小鼠肝实质细胞原代培养方法及鉴定
遗传学实验课：实验一肝细胞的原代分离与培养
血球计数板使用方法
• 静置片刻，待细胞沉降到计数板，不再随液 体漂流
• 如细胞位于大方格的双线上，计数时则数上 线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
血球计数板使用方法
• 计数重复3次，取其平均值 • 使用完毕，用自来水清洗血球计数板，勿用
硬物洗刷
• 计数板计算公式
细胞数/ml=(4个大方格内的细胞数/4)×104×稀释倍数
细胞存活率计算
• 细胞存活率=活细胞数/细胞总数×100%
思考题
• 1、什么是细胞的原代培养与传代培养？ • 2、除了台酚蓝染液，还有哪些染液可用于细胞死活
的鉴定？ • 3、简述采用灌流方法分离肝细胞的技术有哪些？ • 4、血球计数板的使用方法及注意事项？并计算本实
验中的细胞数量。
操作步骤
3、用手术剪将肝脏剪成小块（约1mm3）， 再用玻片充分研磨，转移到离心管，离心 1000 rpm，5min。
注意：玻片研磨既需要充分又不能用力太大
操作步骤
4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5mL）胰酶， 37℃水浴中消化20分钟，每隔5分钟振荡一 次，或用吸管轻柔吹打一次，使细胞分离。
操作步骤
2、用针头将小鼠四肢固定在泡沫板上,腹部朝上。镊 子捏起腹部皮肤，剪刀剪一小口，暴露腹壁。
注意：不要一刀剪破腹壁，这样毛容易进入腹腔， 里面就不是无菌的了。 镊子夹起腹壁，剪开腹腔，取出肝脏，置于培养 皿中，剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移 到另一个盛有PBS液的平皿中。
镊子捏起腹部皮肤，剪刀剪一小口，暴露腹壁。 镊子夹起腹壁，剪开腹腔，取出肝脏，
9、细胞计数前，先用台酚蓝染料染色，细胞悬液与 0.4%台酚蓝溶液以9:1混合均匀，用血球计数板计 数，计数活细胞。
小鼠提原代肝细胞原理
小鼠提原代肝细胞原理
小鼠提原代肝细胞是一种实验室技术，用于研究和探索肝脏生物学和疾病机制。
其原理主要包括以下几个步骤：
1. 鼠标准备：选取适合的小鼠作为实验对象，例如常用的实验小鼠品种如C57BL/6等。
2. 消化和分离：通过注射合适的麻醉药物使小鼠进入无意识状态，然后进行腹腔解剖，取出肝脏组织。
将肝脏组织切碎并进行酶消化，将肝细胞从其他细胞分离出来。
3. 培养和传代：将分离得到的原代肝细胞放入适当的培养基中，并提供适宜的营养物质和环境条件，使其在培养皿中继续生长和增殖。
当细胞充分增殖并达到一定密度时，可以进行传代，即将细胞从原培养皿中分离并重新分配到新的培养皿中。
4. 鉴定和确认：对传代后的细胞进行鉴定和确认，例如通过形态学观察、细胞计数、细胞功能检测等方法，确保细胞的纯度和活性。
同时，可使用特异性标记物如肝细胞特异性蛋白等进行免疫染色，确认细胞的特异性。
通过小鼠提原代肝细胞，科研人员可以获得高质量的原代肝细胞样本，用于开展各种疾病模型、药物筛选和机制研究等实验。
该技术为肝脏疾病的治疗和预防提供了重要的实验基础。
细胞毒理学实验一小鼠肝细胞原代培养
6. 用手术剪将肝脏剪成小块（1mm3）,无血清培养基 冲洗三次。
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7. 将组织转移到一次性培养皿中，排列贴附于皿底。 组织块间间隔约0.5-1cm,静置数分钟。
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8. 待组织粘附后，缓缓加入含血清的培养基，切勿 将组织块冲起，做好标记，转入培养箱培养，镜 检观察。
② 实验后，请将解剖器械、离心管冲洗干净（自来水-去 离子水-三蒸水），放入烘箱烘干，超净工作台内擦拭 干净，酒精喷洒消毒，并将酒精擦干净，打开紫外灯 灭菌。
③ 各个实验小组的同学负责将垃圾带走，值日生打扫实 验室卫生。
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光源
目镜 光亮度调节
电源开关
环状光阑
物镜 粗/细准焦螺旋
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取出的剩余肝组织充分剪碎后，用剪过的蓝枪头将其转入离心 管，1000rpm离心5min，弃上清，根据组织量的多少加入 0.25%胰蛋白酶1-1.5ml。
37℃水浴消化约10-15min，每间隔5min，振荡一次，促使 细胞分离。
待组织变得疏松，略发白时，加入1ml含血清的DMEM培养 基，终止胰蛋白酶的消化作用。
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1. 总结原代培养的实验步骤以及在操作过程中需要 注意的问题。
2. 绘图表示所观察到的实验结果，并对其予以分析。
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1. 你认为原代培养中最关键的步骤是什么？为什么？ 2. 在毒理实验的检测中，原代培养细胞具有什么样
的优势？
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2. 将胎鼠或新生小鼠引颈处死，置于75%消毒酒精浸 泡2~3s，带入超净工作台。
小鼠肝实质细胞原代培养方法及鉴定
Vo l.28No .12Dec 2012赤峰学院学报(自然科学版)J o urnal o f Chifeng University (Natural S cience Editio n )第28卷第12期(下)2012年12月建立体外的原代肝细胞培养模型,用于肝细胞分子生物学特征的研究,在肝病研究中发挥日益重要的作用.本研究采用改良的灌流方法将肝脏中的肝实质细胞分离、纯化、体外培养.为肝细胞体外实验研究奠定基础.1材料与方法1.1材料S P F (special pathog en free )级雄性C57BL/6小鼠,体重20～25g ,由中国科学院上海实验动物中心提供.Ⅳ型胶原酶购自sig ma 公司,高糖DMEM 干粉、Insulin-Transferrin-S ele-nium 购自Gibco 公司.C yto keratin 18抗体购自santa cruz 公司.FITC 标记的羊抗小鼠Ig G 购自上海博蕴生物公司.其余试剂均为国产分析纯.鼠尾胶自制.Langendo rff 灌流装置购自保定兰格恒流泵有限公司.超级恒温槽购自上海衡平仪器厂.1.2小鼠原代肝细胞培养方法提前30分钟打开恒温装置,用75%酒精100ml 清洗灌流装置,然后用100ml 含双抗的D-Hank ’s-EDTA (NaC l 8.0g ,KCl0.4g ,NaHC O 30.35g ,Na 2HP O 4·12H 2O0.06g ,KH 2P O 40.06g ,EDTA 0.2g ,Gluco se 1.0g ,硫酸链霉素0.1g ,青霉素G 钠0.06g )溶液清洗灌流装置,烧杯内留20ml 灌流肝脏;小鼠6%水合氯醛麻醉后,置入75%酒精中浸泡5分钟,转移至木板四肢固定;铺无菌巾,腹部”U ”型切口,暴露出门静脉,分离门静脉,远端穿线并结扎;开胸腔,止血钳夹住心尖,分离下腔静脉,下腔静脉下穿线备用,眼科剪在右心房剪一个小口,将P E50聚乙烯导管插入下腔静脉结扎;门静脉远端用眼科剪剪一个小口,止血钳夹住腹腔的腹腔静脉及其分支;打开蠕动泵,用D-Hank ’s-EDTA 溶液灌流至肝脏发白,将门静脉用动脉夹夹住,改用5%的Ⅳ型胶原酶45ml 灌流,直至全部灌完;铺无菌巾暴露出肝脏,将胸腔的下腔静脉剪断,棉签将胸腔内的血液吸干,切断肝脏周围的血管,将肝脏移入烧杯;将取下的肝脏移入超净台内,摘除胆囊,剥离肝脏包膜,用20ml 培养液将肝脏吹散,混匀液体用200目筛网过滤至另一烧杯内,收集置入离心管中.1000转/分钟,8分钟,弃上清;培养液重悬细胞沉淀,1000转/分钟,8分钟,离心2次;接种加入40ml 含有10%胎牛血清和1%Insulin-Transferrin-S elenium 的DMEM 含双抗悬浮沉淀,并用吸管充分吹打混匀.接种于铺鼠尾胶的60mm 培养皿中.置于37℃二氧化碳恒温培养箱中静置培养.4小时后换培养液,去掉不贴壁的细胞.以后隔2天换一次培养液.2细胞鉴定2.1免疫荧光鉴定细胞接种到12m m ×12mm 盖玻片上,培养至铺满80%左右;4%多聚甲醛室温固定20～30m in ,用PBS 洗3遍;1%羊血清+0.05%Triton 室温封闭30min ;用封闭液稀释一抗(1:100),滴加到含细胞的盖玻片上;4℃冰箱孵育过夜;PBS 洗3遍,每次10min ;封闭液稀释二抗(1:200),滴加到含细胞的盖玻片上;4℃冰箱避光孵育过夜;P BS 洗3遍,每次10min ;10%缓冲甘油封片,荧光显微镜下观察,摄像(注意:实验中设置不加一抗,只加二抗的阴性对照).2.2透射电镜鉴定将培养生长成单层的细胞用刮匙刮下,2.5%戊二醛固定细胞,1%锇酸再固定,环氧树脂包埋,超薄切片机切片,透射电镜下观察细胞的显微结构.3结果3.1光镜观察Olym pus 光镜下培养4h 活细胞已基本贴壁,此时换液以去除血细胞及死细胞.肝细胞培养12h 后可见细胞贴附、小鼠肝实质细胞原代培养方法及鉴定郝丹丹,张凤宁,瑞云,叶冬梅,贾晓丽,杨立新,乌英嘎(赤峰学院医学院,内蒙古赤峰024000)摘要:目的:寻求一种简单的原代小鼠肝细胞培养方法.方法采用Ⅳ型胶原酶原位灌流方法分离肝细胞,并采用免疫荧光和透射电镜方法对其进行鉴定.结果:光镜下细胞贴附、伸展、呈圆形、椭圆形及多边形.细胞核体积较大,其中有许多双核的肝细胞.细胞浆为颗粒状,细胞边界轮廓清晰可见.采用Cytokera tin 18的抗体进行肝细胞免疫荧光染色鉴定,显示细胞染上绿色荧光,细胞轮廓清晰.采用透射电镜鉴定,细胞在电镜下均可见到:肝细胞上有大量微绒毛,细胞间有特征性的紧密连接以及毛细胆管.胞浆内有丰富的细胞器.结论:成功地在体外培养了小鼠肝细胞并对其进行了鉴定,为进一步的实验研究奠定基础.关键词:小鼠;肝细胞;原代培养;鉴定中图分类号:R965.1文献标识码:A文章编号:1673-260X (2012)12-0091-02９１--. All Rights Reserved.图1倒置相差显微镜A(88×)B B(220×)C(880×)图2图3透射电镜下的肝细胞伸展、呈圆形、椭圆形及多边形.细胞核体积较大,其中有许多双核的肝细胞.细胞浆为颗粒状,细胞边界轮廓清晰可见(图1).3.2肝细胞鉴定3.2.1采用Cytokeratin18的抗体进行肝细胞免疫荧光染色鉴定[1,2],显示细胞染上绿色荧光,细胞轮廓清晰(图2).3.2.2采用透射电镜进行肝细胞鉴定,细胞在电镜下均可见到[1]:肝细胞上有大量微绒毛,细胞间有特征性的紧密连接以及毛细胆管.胞浆内有丰富的细胞器,如大量内质网,包括粗面内质网及滑面型内质网,大量的线粒体,其中有典型的车轮状线粒体,大量玫瑰花瓣形的糖原颗粒等细胞器(图3).4讨论本文采用改良的S eg len[3-5]二步灌注法分离培养C57BL/6小鼠肝细胞,采用无Ca2+、Mg2+的Hank’s-EDTA液及胶原酶原位两步灌注法,去除红细胞效果好,所分离的肝细胞较纯,细胞存活率高且节约胶原酶.实验操作时需注意以下几点:插管动作轻柔迅速,手术时间不宜过长;肝脏灌流以及移入超净台内的过程中要严格保持无菌.与乳鼠肝组织块外植培养和肝组织块胶原酶消化法[6]比较,本方法比较简单,时间短,分离的细胞存活率较高,是种简单可靠的肝细胞分离方法,是普通实验室开展肝细胞培养值得借鉴的方法.———————————————————参考文献:〔1〕Lazaro,C.A.,Croager,E.J.,Mitchell,C.et al.Estab⁃lishment,characterization,and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes[J].Hepatology, 2003,38(5):1095-1106.〔2〕Ku,N.O.,Liao,J.,Omary,M.B.Phosphorylation of human keratin18serine33regulates binding to14-3-3proteins[J].EMBO J,1998,17(7):1892-1906.〔3〕Renton,K.W.,Deloria,L.B.,Mannering,G.J.Ef⁃fects of polyribonoinosinic acid polyribocytidylic acid and a mouse interferon preparation on cytochrome P-450-dependent monooxygenase systems in cultures of primary mouse hepatocytes[J].Mol Pharmacol,1978,14 (4):672-681.〔4〕Michalopoulos,G.,Sattler,C.A.,Sattler,G.L.et al.Cytochrome P-450induction by phenobarbital and3-methylcholanthrene in primary cultures of hepatocytes[J].Science,1976,193(4256):907-909.〔5〕Seglen,P.O.Preparation of rat liver cells.3.Enzymat⁃ic requirements for tissue dispersion[J].Exp Cell Res, 1973,82(2):391-398.〔6〕张阳德,赖毅,赵俊玲.新生小鼠肝细胞的体外培养[J].中国现代医学杂志,2001,11(4).９２--. All Rights Reserved.。
细胞生物学实验-小鼠肝细胞原代培养
小鼠肝细胞原代培养小鼠肝细胞原代培养实验目的：1.了解并掌握原代细胞培养的相关原理2.了解并掌握小鼠肝细胞原代培养的方法实验器材：二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿、烧杯、镊子、酒精棉、离心管、电动移液器、移液管、细胞计数板、幼鼠、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.125％胰蛋白酶（含0.1%胶原酶）、D-Hanks或者PBS等。
原代培养是从供体中取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。
原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织或细胞培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。
原代培养的组织或者细胞的生物学特性没有发生很大变化，仍具有二倍体遗传物质，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、基因表达测试、细胞分化等实验研究。
原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种成分组成，比较复杂，即使同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。
如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。
因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需要对原代培养的细胞进行短期传代后再进行（需要注意的是有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化）。
一般采用2-5代的细胞进行实验。
当然特殊情况和一些终端分化细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。
原代培养的方法很多，最基本和最常用的为组织块原代培养法和离散细胞原代培养法（消化法）。
组织块原代培养：组织块原代培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织，组织块原代培养法操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。
但由于培养过程中细胞移动受到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。
组织块培养的程序一般为：1.组织块修整：将组织块用平衡缓冲液反复冲洗，然后在灭菌的培养皿中剪碎至碎块的直径小于1mm3。
2.贴壁：将组织块间隔（小块之间的间隔为1cm）放在培养皿中，培养基需要浸没组织块底部但不能使组织块浮起。
小鼠原代肝细胞分离培养
小鼠原代肝细胞分离培养准备材料1.能够提供灌注速度为1-10mL/分钟的蠕动泵（我们用的是保定兰格的蠕动泵，某宝有售）；2.能够容纳50-100mL溶液的无菌容器；3.凹槽（可供放置操作台面并提供引流槽，我们用的是搪瓷实验盘+泡沫板的组合）；4.可维持37℃的水浴设备（即恒温水浴锅）；5.无菌100mL广口玻璃瓶；6.无菌50mL锥形管；7.一次性或可重复使用的70微米不锈钢过滤器（就是不锈钢滤网，查阅资料提示这里选用的滤网规格大概为200目左右）；8.细胞培养皿（直径10cm，即常说的大皿）；9.无菌器械，至少要有一把剪刀和两对细尖镊子；10.70%-75%酒精和去污剂（去污剂我们没有用过，只要小鼠备皮充分一般影响不大），均盛装于喷雾瓶中（碘剂可选）；11.麻醉剂，注射或吸入剂型均可（我们选用水合氯醛或戊巴比妥）；12.Vacutainer牌蝶型插管（我们选用BD公司的套管针）; 推荐小鼠体重：20g-40g（我们的建议是25g以上）；13.口罩；14. 每只小鼠2只吸水台垫（我们是用大量吸水纸代替吸水台垫铺在手术操作平台上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；15.动物操作台；16.胶带。
分离试剂1.前灌液：Hank's缓冲盐溶液（HBSS），使用不含钙镁离子、含0.5mM EGTA 的1x工作液；共需要大约 60ml-70ml；使用前预温至37℃；2.后灌液：IV型胶原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mM HEPES（低糖DMEM 和IV型胶原酶是必须的，HEPES缓冲液等等可以选择性加入）；共需要90ml。
注意确保所使用的DMEM含钙；使用前预温至37℃；3.分散液：IV型胶原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4℃预冷；4.IV型胶原酶;在消化液和分散液中，胶原酶的浓度至少要达到100胶原酶消化单位/ml（100CDU/ml）；（我们使用的是购自Gibco公司的IV型胶原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝细胞）；5.蒸馏水。
小鼠原代肝细胞培养及细胞增殖的分子机制研究
小鼠原代肝细胞培养及细胞增殖的分子机制研究细胞增殖是生物体生长和发育的重要过程，也是生物体不断更新、修复和再生的关键环节。
肝脏是一个细胞增殖活跃的器官，在肝脏组织受到损伤时，原代肝细胞从G0期重新进入G1期，进行增殖复制，以恢复受损组织。
因此，研究原代肝细胞的培养和细胞增殖分子机制，对于治疗肝脏疾病和肿瘤有重要的意义。
一、小鼠原代肝细胞培养方法小鼠原代肝细胞培养可采取悬浮培养法或贴壁培养法，其中贴壁培养法是最常用的方法之一。
贴壁培养法分为单层培养和三维培养两种方式。
单层培养法是将小鼠肝细胞分离和培养在含有培养基和血清等营养物质的培养皿上，细胞可以黏附于培养皿底部形成单层肝细胞。
这种培养方法常用于细胞增殖和分化实验中。
三维培养法则是将肝细胞培养在类似于肝实质的支架中，使之形成三维结构，这种培养方法可用于肝脏疾病和肝细胞转化研究。
二、小鼠原代肝细胞增殖与细胞周期细胞增殖是一种高度有序的生物过程，受到一系列分子间相互作用的调节。
在小鼠原代肝细胞中，增殖过程主要分为细胞周期的四个时期：G1期、S期、G2期和M期。
其中，S期是DNA合成期，在这期间，DNA聚合酶启动并开始合成新的DNA链。
细胞周期主要受到细胞因子、信号转导途径和细胞周期蛋白等分子的调节。
其中CDK4和CDK6是G1期调节蛋白，它们与细胞周期蛋白D（CyclinD）结合，促进细胞从G1期进入S期。
细胞周期调节蛋白CDK1和CyclinB主要调节细胞从G2期进入M期。
同时，Tp53，Rb等一些肿瘤抑制蛋白也起到重要作用，它们在癌症等疾病中的失调造成了DNA损伤修复的延迟和细胞周期的异常。
三、小鼠原代肝细胞增殖的信号通路小鼠原代肝细胞增殖不仅受到细胞周期调节蛋白的调节，在信号通路的调节下也会发生变化。
目前已知的信号通路包括Wnt/β-catenin信号通路，TGF-β信号通路，VEGF信号通路等。
Wnt/β-catenin信号通路的激活可以促进小鼠原代肝细胞增殖，同时也与肝癌细胞的形成有关。
原代肝细胞培养方法
原代肝细胞培养方法原代肝细胞培养是一种重要的技术手段，它可以使我们更好地理解肝细胞的生物学特性和功能，同时也被广泛应用于药物筛选、毒性研究和肝脏疾病模型的建立。
本文将探讨原代肝细胞培养的方法。
原代肝细胞是从动物（如小鼠、大鼠、猪等）或人体新鲜肝组织中分离得到的肝细胞。
它们具有种独立性和细胞特异性功能，是进行体外研究的理想模型细胞。
原代肝细胞培养的主要步骤包括：肝组织的分离、肝细胞的分离和纯化、肝细胞的培养和维持。
首先，肝组织的分离是原代肝细胞培养的起始步骤。
一般来说，选择健康的动物或人体捐赠的新鲜肝组织，快速解剖分离，并将其置于含有冷蘸过消毒的生理盐水或缓冲液的离心管中。
然后，用小剪刀对肝组织进行切细，使其暴露于细胞分离液或酶溶液中。
常用的细胞分离液包括肝素-胰酶、胰酶、胶原酶、凝集酶及胰蛋白酶。
这些酶能够降解结缔组织，使肝细胞从肝组织中游离出来。
接下来，肝细胞的分离和纯化是确保原代肝细胞培养成功的关键一步。
一般而言，将细胞分离液转移至新离心管，并用对应的培养基对其停滞，使浮游的肝细胞顺应性地附着在组织培养器皿的底部。
在培养基的作用下，非肝细胞（如纤维细胞和非肝上皮细胞）会悬浮离开，而肝细胞则紧密附着在培养器皿上。
此时，我们可以通过控制等粘附时间、细胞数目、培养基的组分和浓度，使纯化程度达到最佳。
然后，肝细胞的培养和维持是原代肝细胞培养的持续关键步骤。
首先，选择合适的培养基是非常重要的。
常用的培养基包括DMEM、威利精简培养基和L-15培养基等。
这些培养基中会添加适量的营养物质（如葡萄糖、氨基酸和维生素）和生长因子（如胰岛素、胆固醇和转铁蛋白）。
其次，细胞密度的控制也非常重要。
通常，当细胞趋于稳定时，可以通过减少培养皿内细胞的数量来避免细胞互相竞争和过度分泌胺碱酸等蛋白质。
此外，保持培养环境的稳定也是原代肝细胞培养的重要环节。
温度、湿度、CO₂浓度和培养基的更新等因素都会对肝细胞的生长和功能有一定的影响。
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Ｏｌｙｍｐｕｓ 光镜下培养 ４ｈ 活细胞已基本贴壁，此时换液 以去除血细胞及死细胞． 肝细．２．２ 采用透射电镜进行肝细胞鉴定，细胞在电镜下均可 见到［１］：肝细胞上有大量微绒毛，细胞间有特征性的紧密连 接以及毛细胆管．胞浆内有丰富的细胞器，如大量内质网，包 括粗面内质网及滑面型内质网，大量的线粒体，其中有典型 的车轮状线粒体，大量玫瑰花瓣形的糖原颗粒等细胞器（图 ３）． 4 讨论
的下腔静脉剪断，棉签将胸腔内的血液吸干，切断肝脏周围 的血管，将肝脏移入烧杯；将取下的肝脏移入超净台内，摘 除胆囊，剥离肝脏包膜，用 ２０ｍｌ 培养液将肝脏吹散，混匀液 体用 ２００ 目筛网过滤至另一烧杯内，收集置入离心管中． １０００ 转 ／ 分钟，８ 分钟，弃上清；培养液重悬细胞沉淀，１０００ 转 ／ 分钟，８ 分钟，离心 ２ 次；接种加入 ４０ｍｌ 含有 １０％胎牛 血清和 １％ Ｉｎｓｕｌｉｎ－ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ－ Ｓｅｌｅｎｉｕｍ 的 ＤＭＥＭ 含双抗 悬浮沉淀，并用吸管充分吹打混匀． 接种于铺鼠尾胶的 ６０ｍｍ 培养皿中． 置于 ３７℃二氧化碳恒温培养箱中静置培 养．４ 小时后换培养液，去掉不贴壁的细胞．以后隔 ２ 天换一 次培养液． 2 细胞鉴定 ２．１ 免疫荧光鉴定
第 ２８ 卷 第 １２ 期（下） ２０１２ 年 １２ 月
赤 峰 学 院 学 报（ 自 然 科 学 版 ） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｆｅｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）
Ｖｏｌ． ２８ Ｎｏ．１２ Ｄｅｃ ２０１２
小鼠肝实质细胞原代培养方法及鉴定
郝丹丹，张凤宁，瑞 云，叶冬梅，贾晓丽，杨立新，乌英嘎
伸展、呈圆形、椭圆形及多边形．细胞核体积较大，其中有许 多双核的肝细胞．细胞浆为颗粒状，细胞边界轮廓清晰可见 （图 １）．
图 １ 倒置相差显微镜 Ａ（８８×）Ｂ Ｂ（２２０×）Ｃ（８８０×） ３．２ 肝细胞鉴定 ３．２．１ 采用 Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ １８ 的抗体进行肝细胞免疫荧光染 色鉴定［１，２］，显示细胞染上绿色荧光，细胞轮廓清晰（图 ２）．
提前 ３０ 分钟打开恒温装置，用 ７５％ 酒精 １００ｍｌ 清洗 灌流装置，然后用 １００ｍｌ 含双抗的 Ｄ－ Ｈａｎｋ’ｓ－ ＥＤＴＡ（ＮａＣｌ ８．０ｇ，ＫＣｌ ０．４ｇ，ＮａＨＣＯ３ ０．３５ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４ ·１２Ｈ２Ｏ ０．０６ｇ， ＫＨ２ＰＯ４ ０．０６ｇ，ＥＤＴＡ ０．２ｇ，Ｇｌｕｃｏｓｅ １．０ｇ，硫酸链霉素 ０．１ｇ， 青霉素 Ｇ 钠 ０．０６ｇ）溶液清洗灌流装置，烧杯内留 ２０ｍｌ 灌流 肝脏；小鼠 ６％水合氯醛麻醉后，置入 ７５％酒精中浸泡 ５ 分 钟，转移至木板四肢固定；铺无菌巾，腹部”Ｕ”型切口，暴露 出门静脉，分离门静脉，远端穿线并结扎；开胸腔，止血钳夹 住心尖，分离下腔静脉，下腔静脉下穿线备用，眼科剪在右 心房剪一个小口，将 ＰＥ５０ 聚乙烯导管插入下腔静脉结扎； 门静脉远端用眼科剪剪一个小口，止血钳夹住腹腔的腹腔 静脉及其分支；打开蠕动泵，用 Ｄ－ Ｈａｎｋ’ｓ－ ＥＤＴＡ 溶液灌流 至肝脏发白，将门静脉用动脉夹夹住，改用 ５％的Ⅳ型胶原 酶 ４５ｍｌ 灌流，直至全部灌完；铺无菌巾暴露出肝脏，将胸腔
（赤峰学院 医学院，内蒙古 赤峰 ０２４０００）
摘 要：目的：寻求一种简单的原代小鼠肝细胞培养方法．方法 采用Ⅳ型胶原酶原位灌流方法分离肝细胞，并采用免疫 荧光和透射电镜方法对其进行鉴定．结果：光镜下细胞贴附、伸展、呈圆形、椭圆形及多边形．细胞核体积较大，其中有许多双核 的肝细胞．细胞浆为颗粒状，细胞边界轮廓清晰可见．采用 Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ １８ 的抗体进行肝细胞免疫荧光染色鉴定，显示细胞染 上绿色荧光，细胞轮廓清晰．采用透射电镜鉴定，细胞在电镜下均可见到：肝细胞上有大量微绒毛，细胞间有特征性的紧密连 接以及毛细胆管．胞浆内有丰富的细胞器．结论：成功地在体外培养了小鼠肝细胞并对其进行了鉴定，为进一步的实验研究奠 定基础．
关键词：小鼠；肝细胞；原代培养；鉴定 中图分类号：Ｒ９６５．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３－ ２６０Ｘ（２０１２）１２－ ００９１－ ０２
建立体外的原代肝细胞培养模型，用于肝细胞分子生 物学特征的研究，在肝病研究中发挥日益重要的作用．本研 究采用改良的灌流方法将肝脏中的肝实质细胞分离、纯化、 体外培养．为肝细胞体外实验研究奠定基础． 1 材料与方法 １．１ 材料
ＳＰＦ（ｓｐｅｃｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）级雄性 Ｃ５７ＢＬ／６ 小鼠，体重 ２０～２５ｇ，由中国科学院上海实验动物中心提供．Ⅳ型胶原酶 购自 ｓｉｇｍａ 公司，高糖 ＤＭＥＭ 干粉、Ｉｎｓｕｌｉｎ－ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ－ Ｓｅｌｅ－ ｎｉｕｍ 购自 Ｇｉｂｃｏ 公司．Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ １８ 抗体购自 ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ 公 司．ＦＩＴＣ 标记的羊抗小鼠 ＩｇＧ 购自上海博蕴生物公司． 其余 试剂均为国产分析纯．鼠尾胶自制．Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ 灌流装置购 自保定兰格恒流泵有限公司．超级恒温槽购自上海衡平仪器 厂． １．２ 小鼠原代肝细胞培养方法
细胞接种到 １２ｍｍ×１２ｍｍ 盖玻片上，培养至铺满 ８０％ 左右；４％多聚甲醛室温固定 ２０～３０ｍｉｎ，用 ＰＢＳ 洗 ３ 遍；１％ 羊血清 ＋０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ 室温封闭 ３０ｍｉｎ；用封闭液稀释一抗 （１：１００），滴加到含细胞的盖玻片上；４℃冰箱孵育过夜；ＰＢＳ 洗 ３ 遍，每次 １０ｍｉｎ；封闭液稀释二抗（１：２００），滴加到含细 胞的盖玻片上；４℃冰箱避光孵育过夜；ＰＢＳ 洗 ３ 遍，每次 １０ｍｉｎ；１０％缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察，摄像（注意： 实验中设置不加一抗，只加二抗的阴性对照）． ２．２ 透射电镜鉴定