显微操作技术(全面)PPT课件
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显 微 操 作 仪
显微操作技术包括
• 细胞拆合：把完整细胞的细胞核与细胞质用特殊的方 法分离开来，或把细胞核从细胞质中吸取出来，或用 紫外线等把细胞中的核杀死，然后再把同种或异种的 细胞核和细胞质重新组合起来，培育新的细胞或新的 生物个体。
• 细胞重组：细胞融合技术与细胞核质分离技术结合， 在融合介质作用下，使胞质体与完整细胞合并，重新 构成胞质杂种细胞的过程。
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优势(意义)
• 充分发挥雌性个体的繁殖潜力 • 缩短供体本身的繁殖周期 • 保持供体优良特性 • 大规模繁殖 • 节约成本\费用 • 可用于保护珍稀动物 • ……
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在20世纪60年代以来，对家畜胚胎的采取、保 存、移植等技术环节进行了大量的试验研究工作， 取得不少进展。
20世纪70年代以后，胚胎的移植技术可以说 发展到在畜牧生产中实际应用的阶段。
• 胚胎工程：显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显 微切割等．
细胞核移植技术已有几十年的历史,Gordon等人(1962)对 非洲爪蟾进行核移植获得成功。我国著名学者童第周等在鱼类 细胞核移植方面进行了许多工作．并取得了丰硕成果．近年来 国内外又相继获得哺乳动物卵核移殖的后代。显微注射技术的 应用也很广泛．1980年,Gordon等人首次将重组的病毒DNA用显 微注射法注入小鼠受精卵的原核中，在78只出生鼠中通过 Southern杂交．发现3只携带有注射的DNA．这是通过原核显微 注射法首次获得的转基因小鼠．显微切割技术则用于胚胎和染 色体的显微切割等。显微操作技术已成为细胞遗传学、生化细 胞学、胚胎发育以及基因工程等研究中的重要技术方法．
二、注射针
将外径lmm,内径0.8mm的毛细玻管固定在拉针器上。调好拉力强度 和电热丝温度，即可拉针。再将拉好的针在磨针器上磨出一45°斜口。 也可用单面刀片在橡皮垫上切成带斜面的针尖，然后在显微工具制作器 (microforge)上加工针尖部，使其锐利、光滑，便于刺入细胞。用于细 胞注射的针口直径为10～13微米。 DNA注射者的口径不足l微米,显微镜 下观察不到是否开口，只有试注射才可确定是否适用。一般DNA注射针 拉制后直接使用，不需再处理，因为在磨针器上加工会造成较大的口径 而不易控制注射量。且每次注射后，因压力降低、产生回流，使DNA浓 度降低。
胚胎移植的实质
胚胎移植实质上是早期胚胎在 相同生理环境条件下空间位置 的转换，而胚胎本身的遗传物 质并不发生改变，因此各种性 状均能保持其原来的优良特性。
微 细 胞 杂 种 细 胞 的 制 作
• 核移植起始于用微吸管对阿米巴等原生动物进行的 核操作。
• 在1952年，美国人罗伯特·布里格斯和T·J·金，首先 利用两栖类卵细胞建立细胞核移植技术。由于两栖 类的蛙卵数量较多，体积较大，容易获得，操作方 便。
• 1958—1962年，英国剑桥大学的约翰·格登教授和麦 金尼尔利用瓜蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可 育的非洲瓜蟾。
近些ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ来，胚胎移植技术已在动物引种和改 良方面广泛应用，已成为体外受精、嵌合体、转 基因和克隆动物实现的应用技术，试管牛、转基 因猪和克隆羊均是通过胚胎移植途径生出的。
(二)胚胎移植的基本原则
1.胚胎移植前后所处环境的同一性 （１）供体和受体在分类学上的相同属性 （２）动物生理上的一致性 （３）动物解剖部位的一致性 2.胚胎发育的期限 3.胚胎的质量
非洲爪蟾制作
• ，哺乳类的移核实验必须在显微操作仪下才能进行。
• 最早用来做移核试验的哺乳动物是小鼠。
1977年，美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室用“亚 无性繁殖”的方式，培育出7只单亲小鼠。
1981年1月，美国《科学》杂志封面刊登3只小鼠的 照片，他们将囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵 中，经培养移核卵发育至囊胚期，再将胚胎植入同步孕 鼠的子宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，并发育成了可育 的个体。
核移植小鼠
第三节 胚胎显微操作技术
3.1胚胎移殖
胚胎移植（embryo transfer）：将动物 的早期胚胎移植到与胚胎相对应生理状态的雌 性受体子宫中，使之发育为成熟的个体。
提供胚胎的个体称为供体，接受胚胎的个 体称为受体。
提供胚胎的个体为 “供体”，接受胚 胎的个体为“受 体”，不管供体还 是受体动物都应为 雌性个体。
四、移卵针 取外径I. 5mm,长lOOmm的毛细玻管
，在酒精灯上加热后用手拉出一段内径为 180微米的细管，用砂轮断成平口，再在 酒精灯上进行钝化以免移卵时损伤子宫壁 。
利用细胞融合技术得到的重组细胞
1、2、3亲本细胞 • 4、6核体 • 5、7胞质体 • 8、9杂种细胞 • 10重组细胞 • 11胞质杂种细胞 • ⅠPEG介导 • ⅡHAT培养基筛选
显微操作技术
显微操作技术(micromanipulation technique)是指在高倍复式显微镜下．利用显 微操作器(micrcmanipulator)进行细胞或早期 胚胎操作的一种方法．
显微操作器用以控制显微注射针或吸管（固定针管）在 显微镜视野内移动的、精确的机械装置。一般装在显微 镜载物台的两侧．也可装在显微镜的前面或一侧。
三、微型吸管 微型吸管主要用于移植细胞核，要求管口表面平滑无损
，口径要略大于细胞核而又小于单个细胞。制作过程为将直径 2mm,壁厚0.05mm,长10cm的毛细玻璃管固定在拉针器上，调好拉 力强度和电热丝温度，拉成微管。如热度过高，拉成的吸管没 有开口。这时则应在显微工具制作器上再加工成口径合适的微 型吸管，若无拉针器和显微工具制作器．也可用手工操作，在 酒精灯上将毛细管加热拉成吸管。
显微工具的制作
一、持卵针 持卵针管是在显微注射时用来固定胚胎或卵的工具．由
毛细玻璃管拉制而成。将长7cm、直径1.0-1.25mm的毛细玻璃 管洗净、烤干后．在拉针器上拉成细针状。在外径100-120微 米的部位．用玻璃刀断成平口．用加热的白金丝靠近平口的 端部钝化并缩小至所需口径一般用于小鼠卵的管口直径为 20～30微米,兔卵者为50～70微米,在使用前把针管在酒精灯 火焰上加工成下图所示的形状。
显微操作技术包括
• 细胞拆合：把完整细胞的细胞核与细胞质用特殊的方 法分离开来，或把细胞核从细胞质中吸取出来，或用 紫外线等把细胞中的核杀死，然后再把同种或异种的 细胞核和细胞质重新组合起来，培育新的细胞或新的 生物个体。
• 细胞重组：细胞融合技术与细胞核质分离技术结合， 在融合介质作用下，使胞质体与完整细胞合并，重新 构成胞质杂种细胞的过程。
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优势(意义)
• 充分发挥雌性个体的繁殖潜力 • 缩短供体本身的繁殖周期 • 保持供体优良特性 • 大规模繁殖 • 节约成本\费用 • 可用于保护珍稀动物 • ……
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在20世纪60年代以来，对家畜胚胎的采取、保 存、移植等技术环节进行了大量的试验研究工作， 取得不少进展。
20世纪70年代以后，胚胎的移植技术可以说 发展到在畜牧生产中实际应用的阶段。
• 胚胎工程：显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显 微切割等．
细胞核移植技术已有几十年的历史,Gordon等人(1962)对 非洲爪蟾进行核移植获得成功。我国著名学者童第周等在鱼类 细胞核移植方面进行了许多工作．并取得了丰硕成果．近年来 国内外又相继获得哺乳动物卵核移殖的后代。显微注射技术的 应用也很广泛．1980年,Gordon等人首次将重组的病毒DNA用显 微注射法注入小鼠受精卵的原核中，在78只出生鼠中通过 Southern杂交．发现3只携带有注射的DNA．这是通过原核显微 注射法首次获得的转基因小鼠．显微切割技术则用于胚胎和染 色体的显微切割等。显微操作技术已成为细胞遗传学、生化细 胞学、胚胎发育以及基因工程等研究中的重要技术方法．
二、注射针
将外径lmm,内径0.8mm的毛细玻管固定在拉针器上。调好拉力强度 和电热丝温度，即可拉针。再将拉好的针在磨针器上磨出一45°斜口。 也可用单面刀片在橡皮垫上切成带斜面的针尖，然后在显微工具制作器 (microforge)上加工针尖部，使其锐利、光滑，便于刺入细胞。用于细 胞注射的针口直径为10～13微米。 DNA注射者的口径不足l微米,显微镜 下观察不到是否开口，只有试注射才可确定是否适用。一般DNA注射针 拉制后直接使用，不需再处理，因为在磨针器上加工会造成较大的口径 而不易控制注射量。且每次注射后，因压力降低、产生回流，使DNA浓 度降低。
胚胎移植的实质
胚胎移植实质上是早期胚胎在 相同生理环境条件下空间位置 的转换，而胚胎本身的遗传物 质并不发生改变，因此各种性 状均能保持其原来的优良特性。
微 细 胞 杂 种 细 胞 的 制 作
• 核移植起始于用微吸管对阿米巴等原生动物进行的 核操作。
• 在1952年，美国人罗伯特·布里格斯和T·J·金，首先 利用两栖类卵细胞建立细胞核移植技术。由于两栖 类的蛙卵数量较多，体积较大，容易获得，操作方 便。
• 1958—1962年，英国剑桥大学的约翰·格登教授和麦 金尼尔利用瓜蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可 育的非洲瓜蟾。
近些ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ来，胚胎移植技术已在动物引种和改 良方面广泛应用，已成为体外受精、嵌合体、转 基因和克隆动物实现的应用技术，试管牛、转基 因猪和克隆羊均是通过胚胎移植途径生出的。
(二)胚胎移植的基本原则
1.胚胎移植前后所处环境的同一性 （１）供体和受体在分类学上的相同属性 （２）动物生理上的一致性 （３）动物解剖部位的一致性 2.胚胎发育的期限 3.胚胎的质量
非洲爪蟾制作
• ，哺乳类的移核实验必须在显微操作仪下才能进行。
• 最早用来做移核试验的哺乳动物是小鼠。
1977年，美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室用“亚 无性繁殖”的方式，培育出7只单亲小鼠。
1981年1月，美国《科学》杂志封面刊登3只小鼠的 照片，他们将囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵 中，经培养移核卵发育至囊胚期，再将胚胎植入同步孕 鼠的子宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，并发育成了可育 的个体。
核移植小鼠
第三节 胚胎显微操作技术
3.1胚胎移殖
胚胎移植（embryo transfer）：将动物 的早期胚胎移植到与胚胎相对应生理状态的雌 性受体子宫中，使之发育为成熟的个体。
提供胚胎的个体称为供体，接受胚胎的个 体称为受体。
提供胚胎的个体为 “供体”，接受胚 胎的个体为“受 体”，不管供体还 是受体动物都应为 雌性个体。
四、移卵针 取外径I. 5mm,长lOOmm的毛细玻管
，在酒精灯上加热后用手拉出一段内径为 180微米的细管，用砂轮断成平口，再在 酒精灯上进行钝化以免移卵时损伤子宫壁 。
利用细胞融合技术得到的重组细胞
1、2、3亲本细胞 • 4、6核体 • 5、7胞质体 • 8、9杂种细胞 • 10重组细胞 • 11胞质杂种细胞 • ⅠPEG介导 • ⅡHAT培养基筛选
显微操作技术
显微操作技术(micromanipulation technique)是指在高倍复式显微镜下．利用显 微操作器(micrcmanipulator)进行细胞或早期 胚胎操作的一种方法．
显微操作器用以控制显微注射针或吸管（固定针管）在 显微镜视野内移动的、精确的机械装置。一般装在显微 镜载物台的两侧．也可装在显微镜的前面或一侧。
三、微型吸管 微型吸管主要用于移植细胞核，要求管口表面平滑无损
，口径要略大于细胞核而又小于单个细胞。制作过程为将直径 2mm,壁厚0.05mm,长10cm的毛细玻璃管固定在拉针器上，调好拉 力强度和电热丝温度，拉成微管。如热度过高，拉成的吸管没 有开口。这时则应在显微工具制作器上再加工成口径合适的微 型吸管，若无拉针器和显微工具制作器．也可用手工操作，在 酒精灯上将毛细管加热拉成吸管。
显微工具的制作
一、持卵针 持卵针管是在显微注射时用来固定胚胎或卵的工具．由
毛细玻璃管拉制而成。将长7cm、直径1.0-1.25mm的毛细玻璃 管洗净、烤干后．在拉针器上拉成细针状。在外径100-120微 米的部位．用玻璃刀断成平口．用加热的白金丝靠近平口的 端部钝化并缩小至所需口径一般用于小鼠卵的管口直径为 20～30微米,兔卵者为50～70微米,在使用前把针管在酒精灯 火焰上加工成下图所示的形状。