏起腹部皮肤，剪刀剪一小口，暴露腹壁。 镊子夹起腹壁，剪开腹腔，取出肝脏，
9、细胞计数前，先用台酚蓝染料染色，细胞悬液与 0.4%台酚蓝溶液以9:1混合均匀，用血球计数板计 数，计数活细胞。
小鼠肝细胞的分离与原代培养
Ｋｅ ｒ ｓ ｐ ｉ ｒ ｅ ｌｃ ｔ ｒ ｙ ｗｏ ｄ ｒｍａ ｙ ｃ ｌ ｕｌｕ ｅ；ｈ ｐａ ｏ ｙ ｅ ｅ ｔ ｃ ｔ ｓ；ｃ ｌ ｉｏｌ ｔｏ ｅ １ ｓ ａ ｉ ｎ；ｃ ｌ ｃ ｌｕｒ ｅ１ ｕｔ ｅ
肝 脏 作 为 机体 重要 的代 谢 器 官 ， 多 种 生 理 病 理 过 程 中 在 发 挥 重 要 作 用 ， 细 胞 行 使 了肝 脏 主 要 的功 能 ， 合 成 凝 血 肝 如 因子 和 血 清 白蛋 白 及 多 种 消 化 酶 、 与 内 分 泌 调 节 、 谢 多 参 代
态 变 化 进行 观察 ， 进 一 步 进 行 相 关研 究奠 定 基 础 。 为
赖 静 杨天 燕 韦锦斌 。 王乃平
南 宁 ５０ ０ ） ３ ０ １
（ 西 中医 学 院 药 学 院 广
摘 要 目的 ： 求 一 种 简 易 、 济 的小 鼠原 代 肝 细 胞 的 分 离 与 培 养 方 法 。方 法 ： 用 非 灌 注 法 分 离 小 鼠 肝 脏 ， 用 ０ ２ Ｉ 探 经 采 利 ． Ｖ型胶 原 酶 对 肝脏 消 化来 获 取肝 细胞 ， Ｄ 以 ＭＥ 培 养 基 对 肝 细 胞 进 行 单 层 培 养 。 结 果 ： 较 成 功 地 进 行 了 原 代 肝 细 胞 培 养 ， 进 行 Ｍ 比 并
４ ８ｇ Ｉ ． ／ ＨＥＰ ＥＳ， 胎 牛 血 清 （ 季 青 ） ５ ｍＬ Ｌ Ｌ 谷 氨 酰 ５ 四 ， ／
种 营 养 物 质 、 存 葡 萄 糖 、 除 毒 素 等 ， 代 培 养 的 肝 细 胞 广 储 清 原 泛 用 于 药 理 学 、 理 学 、 疫 学 、 子 生 物 学 、 胞 生 物 学 等 毒 免 分 细 相 关 的 研 究 ， 其 在 药 物 研 发 方 面 ， 用 原 代 肝 细 胞 可 较 经 尤 使 济 和 迅 速 地 阐 明 药 物对 药物 代 谢 酶 的 诱 导 或 抑 制 作 用 ， 而 从 避 免 采 用 大 量 动 物 进行 药理 效 应 筛 选 。但 是 ， 于 原 代 肝 细 由 胞 增 殖 能 力 差 ， 易 长 时 间 保 存 或 长 期 培 养 及 其 生 物 学性 状 不
细胞毒理学实验一小鼠肝细胞原代培养
6. 用手术剪将肝脏剪成小块（1mm3）,无血清培养基 冲洗三次。
学习文档 6/27/2021
7. 将组织转移到一次性培养皿中，排列贴附于皿底。 组织块间间隔约0.5-1cm,静置数分钟。
学习文档 6/27/2021
8. 待组织粘附后，缓缓加入含血清的培养基，切勿 将组织块冲起，做好标记，转入培养箱培养，镜 检观察。
② 实验后，请将解剖器械、离心管冲洗干净（自来水-去 离子水-三蒸水），放入烘箱烘干，超净工作台内擦拭 干净，酒精喷洒消毒，并将酒精擦干净，打开紫外灯 灭菌。
③ 各个实验小组的同学负责将垃圾带走，值日生打扫实 验室卫生。
学习文档 6/27/2021
光源
目镜 光亮度调节
电源开关
环状光阑
物镜 粗/细准焦螺旋
学习文档 6/27/2021
取出的剩余肝组织充分剪碎后，用剪过的蓝枪头将其转入离心 管，1000rpm离心5min，弃上清，根据组织量的多少加入 0.25%胰蛋白酶1-1.5ml。
37℃水浴消化约10-15min，每间隔5min，振荡一次，促使 细胞分离。
待组织变得疏松，略发白时，加入1ml含血清的DMEM培养 基，终止胰蛋白酶的消化作用。
学习文档 6/27/2021
1. 总结原代培养的实验步骤以及在操作过程中需要 注意的问题。
2. 绘图表示所观察到的实验结果，并对其予以分析。
学习文档 6/27/2021
1. 你认为原代培养中最关键的步骤是什么？为什么？ 2. 在毒理实验的检测中，原代培养细胞具有什么样
的优势？
学习文档 6/27/2021
学习文档 6/27/2021
2. 将胎鼠或新生小鼠引颈处死，置于75%消毒酒精浸 泡2~3s，带入超净工作台。
小鼠肝实质细胞原代培养方法及鉴定
Vo l.28No .12Dec 2012赤峰学院学报(自然科学版)J o urnal o f Chifeng University (Natural S cience Editio n )第28卷第12期(下)2012年12月建立体外的原代肝细胞培养模型,用于肝细胞分子生物学特征的研究,在肝病研究中发挥日益重要的作用.本研究采用改良的灌流方法将肝脏中的肝实质细胞分离、纯化、体外培养.为肝细胞体外实验研究奠定基础.1材料与方法1.1材料S P F (special pathog en free )级雄性C57BL/6小鼠,体重20～25g ,由中国科学院上海实验动物中心提供.Ⅳ型胶原酶购自sig ma 公司,高糖DMEM 干粉、Insulin-Transferrin-S ele-nium 购自Gibco 公司.C yto keratin 18抗体购自santa cruz 公司.FITC 标记的羊抗小鼠Ig G 购自上海博蕴生物公司.其余试剂均为国产分析纯.鼠尾胶自制.Langendo rff 灌流装置购自保定兰格恒流泵有限公司.超级恒温槽购自上海衡平仪器厂.1.2小鼠原代肝细胞培养方法提前30分钟打开恒温装置,用75%酒精100ml 清洗灌流装置,然后用100ml 含双抗的D-Hank ’s-EDTA (NaC l 8.0g ,KCl0.4g ,NaHC O 30.35g ,Na 2HP O 4·12H 2O0.06g ,KH 2P O 40.06g ,EDTA 0.2g ,Gluco se 1.0g ,硫酸链霉素0.1g ,青霉素G 钠0.06g )溶液清洗灌流装置,烧杯内留20ml 灌流肝脏;小鼠6%水合氯醛麻醉后,置入75%酒精中浸泡5分钟,转移至木板四肢固定;铺无菌巾,腹部”U ”型切口,暴露出门静脉,分离门静脉,远端穿线并结扎;开胸腔,止血钳夹住心尖,分离下腔静脉,下腔静脉下穿线备用,眼科剪在右心房剪一个小口,将P E50聚乙烯导管插入下腔静脉结扎;门静脉远端用眼科剪剪一个小口,止血钳夹住腹腔的腹腔静脉及其分支;打开蠕动泵,用D-Hank ’s-EDTA 溶液灌流至肝脏发白,将门静脉用动脉夹夹住,改用5%的Ⅳ型胶原酶45ml 灌流,直至全部灌完;铺无菌巾暴露出肝脏,将胸腔的下腔静脉剪断,棉签将胸腔内的血液吸干,切断肝脏周围的血管,将肝脏移入烧杯;将取下的肝脏移入超净台内,摘除胆囊,剥离肝脏包膜,用20ml 培养液将肝脏吹散,混匀液体用200目筛网过滤至另一烧杯内,收集置入离心管中.1000转/分钟,8分钟,弃上清;培养液重悬细胞沉淀,1000转/分钟,8分钟,离心2次;接种加入40ml 含有10%胎牛血清和1%Insulin-Transferrin-S elenium 的DMEM 含双抗悬浮沉淀,并用吸管充分吹打混匀.接种于铺鼠尾胶的60mm 培养皿中.置于37℃二氧化碳恒温培养箱中静置培养.4小时后换培养液,去掉不贴壁的细胞.以后隔2天换一次培养液.2细胞鉴定2.1免疫荧光鉴定细胞接种到12m m ×12mm 盖玻片上,培养至铺满80%左右;4%多聚甲醛室温固定20～30m in ,用PBS 洗3遍;1%羊血清+0.05%Triton 室温封闭30min ;用封闭液稀释一抗(1:100),滴加到含细胞的盖玻片上;4℃冰箱孵育过夜;PBS 洗3遍,每次10min ;封闭液稀释二抗(1:200),滴加到含细胞的盖玻片上;4℃冰箱避光孵育过夜;P BS 洗3遍,每次10min ;10%缓冲甘油封片,荧光显微镜下观察,摄像(注意:实验中设置不加一抗,只加二抗的阴性对照).2.2透射电镜鉴定将培养生长成单层的细胞用刮匙刮下,2.5%戊二醛固定细胞,1%锇酸再固定,环氧树脂包埋,超薄切片机切片,透射电镜下观察细胞的显微结构.3结果3.1光镜观察Olym pus 光镜下培养4h 活细胞已基本贴壁,此时换液以去除血细胞及死细胞.肝细胞培养12h 后可见细胞贴附、小鼠肝实质细胞原代培养方法及鉴定郝丹丹,张凤宁,瑞云,叶冬梅,贾晓丽,杨立新,乌英嘎(赤峰学院医学院,内蒙古赤峰024000)摘要:目的:寻求一种简单的原代小鼠肝细胞培养方法.方法采用Ⅳ型胶原酶原位灌流方法分离肝细胞,并采用免疫荧光和透射电镜方法对其进行鉴定.结果:光镜下细胞贴附、伸展、呈圆形、椭圆形及多边形.细胞核体积较大,其中有许多双核的肝细胞.细胞浆为颗粒状,细胞边界轮廓清晰可见.采用Cytokera tin 18的抗体进行肝细胞免疫荧光染色鉴定,显示细胞染上绿色荧光,细胞轮廓清晰.采用透射电镜鉴定,细胞在电镜下均可见到:肝细胞上有大量微绒毛,细胞间有特征性的紧密连接以及毛细胆管.胞浆内有丰富的细胞器.结论:成功地在体外培养了小鼠肝细胞并对其进行了鉴定,为进一步的实验研究奠定基础.关键词:小鼠;肝细胞;原代培养;鉴定中图分类号:R965.1文献标识码:A文章编号:1673-260X (2012)12-0091-02９１--. All Rights Reserved.图1倒置相差显微镜A(88×)B B(220×)C(880×)图2图3透射电镜下的肝细胞伸展、呈圆形、椭圆形及多边形.细胞核体积较大,其中有许多双核的肝细胞.细胞浆为颗粒状,细胞边界轮廓清晰可见(图1).3.2肝细胞鉴定3.2.1采用Cytokeratin18的抗体进行肝细胞免疫荧光染色鉴定[1,2],显示细胞染上绿色荧光,细胞轮廓清晰(图2).3.2.2采用透射电镜进行肝细胞鉴定,细胞在电镜下均可见到[1]:肝细胞上有大量微绒毛,细胞间有特征性的紧密连接以及毛细胆管.胞浆内有丰富的细胞器,如大量内质网,包括粗面内质网及滑面型内质网,大量的线粒体,其中有典型的车轮状线粒体,大量玫瑰花瓣形的糖原颗粒等细胞器(图3).4讨论本文采用改良的S eg len[3-5]二步灌注法分离培养C57BL/6小鼠肝细胞,采用无Ca2+、Mg2+的Hank’s-EDTA液及胶原酶原位两步灌注法,去除红细胞效果好,所分离的肝细胞较纯,细胞存活率高且节约胶原酶.实验操作时需注意以下几点:插管动作轻柔迅速,手术时间不宜过长;肝脏灌流以及移入超净台内的过程中要严格保持无菌.与乳鼠肝组织块外植培养和肝组织块胶原酶消化法[6]比较,本方法比较简单,时间短,分离的细胞存活率较高,是种简单可靠的肝细胞分离方法,是普通实验室开展肝细胞培养值得借鉴的方法.———————————————————参考文献:〔1〕Lazaro,C.A.,Croager,E.J.,Mitchell,C.et al.Estab⁃lishment,characterization,and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes[J].Hepatology, 2003,38(5):1095-1106.〔2〕Ku,N.O.,Liao,J.,Omary,M.B.Phosphorylation of human keratin18serine33regulates binding to14-3-3proteins[J].EMBO J,1998,17(7):1892-1906.〔3〕Renton,K.W.,Deloria,L.B.,Mannering,G.J.Ef⁃fects of polyribonoinosinic acid polyribocytidylic acid and a mouse interferon preparation on cytochrome P-450-dependent monooxygenase systems in cultures of primary mouse hepatocytes[J].Mol Pharmacol,1978,14 (4):672-681.〔4〕Michalopoulos,G.,Sattler,C.A.,Sattler,G.L.et al.Cytochrome P-450induction by phenobarbital and3-methylcholanthrene in primary cultures of hepatocytes[J].Science,1976,193(4256):907-909.〔5〕Seglen,P.O.Preparation of rat liver cells.3.Enzymat⁃ic requirements for tissue dispersion[J].Exp Cell Res, 1973,82(2):391-398.〔6〕张阳德,赖毅,赵俊玲.新生小鼠肝细胞的体外培养[J].中国现代医学杂志,2001,11(4).９２--. All Rights Reserved.。
原代肝细胞培养
原代肝细胞培养原代肝细胞培养1．实验材料灌流液：NaCl、KCl、NaH2PO4.2H2O、Na2HPO4.H2O、NaHCO3、HEPES、EDTA、Glucose （国药或阿拉丁）。
消化液：Collagenase IV（Yeasen，翊圣生物，产品货号：40510ES60，100 mg ，279￥）、CaCl2。
Percoll：Percoll（GE Healthcare，17-0891-02）我买的是分装的100ml，450￥的17-0891-01-1。
麻醉剂：10%水合氯醛。
实验器材：200目细胞筛、20ml 注射器、头皮针、手术剪3把、手术镊3把（实验前灭菌），细胞培养皿2个，离心机，实验前备冰盒及水浴锅，鼠板及大头针（实验前酒精及紫外消毒）。
2. 实验前准备1) 灌流液Perfusion SolutionNaCl KCl NaH2PO4.2H2O Na2HPO4.H2O NaHCO3 HEPES EDTA Glucose离子）。
用前37℃温育。
每只老鼠消耗15ml灌流液。
2）消化液100× CaCl2：560mg CaCl2，加入10 ml PBS/ ddH2O，分装-20℃保存。
10× CollagenaseIV：100 mgCollagenaseIV粉末溶于20 mlDMEM（无血清），0.22 uM滤膜过滤除菌，每管1.5ml分装。
消化液：13.5 mlDMEM（无血清）加入150 μl100× CaCl2（终浓度5 mM），再加入1.5 ml10× CollagenaseIV（终浓度0.5 mg/ml），于37℃温育。
每只老鼠消耗15ml消化液。
3）40%Percollg/L 8.0 0.4 0.078 0.151 0.35 2.380 0.19 0.9调节pH 7.2-7.4，配好后过滤除菌。
（不能高压灭菌，其中含葡萄糖及HCO3-16.2 ml 100%percoll原液，加入1.8 ml10×PBS，再加入27ml 1×PBS，得45 ml。
细胞原代培养PPT课件
3.过滤
• 用400目不锈钢筛网过滤 • 收集滤液于离心管 4.离心 • 平衡、离心5min，1000～1500 rpm • 去上清，加PBS，混匀，离心（同上） • 重复上一步 5.接种 • 去上清，加3～5ml培养基，混匀，接种于培养瓶 • 加培养基3～5mm深，盖紧盖，观察细胞密度 6.培养
针头）
有机试剂过滤除菌，常用0.22µm • 超净工作台
紫外灯照射30min以上 • 培养室
紫外灯照射2～3h/天
操作步骤
1.取材 • 75％酒精浸泡乳鼠2min，取肝脏于平皿中 • PBS溶液洗涤3次 • 去除液体后，剪碎成1～2mm3小块 2.消化 • 加5～8倍组织量的胰蛋白酶溶液 • 转移到离心管内，加盖 • 37℃水浴15min，每5min摇晃1次 • 终止消化：加1ml含血清的培养基DMEM
• 超净工作台 紫外消毒，鼓风，保持干净、整洁
• 高压锅 用电，带压力表，自动恒压，掌握时间
橡胶、塑料、药品——15’，金属——20’ • 培养瓶
玻璃瓶和塑料瓶，洗涤要干净，临时消毒
• 培养基 a.天然培养基：血清、胚胎浸出液、水解乳蛋白等 b.合成培养基：DMEM、RPMI1640、199培养基等 c.无血清培养基：Ham F12和DMEM混合的基础培 养基、自行设计与配制的培养基（加其他成分）
a.组织块法：直接将组织块接种于培养瓶， 24小时就有细胞向四周游出。 简便、易行，适合于来源有限、数量较少 的组织做原代细胞培养
b.消化法
• 用酶消化、分解妨碍细胞生长的间质（基 质、纤维等），形成单个细胞或细胞团
• 对上皮、肝、肾、胚胎等间质少、较软组 织选择胰蛋白酶
• 对骨、前列腺、癌组织等纤维多、较硬的 组织可用胶原酶
细胞生物学实验-小鼠肝细胞原代培养
小鼠肝细胞原代培养小鼠肝细胞原代培养实验目的：1.了解并掌握原代细胞培养的相关原理2.了解并掌握小鼠肝细胞原代培养的方法实验器材：二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿、烧杯、镊子、酒精棉、离心管、电动移液器、移液管、细胞计数板、幼鼠、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.125％胰蛋白酶（含0.1%胶原酶）、D-Hanks或者PBS等。
原代培养是从供体中取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。
原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织或细胞培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。
原代培养的组织或者细胞的生物学特性没有发生很大变化，仍具有二倍体遗传物质，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、基因表达测试、细胞分化等实验研究。
原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种成分组成，比较复杂，即使同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。
如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。
因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需要对原代培养的细胞进行短期传代后再进行（需要注意的是有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化）。
一般采用2-5代的细胞进行实验。
当然特殊情况和一些终端分化细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。
原代培养的方法很多，最基本和最常用的为组织块原代培养法和离散细胞原代培养法（消化法）。
组织块原代培养：组织块原代培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织，组织块原代培养法操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。
但由于培养过程中细胞移动受到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。
组织块培养的程序一般为：1.组织块修整：将组织块用平衡缓冲液反复冲洗，然后在灭菌的培养皿中剪碎至碎块的直径小于1mm3。
2.贴壁：将组织块间隔（小块之间的间隔为1cm）放在培养皿中，培养基需要浸没组织块底部但不能使组织块浮起。
小鼠原代肝细胞分离培养
小鼠原代肝细胞分离培养准备材料1.能够提供灌注速度为1-10mL/分钟的蠕动泵（我们用的是保定兰格的蠕动泵，某宝有售）；2.能够容纳50-100mL溶液的无菌容器；3.凹槽（可供放置操作台面并提供引流槽，我们用的是搪瓷实验盘+泡沫板的组合）；4.可维持37℃的水浴设备（即恒温水浴锅）；5.无菌100mL广口玻璃瓶；6.无菌50mL锥形管；7.一次性或可重复使用的70微米不锈钢过滤器（就是不锈钢滤网，查阅资料提示这里选用的滤网规格大概为200目左右）；8.细胞培养皿（直径10cm，即常说的大皿）；9.无菌器械，至少要有一把剪刀和两对细尖镊子；10.70%-75%酒精和去污剂（去污剂我们没有用过，只要小鼠备皮充分一般影响不大），均盛装于喷雾瓶中（碘剂可选）；11.麻醉剂，注射或吸入剂型均可（我们选用水合氯醛或戊巴比妥）；12.Vacutainer牌蝶型插管（我们选用BD公司的套管针）; 推荐小鼠体重：20g-40g（我们的建议是25g以上）；13.口罩；14. 每只小鼠2只吸水台垫（我们是用大量吸水纸代替吸水台垫铺在手术操作平台上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；15.动物操作台；16.胶带。
分离试剂1.前灌液：Hank's缓冲盐溶液（HBSS），使用不含钙镁离子、含0.5mM EGTA 的1x工作液；共需要大约 60ml-70ml；使用前预温至37℃；2.后灌液：IV型胶原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mM HEPES（低糖DMEM 和IV型胶原酶是必须的，HEPES缓冲液等等可以选择性加入）；共需要90ml。
注意确保所使用的DMEM含钙；使用前预温至37℃；3.分散液：IV型胶原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4℃预冷；4.IV型胶原酶;在消化液和分散液中，胶原酶的浓度至少要达到100胶原酶消化单位/ml（100CDU/ml）；（我们使用的是购自Gibco公司的IV型胶原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝细胞）；5.蒸馏水。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
10.接种及培养：将细胞接种于培养瓶中, 密度为 106/ml (2×105/cm2), 37℃、5%CO2培 养。
精选ppt
2
注意事项
根据组织类型选择适当的消化液。 控制消化时间，尽量减少细胞损伤。 尽快促进细胞贴壁，必要使用生长基质 涂抹瓶壁，或先少量细胞悬液接种，培 养3～5 h后，补足培养液。 适当提高细胞接种密度。
小鼠肝细胞原代培养－消化法
1. 处死及消毒：脱颈处死小鼠, 浸入75%酒 精中1min, 沥干。
2. 取材：剪开腹部皮肤,撕开皮肤,暴露腹膜, 打开腹腔,取出肝脏。
3. 解剖：修剪除去肝门区血管结缔组织,剪 取一块蚕豆大小的肝组织。
4. 剪切：把肝组织剪成1 ～ 2mm３小块, 用无血清培养液淋洗2～3次。
精选ppt
1
5. 消化：将肝组织块移入小瓶中, 加8ml混合消 化液, 37℃、40min, 每隔5～10min顺时针摇 匀。
6. 过滤：消化液过100目筛网, 收集滤液, 移入离 心管。
7.离心：离心800rpm, 5min, 吸弃上清液。
8. 洗涤：用无血清培养液离心洗涤１次。
9. 重悬浮及计数：用RPIM1640培养液(含10% 胎牛血清)重悬浮肝细胞, （取样计数）。
精选ppt
3
感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络， 如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！