小鼠肝细胞原代培养ppt课件

遗传学实验课：实验一肝细胞的原代分离与培养

血球计数板使用方法
• 静置片刻，待细胞沉降到计数板，不再随液体漂流
• 如细胞位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
血球计数板使用方法
• 计数重复3次，取其平均值 • 使用完毕，用自来水清洗血球计数板，勿用
硬物洗刷
• 计数板计算公式
细胞数/ml=(4个大方格内的细胞数/4)×104×稀释倍数
细胞存活率计算
• 细胞存活率=活细胞数/细胞总数×100%
思考题
• 1、什么是细胞的原代培养与传代培养？ • 2、除了台酚蓝染液，还有哪些染液可用于细胞死活
的鉴定？ • 3、简述采用灌流方法分离肝细胞的技术有哪些？ • 4、血球计数板的使用方法及注意事项？并计算本实
验中的细胞数量。
操作步骤
3、用手术剪将肝脏剪成小块（约1mm3），再用玻片充分研磨，转移到离心管，离心 1000 rpm，5min。
注意：玻片研磨既需要充分又不能用力太大
操作步骤
4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5mL）胰酶， 37℃水浴中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管轻柔吹打一次，使细胞分离。
操作步骤
2、用针头将小鼠四肢固定在泡沫板上,腹部朝上。镊子捏起腹部皮肤，剪刀剪一小口，暴露腹壁。
注意：不要一刀剪破腹壁，这样毛容易进入腹腔，里面就不是无菌的了。镊子夹起腹壁，剪开腹腔，取出肝脏，置于培养皿中，剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有PBS液的平皿中。
镊子捏起腹部皮肤，剪刀剪一小口，暴露腹壁。镊子夹起腹壁，剪开腹腔，取出肝脏，
9、细胞计数前，先用台酚蓝染料染色，细胞悬液与 0.4%台酚蓝溶液以9:1混合均匀，用血球计数板计数，计数活细胞。

小鼠肝细胞的分离与原代培养

ｆｒｔｕｒｈｒｒｓａｃｏｈｅｆｔｅｅｅｒｈ．
Ｋｅｒｓｐｉｒｅｌｃｔｒｙｗｏｄｒｍａｙｃｌｕｌｕｅ；ｈｐａｏｙｅｅｔｃｔｓ；ｃｌｉｏｌｔｏｅ１ｓａｉｎ；ｃｌｃｌｕｒｅ１ｕｔｅ
肝脏作为机体重要的代谢器官，多种生理病理过程中在发挥重要作用，细胞行使了肝脏主要的功能，合成凝血肝如因子和血清白蛋白及多种消化酶、与内分泌调节、谢多参代
态变化进行观察，进一步进行相关研究奠定基础。为
赖静杨天燕韦锦斌。王乃平
南宁５００）３０１
（西中医学院药学院广
摘要目的：求一种简易、济的小鼠原代肝细胞的分离与培养方法。方法：用非灌注法分离小鼠肝脏，用０２Ｉ探经采利．Ｖ型胶原酶对肝脏消化来获取肝细胞，Ｄ以ＭＥ培养基对肝细胞进行单层培养。结果：较成功地进行了原代肝细胞培养，进行Ｍ比并
４８ｇＩ．／ＨＥＰＥＳ，胎牛血清（季青）５ｍＬＬＬ谷氨酰５四，／
种营养物质、存葡萄糖、除毒素等，代培养的肝细胞广储清原泛用于药理学、理学、疫学、子生物学、胞生物学等毒免分细相关的研究，其在药物研发方面，用原代肝细胞可较经尤使济和迅速地阐明药物对药物代谢酶的诱导或抑制作用，而从避免采用大量动物进行药理效应筛选。但是，于原代肝细由胞增殖能力差，易长时间保存或长期培养及其生物学性状不

细胞毒理学实验一小鼠肝细胞原代培养

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6. 用手术剪将肝脏剪成小块（1mm3）,无血清培养基冲洗三次。
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7. 将组织转移到一次性培养皿中，排列贴附于皿底。组织块间间隔约0.5-1cm,静置数分钟。
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8. 待组织粘附后，缓缓加入含血清的培养基，切勿将组织块冲起，做好标记，转入培养箱培养，镜检观察。
② 实验后，请将解剖器械、离心管冲洗干净（自来水-去离子水-三蒸水），放入烘箱烘干，超净工作台内擦拭干净，酒精喷洒消毒，并将酒精擦干净，打开紫外灯灭菌。
③ 各个实验小组的同学负责将垃圾带走，值日生打扫实验室卫生。
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光源
目镜光亮度调节
电源开关
环状光阑
物镜粗/细准焦螺旋
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取出的剩余肝组织充分剪碎后，用剪过的蓝枪头将其转入离心管，1000rpm离心5min，弃上清，根据组织量的多少加入 0.25%胰蛋白酶1-1.5ml。
37℃水浴消化约10-15min，每间隔5min，振荡一次，促使细胞分离。
待组织变得疏松，略发白时，加入1ml含血清的DMEM培养基，终止胰蛋白酶的消化作用。
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1. 总结原代培养的实验步骤以及在操作过程中需要注意的问题。
2. 绘图表示所观察到的实验结果，并对其予以分析。
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1. 你认为原代培养中最关键的步骤是什么？为什么？ 2. 在毒理实验的检测中，原代培养细胞具有什么样
的优势？
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2. 将胎鼠或新生小鼠引颈处死，置于75%消毒酒精浸泡2~3s，带入超净工作台。

小鼠肝实质细胞原代培养方法及鉴定

Vo l.28No .12Dec 2012赤峰学院学报(自然科学版)J o urnal o f Chifeng University (Natural S cience Editio n )第28卷第12期(下)2012年12月建立体外的原代肝细胞培养模型,用于肝细胞分子生物学特征的研究,在肝病研究中发挥日益重要的作用.本研究采用改良的灌流方法将肝脏中的肝实质细胞分离、纯化、体外培养.为肝细胞体外实验研究奠定基础.1材料与方法1.1材料S P F (special pathog en free )级雄性C57BL/6小鼠,体重20～25g ,由中国科学院上海实验动物中心提供.Ⅳ型胶原酶购自sig ma 公司,高糖DMEM 干粉、Insulin-Transferrin-S ele-nium 购自Gibco 公司.C yto keratin 18抗体购自santa cruz 公司.FITC 标记的羊抗小鼠Ig G 购自上海博蕴生物公司.其余试剂均为国产分析纯.鼠尾胶自制.Langendo rff 灌流装置购自保定兰格恒流泵有限公司.超级恒温槽购自上海衡平仪器厂.1.2小鼠原代肝细胞培养方法提前30分钟打开恒温装置,用75%酒精100ml 清洗灌流装置,然后用100ml 含双抗的D-Hank ’s-EDTA (NaC l 8.0g ,KCl0.4g ,NaHC O 30.35g ,Na 2HP O 4·12H 2O0.06g ,KH 2P O 40.06g ,EDTA 0.2g ,Gluco se 1.0g ,硫酸链霉素0.1g ,青霉素G 钠0.06g )溶液清洗灌流装置,烧杯内留20ml 灌流肝脏;小鼠6%水合氯醛麻醉后,置入75%酒精中浸泡5分钟,转移至木板四肢固定;铺无菌巾,腹部”U ”型切口,暴露出门静脉,分离门静脉,远端穿线并结扎;开胸腔,止血钳夹住心尖,分离下腔静脉,下腔静脉下穿线备用,眼科剪在右心房剪一个小口,将P E50聚乙烯导管插入下腔静脉结扎;门静脉远端用眼科剪剪一个小口,止血钳夹住腹腔的腹腔静脉及其分支;打开蠕动泵,用D-Hank ’s-EDTA 溶液灌流至肝脏发白,将门静脉用动脉夹夹住,改用5%的Ⅳ型胶原酶45ml 灌流,直至全部灌完;铺无菌巾暴露出肝脏,将胸腔的下腔静脉剪断,棉签将胸腔内的血液吸干,切断肝脏周围的血管,将肝脏移入烧杯;将取下的肝脏移入超净台内,摘除胆囊,剥离肝脏包膜,用20ml 培养液将肝脏吹散,混匀液体用200目筛网过滤至另一烧杯内,收集置入离心管中.1000转/分钟,8分钟,弃上清;培养液重悬细胞沉淀,1000转/分钟,8分钟,离心2次;接种加入40ml 含有10%胎牛血清和1%Insulin-Transferrin-S elenium 的DMEM 含双抗悬浮沉淀,并用吸管充分吹打混匀.接种于铺鼠尾胶的60mm 培养皿中.置于37℃二氧化碳恒温培养箱中静置培养.4小时后换培养液,去掉不贴壁的细胞.以后隔2天换一次培养液.2细胞鉴定2.1免疫荧光鉴定细胞接种到12m m ×12mm 盖玻片上,培养至铺满80%左右;4%多聚甲醛室温固定20～30m in ,用PBS 洗3遍;1%羊血清+0.05%Triton 室温封闭30min ;用封闭液稀释一抗(1:100),滴加到含细胞的盖玻片上;4℃冰箱孵育过夜;PBS 洗3遍,每次10min ;封闭液稀释二抗(1:200),滴加到含细胞的盖玻片上;4℃冰箱避光孵育过夜;P BS 洗3遍,每次10min ;10%缓冲甘油封片,荧光显微镜下观察,摄像(注意:实验中设置不加一抗,只加二抗的阴性对照).2.2透射电镜鉴定将培养生长成单层的细胞用刮匙刮下,2.5%戊二醛固定细胞,1%锇酸再固定,环氧树脂包埋,超薄切片机切片,透射电镜下观察细胞的显微结构.3结果3.1光镜观察Olym pus 光镜下培养4h 活细胞已基本贴壁,此时换液以去除血细胞及死细胞.肝细胞培养12h 后可见细胞贴附、小鼠肝实质细胞原代培养方法及鉴定郝丹丹,张凤宁,瑞云,叶冬梅,贾晓丽,杨立新,乌英嘎(赤峰学院医学院,内蒙古赤峰024000)摘要:目的:寻求一种简单的原代小鼠肝细胞培养方法.方法采用Ⅳ型胶原酶原位灌流方法分离肝细胞,并采用免疫荧光和透射电镜方法对其进行鉴定.结果:光镜下细胞贴附、伸展、呈圆形、椭圆形及多边形.细胞核体积较大,其中有许多双核的肝细胞.细胞浆为颗粒状,细胞边界轮廓清晰可见.采用Cytokera tin 18的抗体进行肝细胞免疫荧光染色鉴定,显示细胞染上绿色荧光,细胞轮廓清晰.采用透射电镜鉴定,细胞在电镜下均可见到:肝细胞上有大量微绒毛,细胞间有特征性的紧密连接以及毛细胆管.胞浆内有丰富的细胞器.结论:成功地在体外培养了小鼠肝细胞并对其进行了鉴定,为进一步的实验研究奠定基础.关键词:小鼠;肝细胞;原代培养;鉴定中图分类号:R965.1文献标识码:A文章编号:1673-260X (2012)12-0091-02９１--. All Rights Reserved.图1倒置相差显微镜A(88×)B B(220×)C(880×)图2图3透射电镜下的肝细胞伸展、呈圆形、椭圆形及多边形.细胞核体积较大,其中有许多双核的肝细胞.细胞浆为颗粒状,细胞边界轮廓清晰可见(图1).3.2肝细胞鉴定3.2.1采用Cytokeratin18的抗体进行肝细胞免疫荧光染色鉴定[1,2],显示细胞染上绿色荧光,细胞轮廓清晰(图2).3.2.2采用透射电镜进行肝细胞鉴定,细胞在电镜下均可见到[1]:肝细胞上有大量微绒毛,细胞间有特征性的紧密连接以及毛细胆管.胞浆内有丰富的细胞器,如大量内质网,包括粗面内质网及滑面型内质网,大量的线粒体,其中有典型的车轮状线粒体,大量玫瑰花瓣形的糖原颗粒等细胞器(图3).4讨论本文采用改良的S eg len[3-5]二步灌注法分离培养C57BL/6小鼠肝细胞,采用无Ca2+、Mg2+的Hank’s-EDTA液及胶原酶原位两步灌注法,去除红细胞效果好,所分离的肝细胞较纯,细胞存活率高且节约胶原酶.实验操作时需注意以下几点:插管动作轻柔迅速,手术时间不宜过长;肝脏灌流以及移入超净台内的过程中要严格保持无菌.与乳鼠肝组织块外植培养和肝组织块胶原酶消化法[6]比较,本方法比较简单,时间短,分离的细胞存活率较高,是种简单可靠的肝细胞分离方法,是普通实验室开展肝细胞培养值得借鉴的方法.———————————————————参考文献:〔1〕Lazaro,C.A.,Croager,E.J.,Mitchell,C.et al.Estab⁃lishment,characterization,and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes[J].Hepatology, 2003,38(5):1095-1106.〔2〕Ku,N.O.,Liao,J.,Omary,M.B.Phosphorylation of human keratin18serine33regulates binding to14-3-3proteins[J].EMBO J,1998,17(7):1892-1906.〔3〕Renton,K.W.,Deloria,L.B.,Mannering,G.J.Ef⁃fects of polyribonoinosinic acid polyribocytidylic acid and a mouse interferon preparation on cytochrome P-450-dependent monooxygenase systems in cultures of primary mouse hepatocytes[J].Mol Pharmacol,1978,14 (4):672-681.〔4〕Michalopoulos,G.,Sattler,C.A.,Sattler,G.L.et al.Cytochrome P-450induction by phenobarbital and3-methylcholanthrene in primary cultures of hepatocytes[J].Science,1976,193(4256):907-909.〔5〕Seglen,P.O.Preparation of rat liver cells.3.Enzymat⁃ic requirements for tissue dispersion[J].Exp Cell Res, 1973,82(2):391-398.〔6〕张阳德,赖毅,赵俊玲.新生小鼠肝细胞的体外培养[J].中国现代医学杂志,2001,11(4).９２--. All Rights Reserved.。

原代肝细胞培养

原代肝细胞培养原代肝细胞培养1．实验材料灌流液：NaCl、KCl、NaH2PO4.2H2O、Na2HPO4.H2O、NaHCO3、HEPES、EDTA、Glucose （国药或阿拉丁）。

消化液：Collagenase IV（Yeasen，翊圣生物，产品货号：40510ES60，100 mg ，279￥）、CaCl2。

Percoll：Percoll（GE Healthcare，17-0891-02）我买的是分装的100ml，450￥的17-0891-01-1。

麻醉剂：10%水合氯醛。

实验器材：200目细胞筛、20ml 注射器、头皮针、手术剪3把、手术镊3把（实验前灭菌），细胞培养皿2个，离心机，实验前备冰盒及水浴锅，鼠板及大头针（实验前酒精及紫外消毒）。

2. 实验前准备1) 灌流液Perfusion SolutionNaCl KCl NaH2PO4.2H2O Na2HPO4.H2O NaHCO3 HEPES EDTA Glucose离子）。

用前37℃温育。

每只老鼠消耗15ml灌流液。

2）消化液100× CaCl2：560mg CaCl2，加入10 ml PBS/ ddH2O，分装-20℃保存。

10× CollagenaseIV：100 mgCollagenaseIV粉末溶于20 mlDMEM（无血清），0.22 uM滤膜过滤除菌，每管1.5ml分装。

消化液：13.5 mlDMEM（无血清）加入150 μl100× CaCl2（终浓度5 mM），再加入1.5 ml10× CollagenaseIV（终浓度0.5 mg/ml），于37℃温育。

每只老鼠消耗15ml消化液。

3）40%Percollg/L 8.0 0.4 0.078 0.151 0.35 2.380 0.19 0.9调节pH 7.2-7.4，配好后过滤除菌。

（不能高压灭菌，其中含葡萄糖及HCO3-16.2 ml 100%percoll原液，加入1.8 ml10×PBS，再加入27ml 1×PBS，得45 ml。

细胞原代培养PPT课件

3.过滤
• 用400目不锈钢筛网过滤 • 收集滤液于离心管 4.离心 • 平衡、离心5min，1000～1500 rpm • 去上清，加PBS，混匀，离心（同上） • 重复上一步 5.接种 • 去上清，加3～5ml培养基，混匀，接种于培养瓶 • 加培养基3～5mm深，盖紧盖，观察细胞密度 6.培养
针头）
有机试剂过滤除菌，常用0.22µm • 超净工作台
紫外灯照射30min以上 • 培养室
紫外灯照射2～3h/天
操作步骤
1.取材 • 75％酒精浸泡乳鼠2min，取肝脏于平皿中 • PBS溶液洗涤3次 • 去除液体后，剪碎成1～2mm3小块 2.消化 • 加5～8倍组织量的胰蛋白酶溶液 • 转移到离心管内，加盖 • 37℃水浴15min，每5min摇晃1次 • 终止消化：加1ml含血清的培养基DMEM
• 超净工作台紫外消毒，鼓风，保持干净、整洁
• 高压锅用电，带压力表，自动恒压，掌握时间
橡胶、塑料、药品——15’，金属——20’ • 培养瓶
玻璃瓶和塑料瓶，洗涤要干净，临时消毒
• 培养基 a.天然培养基：血清、胚胎浸出液、水解乳蛋白等 b.合成培养基：DMEM、RPMI1640、199培养基等 c.无血清培养基：Ham F12和DMEM混合的基础培养基、自行设计与配制的培养基（加其他成分）
a.组织块法：直接将组织块接种于培养瓶， 24小时就有细胞向四周游出。简便、易行，适合于来源有限、数量较少的组织做原代细胞培养
b.消化法
• 用酶消化、分解妨碍细胞生长的间质（基质、纤维等），形成单个细胞或细胞团
• 对上皮、肝、肾、胚胎等间质少、较软组织选择胰蛋白酶
• 对骨、前列腺、癌组织等纤维多、较硬的组织可用胶原酶

细胞生物学实验-小鼠肝细胞原代培养

小鼠肝细胞原代培养小鼠肝细胞原代培养实验目的：1.了解并掌握原代细胞培养的相关原理2.了解并掌握小鼠肝细胞原代培养的方法实验器材：二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿、烧杯、镊子、酒精棉、离心管、电动移液器、移液管、细胞计数板、幼鼠、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.125％胰蛋白酶（含0.1%胶原酶）、D-Hanks或者PBS等。

原代培养是从供体中取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。

原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织或细胞培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。

原代培养的组织或者细胞的生物学特性没有发生很大变化，仍具有二倍体遗传物质，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、基因表达测试、细胞分化等实验研究。

原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种成分组成，比较复杂，即使同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。

如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。

因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需要对原代培养的细胞进行短期传代后再进行（需要注意的是有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化）。

一般采用2-5代的细胞进行实验。

当然特殊情况和一些终端分化细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。

原代培养的方法很多，最基本和最常用的为组织块原代培养法和离散细胞原代培养法（消化法）。

组织块原代培养：组织块原代培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织，组织块原代培养法操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。

但由于培养过程中细胞移动受到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。

组织块培养的程序一般为：1.组织块修整：将组织块用平衡缓冲液反复冲洗，然后在灭菌的培养皿中剪碎至碎块的直径小于1mm3。

2.贴壁：将组织块间隔（小块之间的间隔为1cm）放在培养皿中，培养基需要浸没组织块底部但不能使组织块浮起。

小鼠原代肝细胞分离培养

小鼠原代肝细胞分离培养准备材料1.能够提供灌注速度为1-10mL/分钟的蠕动泵（我们用的是保定兰格的蠕动泵，某宝有售）；2.能够容纳50-100mL溶液的无菌容器；3.凹槽（可供放置操作台面并提供引流槽，我们用的是搪瓷实验盘+泡沫板的组合）；4.可维持37℃的水浴设备（即恒温水浴锅）；5.无菌100mL广口玻璃瓶；6.无菌50mL锥形管；7.一次性或可重复使用的70微米不锈钢过滤器（就是不锈钢滤网，查阅资料提示这里选用的滤网规格大概为200目左右）；8.细胞培养皿（直径10cm，即常说的大皿）；9.无菌器械，至少要有一把剪刀和两对细尖镊子；10.70%-75%酒精和去污剂（去污剂我们没有用过，只要小鼠备皮充分一般影响不大），均盛装于喷雾瓶中（碘剂可选）；11.麻醉剂，注射或吸入剂型均可（我们选用水合氯醛或戊巴比妥）；12.Vacutainer牌蝶型插管（我们选用BD公司的套管针）; 推荐小鼠体重：20g-40g（我们的建议是25g以上）；13.口罩；14. 每只小鼠2只吸水台垫（我们是用大量吸水纸代替吸水台垫铺在手术操作平台上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；15.动物操作台；16.胶带。

分离试剂1.前灌液：Hank's缓冲盐溶液（HBSS），使用不含钙镁离子、含0.5mM EGTA 的1x工作液；共需要大约 60ml-70ml；使用前预温至37℃；2.后灌液：IV型胶原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mM HEPES（低糖DMEM 和IV型胶原酶是必须的，HEPES缓冲液等等可以选择性加入）；共需要90ml。

注意确保所使用的DMEM含钙；使用前预温至37℃；3.分散液：IV型胶原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4℃预冷；4.IV型胶原酶;在消化液和分散液中，胶原酶的浓度至少要达到100胶原酶消化单位/ml（100CDU/ml）；（我们使用的是购自Gibco公司的IV型胶原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝细胞）；5.蒸馏水。

细胞原代培养课时课件PPT

完成了从体内环境到体外环境的过渡和适应过程，恢复了分裂增殖与生长发育的能力。
含义:包含 ①原代培养实质是初次培养，即培养物接种到培养器皿中就不再分割，任其生长繁殖； ②原代培养中的“代”并不是指细胞繁殖的 “代”数； ③原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液。
特点
(1)性质 ①性状似体内，可表达某些形态、结构、功能,
防腐(antisepsis)和防腐剂消化后组织不仅要尽量使消化液失活，以避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的细胞随漂洗而丢失。
影响胰蛋白酶作用的主要因素需及时传代传不传代及何时传代
根接据种的抑细胞数菌量 (bacteriostasis)
培养瓶皿的大小
无菌(asepsis) 培养条件
在一定程度上具有可人为操作的特征去除无用组织和避免干燥；有关数据的计算要事先做好。
【操作】
进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。
不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。
二、原代培养 Primary culture
1.细胞原代培养概论
概念
从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行传代之前的时期，一个特征性的必然的生长阶段。
浮生存。
特点发展过程
选择第二步: 时间数小时后至铺满 (汇合confluence) 变化数小时后至进一步选择中 3种情况:能增殖能存活不能存活细胞类型继续改变,至铺满
特点发展过程
选择第三步:
经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。
时间铺满后离开净化室必须断开必要的仪器电源；
【火焰消毒】进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。

原代肝细胞培养

试验动物:８～９周龄健康雌性小鼠１０只。

供试小鼠自由饮食，二级饲养，试验前２４ｈ禁食。

主要试剂:1.Solution C:480Mm KCL120Mm MgSO4120Mm KH2PO42.Buffer A(1L):NaCL 7gNaHCO3 2g1M HEPES Ph7.45 5mlSolution c 10mlGlucose 1gAdd ddw and adjust pH to 7.43.灌洗液A:Buffer A with 1Mm EGTA +PS 过滤，37度温浴待用4.灌洗液B（50ml）：Buffer A with 5Mm CaCL2, 25mg胶原酶IV + PS 过滤，37度温浴待用5.胶原酶Ⅳ，购自Ｓｉｇｍａ公司；6.ＲＰＭＩ－１６４０细胞培养液7.透析胎牛血清（ＦＢＳ）8.青霉素－链霉素双抗9.0.4%的Trypan Blue：0.4g Trypan Blue to 100ml ddw用NaOH调PH值7.2-7.3, 4度储存。

步骤:1.经腹部注射巴比妥钠（50-100ｍｇ／ｋｇ）麻醉供试小鼠，5-10min。

70％乙醇消毒皮肤后，将小鼠移至超净工作台，固定于消毒的聚乙烯泡沫板上.2.剪开小鼠腹部，剥离皮肤，将静脉留置针插入肝脏门静脉，剪开下腔静脉，灌注预热（37 ℃）的灌注液A，保持灌注液流速为10～15ｍＬ／ｍｉｎ3.至小鼠肝脏完全变灰黄、下腔静脉已无血丝流出时，改用３７～３８℃预热的灌注液B继续灌注小鼠肝脏，同时在下腔静脉插入留置针，通过医用输液管收集消化酶液，循环灌注液B，保持灌注液流速为10～15ｍＬ／ｍｉｎ，持续灌注10～15min，使肝脏完全充盈消化酶液；4.剪下整个肝脏组织，将肝脏置于60mm培养皿中用10％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ－１６４０细胞培养液终止消化，撕去肝包膜，用移液管轻轻吹吸两次，经100目网过滤到50ml离心管中，去除未消化肝脏组织块，补至30ml，于室温下1500转/分钟（50-80g）离心5ｍｉｎ重复2-3次，收集纯化的小鼠肝细胞，将纯化的小鼠肝脏细胞重悬于10ｍＬＲＰＭＩ－１６４０培养液中。

小鼠肝细胞原代培养ppt课件

小鼠肝细胞原代培养－消化法
1. 处死及消毒：脱颈处死小鼠, 浸入75%酒精中1min, 沥干。
2. 取材：剪开腹部皮肤,撕开皮肤,暴露腹膜, 打开腹腔取出肝脏。
3. 解剖：修剪除去肝门区血管结缔组织,剪取一块蚕豆大小的肝组织。
4. 剪切：把肝组织剪成1 ～ 2mm３小块, 用无血清培养液淋洗2～3次。
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5. 消化：将肝组织块移入小瓶中, 加8ml混合消化液, 37℃、40min, 每隔5～10min顺时针摇匀。
6. 过滤：消化液过100目筛网, 收集滤液, 移入离心管。
7.离心：离心800rpm, 5min, 吸弃上清液。
8. 洗涤：用无血清培养液离心洗涤１次。
9. 重悬浮及计数：用RPIM1640培养液(含10% 胎牛血清)重悬浮肝细胞, （取样计数）。
10.接种及培养：将细胞接种于培养瓶中, 密度为 106/ml (2×105/cm2), 37℃、5%CO2培养。
精选ppt
2
注意事项
根据组织类型选择适当的消化液。控制消化时间，尽量减少细胞损伤。尽快促进细胞贴壁，必要使用生长基质涂抹瓶壁，或先少量细胞悬液接种，培养3～5 h后，补足培养液。适当提高细胞接种密度。

细胞生物学实验-小鼠肝细胞原代培养

小鼠肝细胞原代培养小鼠肝细胞原代培养实验目的：1.了解并掌握原代细胞培养的相关原理2.了解并掌握小鼠肝细胞原代培养的方法实验器材：二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿、烧杯、镊子、酒精棉、离心管、电动移液器、移液管、细胞计数板、幼鼠、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.125％胰蛋白酶（含0.1%胶原酶）、D-Hanks或者PBS等。

原代培养是从供体中取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。

原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织或细胞培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。

原代培养的组织或者细胞的生物学特性没有发生很大变化，仍具有二倍体遗传物质，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、基因表达测试、细胞分化等实验研究。

原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种成分组成，比较复杂，即使同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。

如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。

因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需要对原代培养的细胞进行短期传代后再进行（需要注意的是有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化）。

一般采用2-5代的细胞进行实验。

当然特殊情况和一些终端分化细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。

原代培养的方法很多，最基本和最常用的为组织块原代培养法和离散细胞原代培养法（消化法）。

组织块原代培养：组织块原代培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织，组织块原代培养法操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。

但由于培养过程中细胞移动受到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。

组织块培养的程序一般为：1.组织块修整：将组织块用平衡缓冲液反复冲洗，然后在灭菌的培养皿中剪碎至碎块的直径小于1mm3。

2.贴壁：将组织块间隔（小块之间的间隔为1cm）放在培养皿中，培养基需要浸没组织块底部但不能使组织块浮起。

小鼠肝脏细胞原代培养

1瓶
RPMI1640培养液 1瓶
废片缸
1
（四）实验步骤
1.75%酒精棉球擦拭超净台，将试验所需试剂、耗材等置于超净台中紫外照射30min后，关闭紫外灯打开照明，通风15min。
2.取一只小鼠置于含乙醚的废片缸中使其麻醉，脱臼处死，75%酒精中浸泡并移置于超净工作台内，将小鼠放在无菌平皿中，用手术剪和镊子撕开腹部皮肤，再换一套手术剪和镊子剪开腹膜暴露内脏。
3.取另一无菌平皿，倒入少许PBS置于一旁备用 4.用镊子取出肝脏置于含有PBS的无菌平皿内,清洗2次，除去杂物后，用手术剪将肝脏剪成1mm³小块。
组织块法：
用镊子夹取组织块并将其转移到克氏瓶底部，组织块之间有一定间隔（5mm 左右），等组织块粘在克氏瓶上不滑动，将培养瓶翻转180度组织块朝上，加入 2ml含10%胎牛血清DMEM培养液，盖上瓶盖，做好标记，37℃ 5% CO2培养箱中静置培养4小时后待组织块完全粘在克氏瓶上轻轻翻转克氏瓶，使组织块浸入培养液中，隔天换一次液，观察细胞是否贴壁。
3.吸取上层清液加入到1.5mlEP管中，配平，800rpm，10min，离心。离心后弃上清，沉淀用1mlPBS重悬，吹打混匀，1000rpm离心10min，弃上清，加入RPMI1640(10%胎牛血清)1ml重悬，吸取20μl加入到含等体积0.4%台盼蓝的1.5mlEP管中，混匀吸取20μl血球计数板计数。
1.组织块法: 2.消化法:细胞数:
将细胞浓度调整到2*106个/ml，细胞稀释倍
细胞生长状态: 培养基颜色: 更换培养基次数:
（六）注意事项
1.工作台面上在实验前要用酒精棉擦，用品要布局合理。 2.用过的培养瓶、离心管等需及时清洗。 3.实验结束后及时清洗用过的玻璃器材、收拾台面、倒垃圾。

小鼠原代肝细胞培养

一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法1材料与方法1.1动物2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。

1.2试剂D-hank's液；消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)；消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP；基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）；小牛血清（BS，GIBCO公司提供）；培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。

1.3鼠肝组织块培养1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。

2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分；3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清，4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。

5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。

待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。

1.4鼠肝细胞单层培养动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。

原代小鼠肝细胞体外培养的研究

原代小鼠肝细胞体外培养的研究附图图２－１植块法培养３ｄ的肝细胞（ｘ１０）Ｆｉ９２－１Ｅｘｐｌａｎｔｓｃｕｌｔｕｒｅｄｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｆｏｒ３ｄａｙｓ图２－２分离细胞法培养３ｄ的肝细胞（×１０）Ｆｉ９２－２Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｄｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｆｏｒ３ｄａｙｓ图２－３经ＰＡＳ糖原染色的肝细胞ｐ７ＪＦｉ９２—３ＢｙＰＡＳｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ３３陕西科技大学硕士学位论文图２－４经台盼蓝染色的肝细胞（ｘ１０）Ｆｉ９２－４Ｂｙｔｒｙｐａｎｂｌｕｅｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ图２－５刚分离制备的肝细胞（ｘ４０）Ｆｉ９２－５Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｎｅｗｌｙｉｓｏｌａｔｅｄｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ原代小鼠肝细胞体外培养的研究图３－３Ａｌｂ分泌量图３—４培养第３天细胞密度Ｆｉ９３··３ＡｌｂｓｅｃｒｅｔｉｏｎＦｉ９３－４Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｄｅｎｓｉｔｙｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ３ｄａｙｓ根据ｐＨ变化的缓慢程度、培养第三天细胞密度的高低、Ｕｒｅａ和Ａｌｂ生成量、稳定性的综合比较，最后选择转速为１５００ｒ／ｒａｉｎ。

３．３．１．２离心时间的研究图３－５培养上清．旋ｐＨ变化图３－６Ｕｒｅａ生成量Ｆｉ９３—５ＨｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｃｕｌｔｕｒｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｐＨｃｈａｎｇｅＦｉ９３·６Ｕｒｅａｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ图３－７Ａｌｂ分泌量图３－８培养第３天细胞密度Ｆｉ９３—７ＡｌｂｓｅｃｒｅｔｉｏｎＦｉ９３—８Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｄｅｎｓｉｔｙｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ３ｄａｙｓ根据ｐＨ变化的缓慢程度、细胞密度的高低、Ｕｒｅａ和Ａｌｂ生成量、稳定性的综合比较，最后选择离心时间１５ｍｉｎ。

陕西科技大学硕士学位论文３．３．１．３合成培养液ｐＨ的研究图３－９培养上清波ｐＨ变化Ｆｉ９３·９ＨｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｃｕｌｔｕｒｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｐＨｃｈａｎｇｅ图３一１０Ｕｒｅａ生成量Ｆｉ９３·１０Ｕｒｅａｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ图３－１１Ａｌｂ分泌量图３－１２培养第３天细胞密度Ｆｉ９３··１１ＡｌｂｓｅｃｒｅｔｉｏｎＦｉ９３－１２Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｄｅｎｓｉｔｙｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ３ｄａｙｓ根据培养上清液ｐＨ变化的缓慢程度、细胞密度的高低、上清液中Ｕｒｅａ和Ａｌｂ生成量、稳定性的比较，最后选择合成培养液ｐＨ７．２０．３．３．１．４发酵液加量的研究图３－１３培养上清液ｐＨ变化Ｆｉ９３—１３ＨｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｃｕｌｔｕｒｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｐＨｃｈａｎｇｅ图３－１４Ｕｒｅａ生成量Ｆｉ９３－１４Ｕｒｅａｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ。

《原代细胞培养实验》PPT课件

❖ 11)让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。可采用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。
❖ 12)为确定现有细胞浓度，加入0.2ml细胞悬液于1.8ml 1％醋酸溶液中以裂解红细胞，用血细胞计数器进行细胞计数。（细胞记数方法见传代培养课件）
❖ 13)按每细胞瓶I x 106细胞的数量接种于10ml组织培养液中，在饱和湿度的37℃ C02培养箱中孵育直至细胞铺满。
❖ 2. 100ml灭菌烧杯2个；
❖ 3、50ml离心筒2个
❖ 4、灭菌培养皿1个，细胞培养瓶1个
❖ 4、1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌玻璃搅拌棒1个
❖ 5、细胞计数板1块；
❖ 6、灭好菌的镊子1把，剪刀1把；
❖ 7、酒精灯1台；
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试验操作步骤：
❖ 1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)
❖ 8.计数完毕，用双蒸水清洗细胞计数板和盖玻片。用擦净纸擦干。
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❖ 每毫升细胞总数 =
❖ [(A1+B1+C1+D1+E1)+(A2+B2+C2+D2+E2)]
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观察培养情况
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3在无菌状态下将绞碎的胚胎转移于一50ml的无菌离加入40ml025的无菌胰蛋白酶用搅拌棒轻轻搅动4在温暖的环境中或置于37c培养箱中轻轻摇动15分5让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中该管内按照每10ml上清加入lml小牛血清的比例加入牛血清以灭活胰蛋白酶
❖ f．漂洗胚胎，去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。

分小鼠肝脏原代细胞-整理版

1、在前一天晚上铺三明治培养基的下层胶：100ml超纯水+114ul冰醋酸，然后到细胞房超净台用0.22um的滤膜过滤后加入1.6ml 的I型鼠尾胶原后铺板6-well plate：1000ul12-well plate：500ul24-well plate：250ul96-well plate：30ul铺板后晃荡混匀，打开盖子置于超净台中，开紫外灯过夜，第二天吸弃上层液体，收起plate备用（若要放置长时间，则要用封口膜）；2、在前一天确认buffer1、beffer2（未加酶）是否准备好Buffer1：1*EBSS，0.5mM EGTA，无Ca、Mg；Buffer2：1*EBSS，0.2mg/ml 胶原酶IV，10mM HEPES（500ml；1.191g），2mM CaCl（500ml；0.11g）两种buffer都用NaHCO3调pH至7.3~7.5，不可低于7.3；3、当天上午器材灭菌，两个铁饭盒，one for剪刀，小镊子，橡胶管，细线，another for三个筛子，2把弯头镊子,1把剪刀；两个fisher瓶子装过滤后的buffer1,buffer2；4、准备30ml的WEM（或DMEM）置于4°，盛放剥下的肝脏；预先打开37°水浴槽两个；buffer1,buffer2过滤除菌，并置于37°中预热；检查泵是否正常工作；※灌流一只20g左右的小鼠肝脏，buffer1需100ml即够，buffer2需60ml，加0.18mg/ml 的胶原酶IV。

5、解剖腹腔与胸腔之间的部分，找到门静脉顺行插管，（橡皮管内径为4.8mm），先用buffer1灌注，调节流速为3.1rpm（约5ml/min），灌流6min。

然后用buffer2，调节流速为3.1rpm，将60mlbuffer2灌完（最好控制在8min内）；6、剪下肝脏组织放至预先放在4°冰箱的WEM中；去细胞房预冷离心机7、准备4-5个10cm dish，将肝脏并WEM一并倒入dish清洗一下，转入倒有DMEM的dish中，用镊子轻轻撕去肝脏表面一层膜（撕时要抖动，以便干细胞掉下来），再将肝脏转入新dish中继续撕；8、将dish中的细胞悬液倒入筛子中，用新dish盛接，筛下来的细胞悬液转移至50ml离心管；9、初步离心，50g，2min，4°，吸弃上清；离心过程中配制梯度离心液：5ml 10*PBS + 45ml percoll + 50ml DMEM10、加25ml梯度离心液重悬（先加2ml重悬，再补加）：1500rpm 8min，4°，吸弃上清；离心过程中配制PM液11、加30ml DMEM重悬50g，2min，4°，吸弃上清；12、重复步骤11（可不重复）；13、加入PM 5ml（根据细胞量来决定加多少），混匀后计数6孔板，2ml，5*10E5个/ml14、4h后换PM液（PM要预热）24h后换成FM液（若铺上胶则不能预热）。