小鼠肝实质细胞原代培养方法及鉴定

伸展、呈圆形、椭圆形及多边形．细胞核体Baidu Nhomakorabea较大，其中有许 多双核的肝细胞．细胞浆为颗粒状，细胞边界轮廓清晰可见 （图 １）．
图 １ 倒置相差显微镜 Ａ（８８×）Ｂ Ｂ（２２０×）Ｃ（８８０×） ３．２ 肝细胞鉴定 ３．２．１ 采用 Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ １８ 的抗体进行肝细胞免疫荧光染 色鉴定［１，２］，显示细胞染上绿色荧光，细胞轮廓清晰（图 ２）．
关键词：小鼠；肝细胞；原代培养；鉴定 中图分类号：Ｒ９６５．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３－ ２６０Ｘ（２０１２）１２－ ００９１－ ０２
建立体外的原代肝细胞培养模型，用于肝细胞分子生 物学特征的研究，在肝病研究中发挥日益重要的作用．本研 究采用改良的灌流方法将肝脏中的肝实质细胞分离、纯化、 体外培养．为肝细胞体外实验研究奠定基础． 1 材料与方法 １．１ 材料
（赤峰学院 医学院，内蒙古 赤峰 ０２４０００）
摘 要：目的：寻求一种简单的原代小鼠肝细胞培养方法．方法 采用Ⅳ型胶原酶原位灌流方法分离肝细胞，并采用免疫 荧光和透射电镜方法对其进行鉴定．结果：光镜下细胞贴附、伸展、呈圆形、椭圆形及多边形．细胞核体积较大，其中有许多双核 的肝细胞．细胞浆为颗粒状，细胞边界轮廓清晰可见．采用 Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ １８ 的抗体进行肝细胞免疫荧光染色鉴定，显示细胞染 上绿色荧光，细胞轮廓清晰．采用透射电镜鉴定，细胞在电镜下均可见到：肝细胞上有大量微绒毛，细胞间有特征性的紧密连 接以及毛细胆管．胞浆内有丰富的细胞器．结论：成功地在体外培养了小鼠肝细胞并对其进行了鉴定，为进一步的实验研究奠 定基础．
提前 ３０ 分钟打开恒温装置，用 ７５％ 酒精 １００ｍｌ 清洗 灌流装置，然后用 １００ｍｌ 含双抗的 Ｄ－ Ｈａｎｋ’ｓ－ ＥＤＴＡ（ＮａＣｌ ８．０ｇ，ＫＣｌ ０．４ｇ，ＮａＨＣＯ３ ０．３５ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４ ·１２Ｈ２Ｏ ０．０６ｇ， ＫＨ２ＰＯ４ ０．０６ｇ，ＥＤＴＡ ０．２ｇ，Ｇｌｕｃｏｓｅ １．０ｇ，硫酸链霉素 ０．１ｇ， 青霉素 Ｇ 钠 ０．０６ｇ）溶液清洗灌流装置，烧杯内留 ２０ｍｌ 灌流 肝脏；小鼠 ６％水合氯醛麻醉后，置入 ７５％酒精中浸泡 ５ 分 钟，转移至木板四肢固定；铺无菌巾，腹部”Ｕ”型切口，暴露 出门静脉，分离门静脉，远端穿线并结扎；开胸腔，止血钳夹 住心尖，分离下腔静脉，下腔静脉下穿线备用，眼科剪在右 心房剪一个小口，将 ＰＥ５０ 聚乙烯导管插入下腔静脉结扎； 门静脉远端用眼科剪剪一个小口，止血钳夹住腹腔的腹腔 静脉及其分支；打开蠕动泵，用 Ｄ－ Ｈａｎｋ’ｓ－ ＥＤＴＡ 溶液灌流 至肝脏发白，将门静脉用动脉夹夹住，改用 ５％的Ⅳ型胶原 酶 ４５ｍｌ 灌流，直至全部灌完；铺无菌巾暴露出肝脏，将胸腔
ＳＰＦ（ｓｐｅｃｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）级雄性 Ｃ５７ＢＬ／６ 小鼠，体重 ２０～２５ｇ，由中国科学院上海实验动物中心提供．Ⅳ型胶原酶 购自 ｓｉｇｍａ 公司，高糖 ＤＭＥＭ 干粉、Ｉｎｓｕｌｉｎ－ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ－ Ｓｅｌｅ－ ｎｉｕｍ 购自 Ｇｉｂｃｏ 公司．Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ １８ 抗体购自 ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ 公 司．ＦＩＴＣ 标记的羊抗小鼠 ＩｇＧ 购自上海博蕴生物公司． 其余 试剂均为国产分析纯．鼠尾胶自制．Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ 灌流装置购 自保定兰格恒流泵有限公司．超级恒温槽购自上海衡平仪器 厂． １．２ 小鼠原代肝细胞培养方法
第 ２８ 卷 第 １２ 期（下） ２０１２ 年 １２ 月
赤 峰 学 院 学 报（ 自 然 科 学 版 ） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｆｅｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）
Ｖｏｌ． ２８ Ｎｏ．１２ Ｄｅｃ ２０１２
小鼠肝实质细胞原代培养方法及鉴定
郝丹丹，张凤宁，瑞 云，叶冬梅，贾晓丽，杨立新，乌英嘎
细胞接种到 １２ｍｍ×１２ｍｍ 盖玻片上，培养至铺满 ８０％ 左右；４％多聚甲醛室温固定 ２０～３０ｍｉｎ，用 ＰＢＳ 洗 ３ 遍；１％ 羊血清 ＋０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ 室温封闭 ３０ｍｉｎ；用封闭液稀释一抗 （１：１００），滴加到含细胞的盖玻片上；４℃冰箱孵育过夜；ＰＢＳ 洗 ３ 遍，每次 １０ｍｉｎ；封闭液稀释二抗（１：２００），滴加到含细 胞的盖玻片上；４℃冰箱避光孵育过夜；ＰＢＳ 洗 ３ 遍，每次 １０ｍｉｎ；１０％缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察，摄像（注意： 实验中设置不加一抗，只加二抗的阴性对照）． ２．２ 透射电镜鉴定
的下腔静脉剪断，棉签将胸腔内的血液吸干，切断肝脏周围 的血管，将肝脏移入烧杯；将取下的肝脏移入超净台内，摘 除胆囊，剥离肝脏包膜，用 ２０ｍｌ 培养液将肝脏吹散，混匀液 体用 ２００ 目筛网过滤至另一烧杯内，收集置入离心管中． １０００ 转 ／ 分钟，８ 分钟，弃上清；培养液重悬细胞沉淀，１０００ 转 ／ 分钟，８ 分钟，离心 ２ 次；接种加入 ４０ｍｌ 含有 １０％胎牛 血清和 １％ Ｉｎｓｕｌｉｎ－ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ－ Ｓｅｌｅｎｉｕｍ 的 ＤＭＥＭ 含双抗 悬浮沉淀，并用吸管充分吹打混匀． 接种于铺鼠尾胶的 ６０ｍｍ 培养皿中． 置于 ３７℃二氧化碳恒温培养箱中静置培 养．４ 小时后换培养液，去掉不贴壁的细胞．以后隔 ２ 天换一 次培养液． 2 细胞鉴定 ２．１ 免疫荧光鉴定
将培养生长成单层的细胞用刮匙刮下，２．５％戊二醛固 定细胞，１％锇酸再固定，环氧树脂包埋，超薄切片机切片，透 射电镜下观察细胞的显微结构． 3 结果 ３．１ 光镜观察
Ｏｌｙｍｐｕｓ 光镜下培养 ４ｈ 活细胞已基本贴壁，此时换液 以去除血细胞及死细胞． 肝细胞培养 １２ｈ 后可见细胞贴附、
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图２ ３．２．２ 采用透射电镜进行肝细胞鉴定，细胞在电镜下均可 见到［１］：肝细胞上有大量微绒毛，细胞间有特征性的紧密连 接以及毛细胆管．胞浆内有丰富的细胞器，如大量内质网，包 括粗面内质网及滑面型内质网，大量的线粒体，其中有典型 的车轮状线粒体，大量玫瑰花瓣形的糖原颗粒等细胞器（图 ３）． 4 讨论