分子生物学技术分子克隆
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➢ 人工合成
序列明确的短DNA片段，可用DNA合成仪合成（适合较 短的）。
➢ 由mRNA逆转录合成cDNA
细胞总RNA分离 mRNA分离 纯化 cDNA第一链的合成 成 cDNA的克隆
目的基因mRNA的 cDNA第二链的合
➢ 从基因组文库中筛选目的基因
首先构建基因组文库（G文库）或cDNA文库（C文 库），需要时利用探针技术将所需目的基因“钓 ”出来。
②载体：可容忍外源性DNA片段插入，可在细胞间转移并能在 细胞内自主复制的DNA分子。
理想的质粒克隆载体应具有的特性：
➢ 能在宿主细胞中独立复制，并能携带DNA片段一同扩增 ➢ 具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位点,即多克隆位点
(MCS, multiple cloning sites)， 便于进行克隆 ➢ 分子量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制
• 操作过程中带手套、口罩。
逆转录反应（cDNA合成）
• 逆转录（reverse transcription）： 是 指在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成 DNA的过程。
R 模 板 NA
DNA-杂 R化 N双 A 链
单 链 DNA
逆转录反应体系的基本成分
• 模板: 组织或培养细胞总RNA。
• 逆转录酶：AMV: 禽类成髓细胞性白血病病毒 M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒
• 取上层水相于一新的离心管，按每1 ml Trizol液加 0.5 ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟 ，12000 g离心10分钟。
• 弃去上清液，按每1 ml Trizol液加入至少1 ml的比 例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下 7500 g 离心5 分钟。
• 小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟， 注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然 后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分 钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并 保存于-70℃。
完全干燥的RNA呈透明状；趁RNA沉淀仍然呈白色的时加水溶解
• RNA样品相关实验要尽快进行，如需保存RNA，需存于-80 度超低温冰箱；
避免RNA酶污染
• 由于RNA分子容易受RNA酶的攻击反应而 降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而 在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并 设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。
Tips：
• 样品收集后迅速放入液氮； • 样品在Trizol溶液中相对稳定； • 注意避免RNase，尤其是内源的；
丰度低的mRNA：实验所需的耗材需要0.1%DEPC水处理，高压灭菌 丰度中等以上的mRNA：耗材高压灭菌即可。
• 获得高纯度RNA，要懂得取舍；
上清取适量即可（500 ul）。
• 完全干燥的RNA溶解度极低；
• RNA的提取和cDNA合成 • 聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段 • 质粒DNA的分离、纯化和鉴定 • 质粒、PCR产物的酶切 • 重组DNA的连接 • 重组质粒的转化及筛选 • 凝胶电泳 • 测序技术
总RNA制备
• Trizol法:
主要用途：总RNA提取 （DNA、蛋白质提取） 主要成分：苯酚、异硫氰酸胍等
4.转：把连接好的重组载体转化入感受态细胞的过程（ 细菌：E.coli，真菌：Yeast，昆虫细胞或哺乳动物细 胞）。
5.筛：在不同层次上、不同水平上进行筛选，鉴定所需 的特异性重组子。使用各种方法，将带有重组载体的 宿主菌从培养基中筛选出来。例如：载体大小，酶切 结果，筛选标记等。
DNA体外重组技术
Invitrogen TRIzol®产品
Trizol法提取总RNA步骤
• 以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品 总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
• 研磨液室温放置5分钟，然后以每1 ml Trizol液加入 0.2 ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇 荡离心管15秒，静置3分钟。
• 在cDNA生成之前，也就是RNA提取和逆转 录过程中都要避免RNA酶污染。
避免RNA酶污染
• DEPC（diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙 酯）是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的 活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活 性。
• 实验用品用0.1%DEPC水处理（2 h），高压 蒸汽灭菌后烤干备用或购买经过处理的无 RNA酶实验用品。
分子生物学技术分子克隆
生物医学研究常用基本技术
• 分子克隆技术（DNA重组技术） • 免疫印迹技术（Western blot） • 免疫组织化学技术（免疫组化） • 细胞培养技术
局限性 联合应用
分子克隆技术
DNA体外重组技术：是在分子水平上，根据人们的 需要以人工的方法将感兴趣的目的基因，在体外与载 体DNA分子重组，然后将重组子转入受体细胞，并 筛选出表达重组DNA的活细胞，加以纯化、扩增、 成为克隆，这一过程称为DNA体外重组技术。
• 基本过程 分、切、连、转、筛
1.分：分离出要克隆的目的基因及载体。
①目的基因的来源：
➢ 直接分离
适于遗传背景了解比较清楚的细菌染色体、质粒及病 毒DNA的提取分离。首先通过组建几种限制性内切酶 的物理图谱进行基因定位，然后用DNA的酶切片段电 泳分离DNA，应用相ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱDNA探针确定目的DNA后，从 胶中回收DNA。(适合原核)
适用组织：人类、动物、植物、微生物的组织，细 菌或真菌
样品量：从几十毫克至几克。
用Trizol法提取的总RNA无蛋白和DNA污染。RNA 可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分 子克隆。
• RNA提取试剂盒：国产、进口
常用总RNA提取试剂盒 尽量选用含DNA酶的试剂盒
➢ 易于导入受体细胞具有容易操作的检测表型。如抗生素抗性 、 α-互补显色反应（蓝白斑筛选）
➢ 表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子，前导序列， 增强子等调控元件
➢ 生物安全性好 目前常用的载体有质粒、噬箘体、病毒等。
载体
2.切：用限制性内切酶切割目的基因和载体，使其产生 便于连接的末端。
3.连：将切割后的目的基因和载体用T4DNA连接酶连接 。
序列明确的短DNA片段，可用DNA合成仪合成（适合较 短的）。
➢ 由mRNA逆转录合成cDNA
细胞总RNA分离 mRNA分离 纯化 cDNA第一链的合成 成 cDNA的克隆
目的基因mRNA的 cDNA第二链的合
➢ 从基因组文库中筛选目的基因
首先构建基因组文库（G文库）或cDNA文库（C文 库），需要时利用探针技术将所需目的基因“钓 ”出来。
②载体：可容忍外源性DNA片段插入，可在细胞间转移并能在 细胞内自主复制的DNA分子。
理想的质粒克隆载体应具有的特性：
➢ 能在宿主细胞中独立复制，并能携带DNA片段一同扩增 ➢ 具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位点,即多克隆位点
(MCS, multiple cloning sites)， 便于进行克隆 ➢ 分子量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制
• 操作过程中带手套、口罩。
逆转录反应（cDNA合成）
• 逆转录（reverse transcription）： 是 指在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成 DNA的过程。
R 模 板 NA
DNA-杂 R化 N双 A 链
单 链 DNA
逆转录反应体系的基本成分
• 模板: 组织或培养细胞总RNA。
• 逆转录酶：AMV: 禽类成髓细胞性白血病病毒 M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒
• 取上层水相于一新的离心管，按每1 ml Trizol液加 0.5 ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟 ，12000 g离心10分钟。
• 弃去上清液，按每1 ml Trizol液加入至少1 ml的比 例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下 7500 g 离心5 分钟。
• 小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟， 注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然 后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分 钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并 保存于-70℃。
完全干燥的RNA呈透明状；趁RNA沉淀仍然呈白色的时加水溶解
• RNA样品相关实验要尽快进行，如需保存RNA，需存于-80 度超低温冰箱；
避免RNA酶污染
• 由于RNA分子容易受RNA酶的攻击反应而 降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而 在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并 设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。
Tips：
• 样品收集后迅速放入液氮； • 样品在Trizol溶液中相对稳定； • 注意避免RNase，尤其是内源的；
丰度低的mRNA：实验所需的耗材需要0.1%DEPC水处理，高压灭菌 丰度中等以上的mRNA：耗材高压灭菌即可。
• 获得高纯度RNA，要懂得取舍；
上清取适量即可（500 ul）。
• 完全干燥的RNA溶解度极低；
• RNA的提取和cDNA合成 • 聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段 • 质粒DNA的分离、纯化和鉴定 • 质粒、PCR产物的酶切 • 重组DNA的连接 • 重组质粒的转化及筛选 • 凝胶电泳 • 测序技术
总RNA制备
• Trizol法:
主要用途：总RNA提取 （DNA、蛋白质提取） 主要成分：苯酚、异硫氰酸胍等
4.转：把连接好的重组载体转化入感受态细胞的过程（ 细菌：E.coli，真菌：Yeast，昆虫细胞或哺乳动物细 胞）。
5.筛：在不同层次上、不同水平上进行筛选，鉴定所需 的特异性重组子。使用各种方法，将带有重组载体的 宿主菌从培养基中筛选出来。例如：载体大小，酶切 结果，筛选标记等。
DNA体外重组技术
Invitrogen TRIzol®产品
Trizol法提取总RNA步骤
• 以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品 总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
• 研磨液室温放置5分钟，然后以每1 ml Trizol液加入 0.2 ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇 荡离心管15秒，静置3分钟。
• 在cDNA生成之前，也就是RNA提取和逆转 录过程中都要避免RNA酶污染。
避免RNA酶污染
• DEPC（diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙 酯）是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的 活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活 性。
• 实验用品用0.1%DEPC水处理（2 h），高压 蒸汽灭菌后烤干备用或购买经过处理的无 RNA酶实验用品。
分子生物学技术分子克隆
生物医学研究常用基本技术
• 分子克隆技术（DNA重组技术） • 免疫印迹技术（Western blot） • 免疫组织化学技术（免疫组化） • 细胞培养技术
局限性 联合应用
分子克隆技术
DNA体外重组技术：是在分子水平上，根据人们的 需要以人工的方法将感兴趣的目的基因，在体外与载 体DNA分子重组，然后将重组子转入受体细胞，并 筛选出表达重组DNA的活细胞，加以纯化、扩增、 成为克隆，这一过程称为DNA体外重组技术。
• 基本过程 分、切、连、转、筛
1.分：分离出要克隆的目的基因及载体。
①目的基因的来源：
➢ 直接分离
适于遗传背景了解比较清楚的细菌染色体、质粒及病 毒DNA的提取分离。首先通过组建几种限制性内切酶 的物理图谱进行基因定位，然后用DNA的酶切片段电 泳分离DNA，应用相ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱDNA探针确定目的DNA后，从 胶中回收DNA。(适合原核)
适用组织：人类、动物、植物、微生物的组织，细 菌或真菌
样品量：从几十毫克至几克。
用Trizol法提取的总RNA无蛋白和DNA污染。RNA 可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分 子克隆。
• RNA提取试剂盒：国产、进口
常用总RNA提取试剂盒 尽量选用含DNA酶的试剂盒
➢ 易于导入受体细胞具有容易操作的检测表型。如抗生素抗性 、 α-互补显色反应（蓝白斑筛选）
➢ 表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子，前导序列， 增强子等调控元件
➢ 生物安全性好 目前常用的载体有质粒、噬箘体、病毒等。
载体
2.切：用限制性内切酶切割目的基因和载体，使其产生 便于连接的末端。
3.连：将切割后的目的基因和载体用T4DNA连接酶连接 。