破伤风类毒素单克隆抗体的制备及初步鉴定精品

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破伤风类毒素单克隆抗体的制备及初步鉴定作者：张秀昌刘芳崔萍孙黎罗强贾天军

【摘要】目的：制备并鉴定破伤风类毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株，为破伤风的快速检测及致病机制的研究提供实验材料。方法：用破伤风类毒素做抗原免疫BALB/C小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，获得分泌高滴度针对破伤风类毒素的杂交瘤细胞株，测定单抗免疫球蛋白亚类及单抗效价，用间接ELISA 和Western blot检测单克隆细胞株的特异性。结果：通过细胞融合和克隆化，筛选出3株持续分泌抗破伤风类毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E12、1E11、1G10。间接ELISA和Western blot检测结果表明1E12、1E11、1G10可以和破伤风类毒素发生特异性反应。结论：成功制备了抗破伤风类毒素单克隆抗体，为制备免疫诊断试剂盒和抗体药物的开发奠定了基础。【关键词】破伤风类毒素；杂交瘤；单克隆抗体

【ABSTRACT】 Objective: To establish and prepare hybridoma cell line secreting monoclonal antibody (McAb) against tetanic toxoid, to develop a rapid assay for Tetanus and investigate the pathogenesis of the virus. Methods: BALB/c mouse was immunized by purified tetanic toxoid. Hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies (McAbs) against tetanic toxoid were screened after the fusion of mouse splenic cells with SP2/0 cells. The Ig subtypes and titer of the McAbs were assayed with EL ISA

and Western blot assay. Results: After cell fusion and subcloning, three hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies specifically against tetanic toxoid were obtained, and respectively named as 1E12, 1E11 and 1G10. Indirect EL ISA and Western blot assay showed that the McAbs 1E12, 1E11 and 1G10 could specifically recognize tetanic toxoid. Conclusion: The specific anti tetanic toxoid McAbs are developed and these McAbs may be useful in the development of detection assay and basic research of the pathogenesis of Tetanus.

【KEY WORDS】 Tetanic toxoid; Hybridoma cell line; Monoclonal natibodies

破伤风梭状杆菌是引起破伤风的病原菌，当机体受到外伤，创口被污染，或分娩时使用不洁器械剪断脐带等，本菌可侵入局部创面而引起外源性感染，发芽繁殖，释放毒素,在发展中国家，新生儿破伤风死亡率可高达90%。目前对破伤风的诊断主要根据典型的症状和病史。单克隆抗体用于诊断感染性疾病具有灵敏度高、特异性强的特点，在许多疾病的诊断中已得到广泛应用。本实验首次成功制备破伤风类毒素单克隆抗体，为单抗应用于破伤风的临床诊断奠定了基础。

1 资料与方法

1．1 试剂、毒素、细胞与实验动物破伤风类毒素由北京生物制品监定所提供。福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂购自北京市普京康生物工程技术有限公司。BALB/C小鼠购自首都医科大学动物室。SP2/0细胞

由北京肿瘤研究所惠赠。聚乙二醇（PEG，MW1000，）为天津天泰精细化学品有限公司产品。HAT为美国GIBCOBRL公司产品。羊抗鼠IgG酶标抗体为北京天象鑫龙生物医学科技有限公司进口分装产品。

1.2 小鼠免疫雌性、6周龄、17ｇ左右BALB/C小鼠，后腿肌肉及背部皮内注射破伤风类毒素免疫，第一次100μg加等量福氏完全佐剂，3周后用100μg加等量福氏不完全佐剂，7周后500μg不加佐剂腹腔注射，腹腔注射后第4天进行细胞融合。

1．3 细胞融合腹腔注射后第4天取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞在50%聚乙二醇作用下融合。融合后的杂交瘤细胞用含20%进口胎牛血清的HAT选择性培养基混均加入种有饲养细胞的96孔板中培养，2周后在倒置显微镜下挑选克隆孔。

1．4 ELISA筛选以破伤风类毒素（1.5/mL）为抗原包被酶标板，封闭后加碱和杂交瘤细胞培养上清液37℃ 20min，洗涤后加HRP标记的羊抗鼠IgG（工作浓度1∶2000），37℃孵育20min后洗涤，加邻苯二胺（OPD）底物显色15min后终止反应。以上各步均以PBST洗涤3次，3min/次。同时设阴性、阳性和空白对照，筛选出能分泌抗体的杂交瘤细胞。

1．5 亚克隆化培养及腹水诱生筛选出阳性单抗后进行常规的有限稀释直至克隆细胞抗体阳性率为100%。对最后筛选出的三株阳性单克隆细胞进行扩大培养，同时对三株杂交瘤细胞进行反复冻存和复苏，每次复苏后其培养上清液均做ELISA。复苏已建株的三株杂交瘤细胞经传代取对数生长期的细胞计数，小鼠腹腔接种5×105/只。一周后诱