荧光和化学发光分析法
原子发射光谱,荧光光谱,化学发光谱的区别
原子发射光谱、荧光光谱和化学发光光谱是分析化学中常见的光谱技术，它们在原子结构分析和元素检测等方面具有重要的应用价值。
然而，这三种光谱具有不同的原理和特点。
下面将分别介绍原子发射光谱、荧光光谱和化学发光光谱的区别。
一、原子发射光谱1. 原理：原子发射光谱是利用原子在能级跃迁时所发射的特征光谱线进行分析的一种技术。
当原子受到激发能量后，原子的电子会跃迁至较高的能级，而后再跃迁至较低的能级时会发射出特征波长的光谱线。
通过测量这些特征光谱线的强度和波长，可以确定样品中各种元素的含量和种类。
2. 应用：原子发射光谱广泛应用于金属材料分析、环境污染物检测、地质勘探等领域，尤其在工业生产中具有重要的应用价值。
3. 优势：原子发射光谱的灵敏度高、测定范围广，能够同时检测多种元素，具有较高的分析精度和准确度。
二、荧光光谱1. 原理：荧光光谱是利用物质在受到紫外光激发后，发射出荧光光谱进行分析的一种技术。
当样品受到紫外光激发后，部分分子会吸收能量并跃迁至激发态，随后分子会再跃迁至基态并发射出荧光光谱，通过测量荧光光谱的强度和波长，可以得到样品的成分和结构信息。
2. 应用：荧光光谱在生物医学、材料科学、环境监测等领域具有广泛的应用，尤其在生物分析和药物检测中得到广泛应用。
3. 优势：荧光光谱对于生物分子具有较高的灵敏度和选择性，能够实现实时、非破坏性的分析。
三、化学发光光谱1. 原理：化学发光光谱是利用化学反应产生的发光进行分析的一种技术。
当两种或多种试剂混合后，在化学反应的作用下产生的化学发光可以被测定，通过测量化学发光的强度和时间，可以获得样品的化学成分和反应动力学信息。
2. 应用：化学发光光谱广泛应用于医学诊断、食品安全检测、环境监测等领域，尤其在微量分析和实时检测方面具有重要意义。
3. 优势：化学发光光谱对于微量物质具有较高的检测灵敏度和快速响应性，适用于多种复杂样品的分析。
原子发射光谱、荧光光谱和化学发光光谱分别具有不同的原理和应用特点，它们在元素分析和化学反应动力学研究中发挥着重要的作用。
化学发光和荧光的性质与应用
化学发光和荧光的性质与应用化学发光和荧光是一种具有独特性质和应用的化学现象。
这一现象在科学、工业、医药等领域有着广泛的应用。
化学发光，也称为化学发光分析或化学发光测定，是一种利用化学反应发生时产生的光来分析化合物的方法。
这种方法具有灵敏度高、分析速度快、对样品的数量要求低等优点，因此被广泛应用于环境监测、食品检测、医药研究等领域。
其中，最具代表性的化学发光方法是电化学发光法和化学发光酶标法。
电化学发光法利用电化学反应产生的活性中间体在后续反应中发生化学发光的方法。
这种方法对微量物质具有高度灵敏度，因此常被用于分析无机和有机化合物等微量物质。
化学发光酶标法则是利用化学发光酶标记化合物的方法进行检测。
这种方法处理简单，样品数量要求低，因此在食品、药品、环境检测等领域得到广泛应用。
荧光是一种发射可见光或紫外线的现象。
荧光分为自发荧光和诱导荧光两种类型。
其中，自发荧光通常是一些化合物在受到紫外线、X射线或自然光刺激后，从低能态激发至高能态，然后再退到低能态时发出的光。
而诱导荧光则是在化合物发生化学反应过程中，受到某些物质的激发而发出光。
荧光的应用领域广泛，如环境检测、医药研究、生物成像等。
其中，荧光成像技术则是一种用于研究生物过程和诊断疾病的重要手段。
通过对受体蛋白、细胞膜等进行染色，可以直接观察到这些物质在细胞内的动态变化。
同时，荧光成像技术在抗癌药物筛选、生物传感器等领域也有着广泛的应用。
在化学发光和荧光应用的同时，也面临着一些问题。
例如，荧光染料的选择和性能优化，化学发光方法的准确性和可靠性等。
因此，未来需要通过不断的技术创新和研究来解决这些问题，推动化学发光和荧光技术的应用和发展。
免疫荧光层析法 化学发光
免疫荧光层析法化学发光免疫荧光层析法（Immunofluorescence Assay，简称IFA）和化学发光（Chemiluminescence）是两种常用的检测技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物工程等领域。
本文将介绍这两种技术的原理、步骤和应用，以及它们之间的区别和优缺点。
免疫荧光层析法是一种利用抗体与特定抗原结合后可发出荧光信号的检测方法。
它的原理是将标记有荧光染料（如荧光素）的抗体与待检样品中的目标抗原结合，形成免疫复合物。
通过荧光显微镜观察，可以检测到目标抗原的存在与否。
这种方法具有高灵敏度、高特异性和无需放射性标记物的优点，被广泛应用于病原微生物的检测、抗体的定量和细胞蛋白的定位等研究领域。
化学发光是一种利用化学反应产生的光信号来检测目标物质的方法。
它的原理是将待检样品中的目标物与标记有化学发光底物的抗体结合，形成免疫复合物。
当加入特定的激发剂后，底物会发生化学反应，产生可见的光信号。
通过光电倍增管或摄像机的检测，可以定量地测量化学发光强度，从而判断目标物的含量。
化学发光方法具有高灵敏度、宽线性范围和较低的背景信号等优点，因此在临床诊断和生物工程领域得到广泛应用。
免疫荧光层析法和化学发光在实验步骤上存在一些差异。
免疫荧光层析法的步骤包括样品制备、抗体标记、免疫反应、洗涤和显微镜观察等。
而化学发光的步骤则包括样品制备、抗体标记、免疫反应、洗涤和化学反应等。
两种方法的原理都是基于抗体与抗原的特异性结合，但在标记物和检测信号的产生上有所不同。
免疫荧光层析法和化学发光在应用上也存在一些差异。
免疫荧光层析法常用于检测细胞表面标记物、病原微生物和抗体等，广泛应用于免疫学研究和临床诊断。
而化学发光常用于检测肿瘤标志物、药物残留和基因表达等，被广泛应用于药物研发和生物工程领域。
两种方法在不同领域有着各自的优势和适用范围。
总的来说，免疫荧光层析法和化学发光是两种常用的生物分析技术，具有高灵敏度、高特异性和广泛应用的特点。
第5章 荧光分析法与化学发光分析法
散射光的影响
瑞利散射光
拉曼散射光
干扰荧光测定，应采取措施消除
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硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱
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5.1.3
荧光分光光度计
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1. 激发光源
高压氙灯 ——强谱线的连续光谱
连续分布在250-700nm波长范围内，尤其是300-400nm波 长之间的谱线强度几乎相等
汞灯 ——线光谱
高压：近紫外区365nm,398nm，405nm，436nm，546nm，579nm 低压:紫外区，最强254nm
－Cl、－Br、－I等
第三类取代基：－R、－SO3H、－NH3＋等
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3．影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 pH值的影响
荧光熄灭剂的影响
散射光的干扰
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温度和溶剂
温度：温度升高，荧光物质的荧光效率 和荧光强度下降 溶剂：溶剂极性增大，荧光波长随着而 长移，荧光强度增强；溶剂粘度减小， 荧光强度减小
化学发光分析主要用于定量分析。 1．化学发光强度与反应物浓度的关系
I Cl （t）＝ Cl dc A dt
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2．常用发光试剂
（1）鲁米诺类 （2）光泽精类
（3）钌(Ⅱ)-联吡啶配合物
（4）其它化学发光试剂
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5.2.5 应用与示例
1．无机化合物的分析 可以利用某些具有还原性的无 机阳离子和发光试剂作用对其进行测定；有些离子对 化学发光反应有增强或抑制作用，基于此，可直接测 定此类离子。此外，可利用置换偶合反应间接测定某 些离子。 2．有机化合物的分析 可以利用物质的还原性，直接 被氧化剂氧化发光测定。
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3．液相化学发光
常用的发光物质有鲁米诺、光泽精、洛粉 碱、没食子酸、过氧草酸盐等，其中鲁米 诺是最常用的发光试剂 。
化学发光分析的原理及应用
化学发光分析的原理及应用在生命科学、医学、环保、食品安全等领域，化学发光分析技术得到了广泛应用。
化学发光分析是指利用感光剂发生化学反应释放出光的现象，通过测光仪来检测光的强度，从而获得定量和定性分析信息的过程。
本文将从化学发光分析的原理和应用入手，为读者全面介绍这一技术的特点和优势。
一、化学发光分析的原理化学发光分析的原理与荧光分析原理类似，都是利用分子在外界刺激下发出的光来检测分析样品的。
但是，化学发光分析与荧光分析有着本质上的不同。
荧光分析是指分子在外界的激发下带有一定的能量，发生弛豫过程时在瞬间发出的光，这种光是常规荧光光谱所显示的，纵向轴表示发出光的强度，横向轴表示光波长。
而化学发光分析是指在化学反应过程中，当反应中生成的某些种类的粒子、原子或分子受到外界作用而处于激发态时，它们会释放出一定的能量，这些能量使得感光剂处于激发态，而感光剂在弛豫过程中发出的光则可用于检测样品。
举例来说，将齐氏试剂和过氧化氢混合后，会出现化学反应放出大量的能量，这种能量会使得某些物质进入激发态，当这些物质从激发态跃迁到基态时，就会放出光。
常见的化学发光反应有：齐氏反应、硫酸铜-甲酸乙酯氛围中产生气态芳香族化合物的化学发光反应、偶氮氧基苯-二甲基亚硝胺化合物的产生及其化学发光等。
二、化学发光分析的应用1.环保领域化学发光分析是环保领域高精度分析的核心技术之一。
在环境污染监控中，化学发光分析技术可以用来检测各种危害物质的浓度，例如灰霾的微小颗粒物、大气中的挥发性有机物（VOC）和空气中的多环芳烃（PAHs）等。
2.食品安全领域化学发光分析广泛应用于食品安全领域，在快速检测、筛查食品中毒物质、农药、动物药残留以及食品中的微生物等方面有着独特的优势。
以检测食品中的微生物为例，化学发光分析技术中通常采用ATP (三磷酸腺苷)酶系统进行检测，通过测定样品中存在的微生物含量来判断食品是否安全。
3.生命科学和医学领域化学发光分析技术在生命科学和医学领域也有着广泛的应用。
荧光分析与化学发光分析
化学发光分析是利用化学发光现象进行分析测定 的一类方法。与荧光分析一样，属于发光分析的范 畴。化学发光与荧光分子的发光相似，他的大部分 性质和荧光相同，不同点在于荧光的激发能来自外 光源的激发(照射)，而化学发光的激发能则产生自 化学反应，也即某些物质在进行化学反应时，由于 吸收了反应时产生的化学能，使分子或原子被激发， 这种受激分子或原子返回基态时，以光辐射的方式 释放能量。其光辐射的能量及光谱范围由化学反应 的物质所控制(处于可见光区)。每一个化学反应都 有其特征的化学发射光谱，其发光强度则与物质的 浓度有关，这是化学发光分析的依据。
Em En
图6-7 菲、蒽、苝的光谱图
图6-8 萘、菲、蒽、苝、 并四苯混合物的常规荧光 光谱及混合物的同步光谱 图
图6-9 工厂区大气 样品萃取物中强致癌 物苯并(α)芘及其共 存物的荧光光谱和同 步光谱
三、 荧光定量分析
1. 荧光强度与浓度的关系 荧光的发光是由于物质在吸光之后发射出波长较长的荧光，因此溶液的荧光强度 与该溶液的吸光程度以及溶液中荧光物质的荧光效率有关。溶液被入射光(I0)激 发后，可以在溶液的各个方向观察到荧光强度(F)。但由于激发光源能量的一部 分被透过，因此，在透射光的方向观察荧光是不适宜的。一般是在与激发光源垂 直的方向观测。 根据比耳定律，透过光的比例为 I -ε b C (6-1) - =10 I0 式中： I0为入射光(激发光)强度； I为透过光强度；C为浓度，b为液层厚度；ε 为摩尔吸光系数。 相应地被吸收的部分是 I -ε b C (6-2) 1- - =1-10 I0 将上式重新排列，可得被吸收的光的量为 -ε b C I0-I= I0 (1-10 ) (6-3)
已知电子激发态的自旋多重性为2S+1，S是自 旋量子数的代数和。大多数分子含有偶数电子，在 基态时这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道 中。然而，根据保利不相容原理，在一个轨道上的 这两个电子的自旋是相反的，自旋量子数为+½(↑) 和-½(↓)。由于自旋成对的结果，大多数分子的自旋 量子数的代数和S=0，此时这个分子所处的电子能 态称为单重态(singlet state)，即2S+1=1。如果分子 中有一个未成对的电子，则S=½，而2S+1=2，此 种状态称为双重态(doublet state)。若分子中有两个 未成对的电子，此时S=1,2S+1=3，这种状态称为 三重态(triplet state)。
原子光谱,荧光光谱,化学发光谱的区别
原子光谱,荧光光谱,化学发光谱的区别
原子光谱、荧光光谱和化学发光谱是三种不同的光谱分析方法，它们之间存在显著的区别。
1. 原子光谱：原子光谱是由原子中的电子在能量变化时所发射或吸收的一系列波长的光所组成的光谱。
原子吸收光源中部分波长的光形成吸收光谱，为暗淡条纹；发射光子时则形成发射光谱，为明亮彩色条纹。
每一种原子的光谱都不同，遂称为特征光谱。
原子光谱中各条谱线的强度互不相同，它与相应的两能级间的跃迁几率有关。
原子光谱是一些线状光谱，发射谱是一些明亮的细线，吸收谱是一些暗线。
原子的发射谱线与吸收谱线位置精确重合。
2. 荧光光谱：荧光是物质吸收电磁辐射后受到激发，受激发原子或分子在去激发过程中再发射波长与激发辐射波长相同或不同的辐射。
当激发光源停止辐照试样以后，再发射过程立刻停止，这种再发射的光称为荧光。
荧光光谱是物体经过较短波长的光照，把能量储存起来，然后缓慢放出较长波长的光，放出的这种光就叫荧光。
3. 化学发光谱：化学发光法是分子发光光谱分析法中的一类，它主要是依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的一种痕量分析方法。
综上所述，这三种光谱分析方法在原理和应用上存在显著的区别。
原子光谱主要关注原子的能级跃迁和光的发射与吸收；荧光光谱则关注物质吸收电磁辐射后的激发和再发射过程；而化学发光谱则是利用化学反应过程中产生的光强来进行定量分析的方法。
荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法荧光和化学发光免疫分析方法是一种常用的生物分析技术，广泛应用于生命科学研究、临床诊断和药物研发等领域。
本文将详细介绍荧光和化学发光免疫分析方法的原理、应用以及优缺点等方面。
首先，荧光免疫分析方法利用标记有荧光物质的抗体或抗原与待检测物相互作用，通过检测荧光信号来定量分析目标物。
其原理是当荧光标记物被激发后，会发射出特定波长的荧光信号，利用荧光光谱仪测量荧光强度来确定目标物的浓度。
荧光免疫分析方法具有高灵敏度、高选择性和多样性的优点，可用于检测蛋白质、核酸、细胞等生物分子。
化学发光免疫分析方法则是利用特定的化学反应产生荧光信号来检测目标物。
常用的化学发光免疫分析方法有酶免疫分析和化学发光免疫分析。
在酶免疫分析中，酶标记的抗体或抗原与待检测物相互作用后，加入底物，酶催化底物发生化学反应产生荧光信号。
而化学发光免疫分析则是通过特定的化学反应产生激发态分子，激发态分子发生无辐射跃迁产生荧光信号。
化学发光免疫分析方法具有高灵敏度、快速、稳定性好的特点，常用于临床诊断和药物研发等领域。
荧光和化学发光免疫分析方法在生命科学研究中有广泛的应用。
例如，在蛋白质研究中，可以利用荧光免疫分析方法检测蛋白质的表达水平、相互作用以及酶活性等。
在细胞研究中，荧光免疫分析方法可以用于检测细胞的分子分布、内源性蛋白质的表达和细胞信号传导等。
此外，荧光和化学发光免疫分析方法还可以用于检测病原体、药物残留和环境污染物等。
荧光和化学发光免疫分析方法具有许多优点。
首先，这些方法具有高灵敏度，可以检测到非常低浓度的目标物。
其次，这些方法具有高选择性，能够在复杂的样品中准确地检测目标物。
此外，荧光和化学发光免疫分析方法还可以实现高通量分析，节省时间和成本。
然而，荧光和化学发光免疫分析方法也存在一些缺点。
首先，荧光信号受到背景干扰的影响，可能导致误差的产生。
其次，荧光标记物的稳定性较差，容易受到光照和温度等因素的影响。
分子发光—荧光、磷光和化学发光法
第5章分子发光—荧光、磷光和化学发光法(Molecular Emisssion and Luminescence)（3学时）教学目的和要求：1.学会分子发光——荧光、磷光和化学发光原理。
2.了解分子发光——荧光、磷光和化学发光法的特点和应用。
教学要点和所涵盖的知识点：荧光、磷光和化学发光原理、仪器、分析方法及应用重点和难点：荧光的原理、仪器、分析方法及应用。
分子发光：处于基态的分子吸收能量(电、热、化学和光能等)被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。
发光分析包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等。
物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光。
第一节荧光分析法一、概述分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
荧光分析的特点：灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.1~0.001μg/mL之间。
可见比UV-Vis 的灵敏度高得多。
选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。
结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。
应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。
二、基本原理1、分子荧光的产生处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。
这种跃迁是符合光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。
单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。
在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s;而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4~1s以上(通常用S和T分别表示单重态和三重态)。
处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态。
辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫( VR)、内部转移(IR)、系间窜跃(IX)及外部转移(EC)等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。
化学发光免疫分析与荧光免疫分析的差别
化学发光免疫分析与荧光免疫分析的差别
在体外诊断领域，化学发光免疫分析CLIA与免疫荧光分析IFA都是常⽤的检测⽅法，最终也都是以光度计进⾏检测，不过两者的原理是有本质区别的。
化学发光免疫分析相⽐于放射免疫、荧光免疫、酶联免疫，这种⽅法更有优势，它具有灵敏度⾼、特异性强、线性范围宽、操作简便、不需要⼗分昂贵的仪器设备等特点，⽽且⽆辐射、
标记物有效期长并可实现全⾃动化。
化学发光试剂吖啶酯
化学发光免疫与荧光免疫区别：
虽然两者都是发光反应，最直观的区别就是，化学发光是试剂⾃⾝发光，⽽荧光是⽤光源照射（通常是紫外线）后再发光。
两者的发光原理是不⼀样的，因此检测的结果也会产⽣差异。
化学发光是利⽤化学反应产⽣的能量促使产⽣能级跃迁，从⽽发光，典型的如鲁⽶诺检测⾎迹；荧光是⼀种光致发光现象，必须提供光源去激发分⼦产⽣能级跃迁，进⽽发光。
化学发光⽐荧光免疫⼲扰⼩：
使⽤这两种⽅法进⾏免疫分析时，区别很明显，化学发光⽆需外加光源，背景⼲扰⼩；⽽荧光则需要外加光源，在垂直光源的⽅向上检测，⽣物样品中的蛋⽩质、氨基酸等分⼦也会产⽣
背景荧光，背景稍⾼⼀些，需要选择合适的荧光试剂，以及样品处理⽅法以减少⾮特异性吸附
蛋⽩的影响。
直接法是每个抗原的抗体都要荧光标记，⽽且荧光标记后可能会影响抗体效价甚⾄失效。
间接法只要对相应的抗原做出相应的抗体，再⽤标记好的⼆抗结合上就⾏了，不⽤每个抗体都要
荧光标记，⽽且对⼀抗的效价影响甚微。
化学发光⼲扰很⼩，特异性⾮常⾼，整个⽅法的使⽤
受到化学分析本⾝不特异性的制约。
磁珠材料的发展使化学发光技术的发展越来越成熟。
荧光检测方法
荧光检测方法一、荧光光谱法荧光光谱法是利用荧光分子在不同波长的激发下产生的特定荧光信号来鉴别和定量分析样品。
通过测量样品在特定波长范围内发射的荧光光谱，可以得到样品的荧光特征，进而进行定性和定量分析。
二、荧光染料法荧光染料法是在样品中加入荧光染料，利用荧光染料对特定物质的选择性结合来实现检测。
荧光染料具有较高的荧光量子产率和较长的寿命，能够产生较强的荧光信号。
通过检测荧光染料与目标物质的结合程度，可以定量分析目标物质的含量。
三、光化学发光法光化学发光法是通过化学反应产生的荧光信号进行检测的方法。
光化学发光方法广泛应用于生物分析、环境监测等领域。
常见的光化学发光方法包括化学发光酶法、铁邪菜法等。
四、荧光探针法荧光探针法是利用能与目标物质发生特定相互作用，并产生荧光信号的探针来实现检测。
荧光探针可以是荧光标记的抗体、核酸探针、分子探针等。
荧光探针法具有高灵敏度、高选择性等优点，被广泛用于生物医学研究和临床诊断。
五、时间分辨荧光法时间分辨荧光法是一种利用荧光发射的寿命差异进行分析的方法。
不同的荧光染料在不同的环境中具有不同的寿命，通过测量荧光信号的寿命可以获得更准确的分析结果。
六、荧光显微镜法荧光显微镜法是一种将荧光标记的目标物质在显微镜下观察的方法。
荧光显微镜具有高分辨率和高灵敏度的优点，可以用于细胞内组分的定位和分析。
以上介绍的是一些常见的荧光检测方法，这些方法在生物化学、医学、环境科学等领域具有广泛的应用。
随着技术的不断发展和改进，荧光检测方法将在更多的领域中得到应用，并为科学研究和实际应用提供更准确、快速和可靠的数据支持。
荧光分析与化学发光分析
已知电子激发态的自旋多重性为2S+1，S是自 旋量子数的代数和。大多数分子含有偶数电子，在 基态时这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道 中。然而，根据保利不相容原理，在一个轨道上的 这两个电子的自旋是相反的，自旋量子数为+½(↑) 和-½(↓)。由于自旋成对的结果，大多数分子的自旋 量子数的代数和S=0，此时这个分子所处的电子能 态称为单重态(singlet state)，即2S+1=1。如果分子 中有一个未成对的电子，则S=½，而2S+1=2，此 种状态称为双重态(doublet state)。若分子中有两个 未成对的电子，此时S=1,2S+1=3，这种状态称为 三重态(triplet state)。
3. 化合物的荧光和化学结构的关系 产生荧光必须具备两个条件。首先，物质分子必须具有 能吸收紫外或可见光的生色基团；其次该物质应具有一定的 荧光效率。分子中能发射荧光的基团，称为荧光基团。荧光 基团一定是生色基团，但生色基团未必一定是荧光基团。这 是由于它的荧光效率不高，而将所吸收的能量消耗于与溶剂 分子或其他溶质分子之间的相互碰撞，因此不能发射荧光。 荧光效率(ΦF)又称为荧光量子产率，是荧光物质吸光后所 发射的荧光量子数与所吸收的激发光的量子数的比值，即
化学发光分析是利用化学发光现象进行分析测定 的一类方法。与荧光分析一样，属于发光分析的范 畴。化学发光与荧光分子的发光相似，他的大部分 性质和荧光相同，不同点在于荧光的激发能来自外 光源的激发(照射)，而化学发光的激发能则产生自 化学反应，也即某些物质在进行化学反应时，由于 吸收了反应时产生的化学能，使分子或原子被激发， 这种受激分子或原子返回基态时，以光辐射的方式 释放能量。其光辐射的能量及光谱范围由化学反应 的物质所控制(处于可见光区)。每一个化学反应都 有其特征的化学发射光谱，其发光强度则与物质的 浓度有关，这是化学发光分析的依据。
荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应，应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。
由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。
本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。
一、免疫免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。
免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。
特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。
而对变异或其他抗原毫无作用。
1、抗原1.1抗原的定义抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答（免疫原性），并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质（免疫反应性）。
抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。
1.2抗原的分类完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。
半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。
如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，1.3抗原的性质决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。
抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。
因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。
2、抗体2.1抗体的定义抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。
2.2抗体的结构抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。
荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法荧光和化学发光免疫分析方法是现代生物医学研究和临床诊断中常用的分析方法。
这两种方法在原理和应用中有一些差异，但都具有高灵敏度、高选择性和高自动化程度的特点。
以下将详细介绍荧光和化学发光免疫分析方法的原理、应用和优缺点。
荧光免疫分析方法是基于荧光分子的发射特性进行分析的一种方法。
其原理是，通过标记抗体或抗原的荧光物质，使其具有荧光，并与待测物发生特异性的免疫反应。
然后，通过荧光测定仪器对免疫反应产生的荧光进行检测和分析。
荧光免疫法具有高灵敏度、高选择性、多样化的荧光标记物选择以及可通过多色荧光分析多个指标等特点。
因此在生物医学研究、肿瘤标志物筛查、病毒感染和免疫补体等方面具有广泛的应用。
荧光免疫分析方法主要分为直接荧光免疫分析和间接荧光免疫分析。
直接荧光免疫分析通过将荧光标记物直接结合到抗体或抗原上，实现荧光信号的检测和分析。
间接荧光免疫分析则是先将抗体与细胞或蛋白质结合，然后再用荧光标记的二级抗体结合到一级抗体上，以增强荧光信号。
这两种方法各有优缺点，可以根据具体需要选择使用。
化学发光免疫分析方法是基于化学发光反应进行分析的一种方法。
其原理是，在特定的化学反应条件下，荧光标记的抗体或抗原与待测物发生免疫反应，产生化学发光信号。
然后通过化学发光仪器对化学发光信号进行检测和分析。
化学发光免疫方法具有高灵敏度、快速、特异性高、背景干扰低等优点，因此在临床诊断和分子生物学研究中得到广泛应用。
化学发光免疫分析方法主要分为催化化学发光和基因工程发光两种类型。
催化化学发光是通过特定的酶促发光底物，在酶的作用下产生化学发光信号。
催化化学发光免疫分析方法常用于免疫分析和临床诊断。
基因工程发光则是通过将荧光基因植入生物体内，利用生物体自身的酶促发光反应产生化学发光信号。
基因工程发光免疫分析方法主要用于分子生物学研究领域。
荧光和化学发光免疫分析方法在临床诊断和生物医学研究中具有广泛的应用。
它们可以用于检测血液中的肿瘤标志物、感染性疾病的病原体抗原和抗体、免疫系统功能等指标。
荧光 检测方法
荧光检测的方法如下：
1. 荧光光谱分析法：通过测量荧光物质在不同波长激发光照射下所发出的荧光光谱，可以了解荧光物质的荧光特性。
2. 原子荧光法：通过测量原子在特定波长激发光照射下所发出的荧光光谱，可以测定元素含量。
3. 化学发光分析法：通过测量化学反应中产生的特定波长的光来定量测定化学物质的方法。
4. 时间分辨荧光分析法：通过测量不同时间点的荧光信号，可以消除背景荧光的干扰，进一步提高荧光分析的灵敏度和准确性。
5. 荧光偏振分析法：通过测量荧光分子的偏振方向和强度，可以了解荧光分子的分子结构和运动状态。
除了以上常见的荧光检测方法，还有共聚焦激光扫描显微镜、多光谱成像、多光子显微镜等多种基于荧光的成像技术，可以用于观察和分析生物样品中的荧光标记物。
03第三章_分子荧光和化学发光解析
格也较低廉．
36
在流动注射进样方式中，传递分析物和反应物都是通
过泵来实现的，它的反应池是一个透明性良好的盘 管．分析时用泵驱动试剂进入流动系统，样品经注入 阀注入到反应试剂的溪流中，试剂和试样在流动过程 中进行混合（主要在盘管中混合），并在盘管中产生 化学发光，用置于盘管正前方的光电倍增管检测光信 号．流动注射式自动化程度高、分析速度快，便于连
NH2 O NH NH O O
N N NH2 [O]
*
COO－ COO
－
氧化剂
OH－
叠氮醌
NH2 O N. NH O
+ N2
单电子氧化 鲁米诺 游离基
3-氨基邻苯二 甲酸根阴离子
NH2 COO－ COO－
+ hv
(λmax=425nm）
28
鲁米诺（3-氨基苯二甲酰环肼）在碱性溶液中可
被一些氧化剂氧化，产生最大发射波长为425nm 的化学发光．发光过程有两种方式，即单电子氧 化和双电子氧化，单电子氧化得到中间体鲁米诺 游离基；双电子氧化得到中间体叠氮醌，而最后
式中C*为能量给予体，而F为能量接受体．例如，用罗丹 明B－没食子酸的乙醇溶液测定大气中的O3，其化学发光 反应就属这一类型．
21
没食子酸 + O3 A* + 罗丹明B 罗丹明B*
A* + O2 罗丹明B* + B 罗丹明B + hv
没食子酸被O3氧化时吸收反应所产生的化学能，
形成受激中间体A*，而A*又迅速将能量转给罗
率，其反应机理为
NO + O3 NO2* NO2* + O2 NO2 + hv
药物分析中电化学发光法与荧光光谱法的比较研究
药物分析中电化学发光法与荧光光谱法的比较研究一、引言在药物分析领域，检测方法的选择对于确保分析结果的准确性和可靠性至关重要。
本文将对药物分析中常用的两种方法——电化学发光法和荧光光谱法进行比较研究，探究它们的优势和局限性。
二、电化学发光法1. 原理简介电化学发光法是一种使用电化学方法与发光技术相结合的分析方法。
其基本原理是通过在电极表面引入物质，使其发生电化学反应并产生电化学发光。
该方法具有灵敏度高、选择性好、响应时间短等优点。
2. 应用领域电化学发光法在药物分析中具有广泛的应用。
例如，可以用于药物的含量测定、药物质量控制、代谢产物的检测等。
其高灵敏度和较低的检测限使其成为药物分析领域中重要的手段之一。
3. 优势（1）高灵敏度：电化学发光法对于药物的微量检测具有很高的灵敏度，可以满足分析的需求。
（2）选择性好：该方法可以通过调整电极材料和电催化剂的种类，提高分析物的选择性。
（3）响应时间短：电化学发光法具有较快的响应速度，可以实现快速准确的分析。
4. 局限性（1）适用性较窄：电化学发光法只适用于部分有发光性质的物质，对于大部分药物以及非发光性质的物质不适用。
（2）复杂性：电化学发光法在操作上相对复杂，需要一定的仪器和技术支持，对操作人员的要求较高。
三、荧光光谱法1. 原理简介荧光光谱法是一种基于物质分子在激发态和基态之间跃迁的发光现象进行药物分析的技术。
荧光光谱法具有较高的灵敏度和选择性，被广泛应用于药物检测和分析。
2. 应用领域荧光光谱法在药物分析中也有着重要的应用。
例如，可以用于药物的质量控制、定量分析、药物研究等，特别是对于具有荧光性质的药物，荧光光谱法是一种非常有效的检测手段。
3. 优势（1）高选择性：荧光光谱法可以通过选取适当的激发光波长和检测光波长，提高分析物的选择性。
（2）灵敏度高：荧光光谱法对于荧光物质具有较高的灵敏度，可以准确测定药物的含量。
（3）简便易行：荧光光谱法操作简单，不需要复杂的实验条件和仪器设备。
荧光和化学发光分析法
S是电子的总自旋量子数，各电子自旋量子数的代数和。
16:09:22
2.1.1.1 荧光及其产生
单重态（M=1）：电子自旋都配对的分子的电 子态称为单重态，用“S”表示。
三重态（M=3）：分子中的电子对的电子自旋 平行的电子态称为三重态，用“T”表示。
M = 2S + 1
M自旋多重度 S总自旋量子数
1、激发光源
激发光强度I0大，荧光强度增大，灵敏度增高。
2、溶剂
主要表现为溶剂的极性、氢键、配位键的形成对 化合物的荧光发生变化。
*→跃迁类型：溶剂极性增大，跃迁能量降低， 发生红移，荧光增强。
氢键、配位键的形成主要影响荧光分子的存在型 体、电离状态，荧光强度和形状均发生很大变化。
16:09:22
2.1.2.4 实验条件对荧光强度的影响 3、溶液黏度和温度
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发射光谱的形状与激发波长无关。
2.1.1.2 荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线
荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系
3 2
S1
1
0
3 2
S0
1
0
吸收光谱的形状表明了分子第一激发单重态的振动 能级；发射光谱表明分子基态的振动能级结构。 基态与激发态两者的振动能级结构相似，激发与去 激发组成相反的两个过程。
于分子结构。
16:09:22
2.1.1.4 猝灭
荧光分子与其他分子相互作用引起荧光强度 降低甚至荧光消失的现象为荧光猝灭，又称荧光 熄灭。
（1）、 碰撞猝灭---动态猝灭
M* + Q → M + Q + 热量
激发态分子
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猝灭剂
第5章荧光法与化学发光法解读.
散射光的影响
瑞利散射光
拉曼散射光
干扰荧光测定，应采取措施消除
30
硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱
31
5.1.3
荧光分光光度计
32
1. 激发光源
高压氙灯 ——强谱线的连续光谱
连续分布在250-700nm波长范围内，尤其是300-400nm波 长之间的谱线强度几乎相等
汞灯 ——线光谱
高压：近紫外区365nm,398nm，405nm，436nm，546nm，579nm 低压:紫外区，最强254nm
27
荧光熄灭剂
荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质 分子相互作用引起荧光强度降低的现象。
引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂。
28
常见的荧光熄灭剂
卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、 重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物
Байду номын сангаас
荧光熄灭的形式：
a、碰撞、 b、生成不发光配位化合物 c、荧光物质氧化
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（2）产生荧光的必备条件
强紫外-可见吸收 一定的荧光效率
π→π*跃迁
强吸收带
n →π*跃迁
弱吸收带
存在共轭的π→π*跃迁， φf高，荧光强度大。
18
2．影响荧光强度的结构因素
(1)共轭效应 (2)分子的刚性与共平面性 (3)取代基效应
19
(1)共轭效应
绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂 环，因为芳香环或杂环分子具有长共轭的 π→π*跃迁。π电子共轭程度越大，荧光强度 （荧光效率）越大，而荧光波长也长移。
5.1.3 荧光分光光度计 5.1.4 分析方法 5.1.5 应用示例
4
5.1.1
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S0
l20120/6/12
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l3
l 2 l 2 分子荧光和磷光发射过程
2.1.1.1 荧光及其产生
B 分子去激发过程及荧光的产生 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，
通过辐射跃迁(发光)和非辐射跃迁(热)等方式失去能
量。
传递途径
辐射跃迁
非辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转换 外转换 振动弛豫
三重态（M=3）：分子中的电子对的电子自旋 平行的电子态称为三重态，用“T”表示。
M = 2S + 1
M自旋多重度 S总自旋量子数
S2 > T2 > S1 > T1 > S0
(洪特规则)
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内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
T2
能 量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
T1
发 射 磷 振动弛豫 光
（2）. 磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振 动能级→基态各振动能级。发光时间：10-4～10s 。
S2 S1 T1
hv
S0 e
hv′
S0 →激发态→振动弛豫→内转换→系间跨越→振动弛豫→ T1 → S0
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2.1.1.2 荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线 1、荧光激发光谱
固定荧光测量波长， 改变激发光的波长，
M* + Q → M + Q + 热量
K f Ki
i
各种非辐射跃迁过程的速 率常数之和。取决于分子 所处的化学环境，同时也 与化学结构有关。
荧光发射过程的 速率常数，取决
于分子结构。
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2.1.1.4 猝灭
荧光分子与其他分子相互作用引起荧光强度 降低甚至荧光消失的现象为荧光猝灭，又称荧光 熄灭。
（1）、 碰撞猝灭---动态猝灭
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2.1.1 荧光分析法基本概念
2.1.1.1 荧光及其产生
A 分子的激发态————分子激发态和三线激发态
基态： 在正常状态下，分子处于最低能级的分子轨
道上称为基态。是分子的稳定状态。
激发态： 基态分子吸收能量后，价层电子跃迁到高能
级的分子轨道上称为电子激发态 。是分子的亚稳 定状态。
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
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2.1.1.1 荧光及其产生
2、辐射跃迁
（1）. 荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动 能级→基态各振动能级，发射时间约为10-7～10-9 s 。
发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长。
S2
S1
T1
hv
S0 e
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hv′
2.1.1.1 荧光及其产生
电能 化学能 光能
生物活性参 与化学发光
电致发光 化学发光 光致发光 生物发光
荧光 磷光
分子发光：
M + 能量
光致发光：
M + hv
M*
M + hv
M*
M + hv'
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光
2.1 荧光分析法
2.1.1 荧光分析法基本概念 2.1.2 荧光强度及影响因素 2.1.3 仪器装置 2.1.4 定量分析方法 2.1.5 荧光分析测定方法、特点和应用
固定激发光波长和 强度，记录在不同波 长λem下所发射的荧光 强度所得关系曲线即 不同波长下荧光强度 的分布。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
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发射光谱的形状与激发波长无关。
2.1.1.2 荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线
荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系
3 2
S1
1
0
3 2
S0
1
0
吸收光谱的形状表明了分子第一激发单重态的振动 能级；发射光谱表明分子基态的振动能级结构。 基态与激发态两者的振动能级结构相似，激发与去 激发组成相反的两个过程。
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2.1.1.3 荧光效率 分子产生荧光必须具备的条件
1. 具有合适的结构：通常是含有苯环和稠环的刚 性结构的有机分子； 2. 具有一定的荧光量子产率。
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2.1.1.1 荧光及其产生
电子自旋多重度
电子从基态跃迁到激发态，分子中的电子可 以处在不同的自旋状态,常用电子自旋多重度来 描述。
M = 2S + 1
S是电子的总自旋量子数，各电子自旋量子数的代数和。
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2.1.1.1 荧光及其产生
单重态（M=1）：电子自旋都配对的分子的电 子态称为单重态，用“S”表示。
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五颜六色雨后路面上水珠油膜呈现
Stokes 用分光计观察到： 荧光的波长比入射光的波长稍微长些
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分子发光：
基态分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)，电子由 基态跃迁到激发态，当电子由激发态返回基态时，以发射电磁 辐射(即光)的形式释放能量。
分子 +
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荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
测 量 不 同 波 长 λex 激 发 光照射下荧光强度的
变化，记录荧光强度F
与激发光波长的关系
曲线。
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
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2.1.1.2 荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线
2、荧光发射光谱
返回速度快的途径，发生几率大!
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2.1.1.1 荧光及其产生
1、非辐射跃迁
（1）. 振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形 式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生 振动时间10 -11~ 10 -13 s。
S2
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hv
S0
e
2.1.1.1 荧光及其产生
（2）. 内转换：相同多重度的电子能级中, 相等能级 间的非辐射能级交换。发生内转换的时间10-12 s。
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2.1.1.3 荧光效率
荧光量子产率（Φ）： 衡量荧光物质发光能力。 它表示激发分子发射出荧光(或磷光) 的比例。
发射荧光的分子数
Φ=
激发分子总数
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2.1.1.3 荧光效率
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速
率常数有关，可用各过程的速率常数来表示荧光
量子产率：
Kf
S2 S1
hv
16:09:22
S0 e
2.1.1.1 荧光及其产生
（3）. 系间跨越：不同多重态在有重叠的转动能级 间的非辐射跃迁。电子自旋改变，跃迁禁阻，通过自 旋-轨道耦合等跃迁。
S2 S1 T1
hv
16:09:22
S0 e
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2.1.1.1 荧光及其产生
（4）. 外转换：激发态分子与溶剂或其他分 子之间产生相互作用而损失能量回到基态的非 辐射跃迁。