应用生物化学-抗体技术_PPT幻灯片

• 脾内一次性免疫法 “省时；省抗原”
• 短程免疫法
“省时”
• 体外免疫法
“操作繁琐”
➢ 常规免疫法的免疫途径
皮下注射 腹腔注射 静脉注射
2. 常规免疫法免疫程序：
第1次免疫：抗原+福氏完全佐剂 (皮下注射)
第2次免疫：抗原+福氏不完全佐剂 (皮下注射)
第3次免疫：抗原+不加佐剂 (皮下注射或静脉注射)
第一节 概 述
一. 免疫学知识
➢人体和动物都有免疫系统，包括非特异性
免疫和特异性免疫。
➢非特异性免疫主要有宿主的屏障，吞噬细
胞，抗菌物质，以及炎症反应。
➢ 特异性免疫又分为细胞免疫和体液免疫。
细胞免疫
➢ 主要是指机体受到异己物质（抗原）的
刺激后，一类小淋巴细胞——依赖胸腺的T细 胞发生增生，分化，直接攻击靶细胞或间接 地释放一些淋巴因子从而使机体达到免疫的 过程。
➢ 由于这种抗体是针对一个抗原决定簇的
抗体，又是由单一的B淋巴细胞克隆产生的， 所以称为单克隆抗体。
一、抗原与动物免疫
特定目标抗原
免疫
动物
刺激
脾脏中B淋巴细胞
加强免疫
B淋巴细胞 大量增殖
能分泌针对于该抗原 的特异性抗体
1. 常用的免疫动物Balb/c小鼠。
➢ 免疫方法
• 常规免疫法
“稳妥；优势克隆”
B淋巴细胞 瘤的突变株
培养上清中X抗体的检测 克隆化培养
分泌X抗体 B淋巴细胞
培养数天后细胞死亡
骨髓瘤细胞 无限生长细胞
细胞融合 混合细胞的HAT筛选)
单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测
只有杂交瘤细胞可长期存活下来 分泌 X抗体
杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体
规模化培养 获得大量单克隆抗体
第三节 鼠源性单克隆抗体的改造
第4次免疫：抗原+不加佐剂 (静脉注射)
采集脾脏细胞
二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养
1. 细胞融合
➢ 脾细胞悬液的制备：最后一次免疫后
第3天制备
➢ 骨髓瘤细胞悬液的制备：于对数生长
期制备
➢ 聚乙二醇（PEG）细胞融合：浓度40-
50% 分子量4000, pH8.0, 38℃, 1min
➢ 融合方法:
酶联免疫吸附法(ELISA)
技术原理：
有色产物 酶标仪检测
底物 酶
第2抗体 第1抗体 抗原
待检杂交瘤培养上清液
四、克隆化
常用克隆化方法：
➢有限稀释法 ➢软琼脂平板法 ➢显微操作法
ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清， 选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单 克隆抗体。
五、大规模培养——批量生产单克隆抗体
二、改形抗体
用鼠源性单克隆抗体的互补决定区 （complementarity-determining region, CDR）序列替换人免疫球蛋白分子中的互补决 定区序列，则可使人的免疫球蛋白分子具有 鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。
由于抗体分子中鼠源部分只占很小比例， 可基本消除免疫原性。最大问题是抗体的亲 和力下降，甚至丧失活性。
HT培养基
1 week later
正常培养基
细胞培养瓶
细胞培养瓶
细胞培养板
细胞培养皿
三、 抗体的检测
要求：
➢ 简便、快速、敏感;
常用方法：
酶联免疫吸附法 (enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA) 间接免疫荧光法 (Indirect immunofluorescence, IFA) 放射免疫法 (radio immuno assay, RIA)
内源性途径(主要途径)
T
外源性途径(旁路途径)
胸腺嘧啶激酶 ( TK )
(Thymidine kinase)
B淋巴细胞：HGPRT+，TK+
DNA
存活
骨髓瘤细胞：HGPRT-，TK-
死亡
4. HAT培养基的筛选
滋养细胞
融合后细胞混合液
HAT培养基 （每2-3天换液1/2换液）
2 weeks later
取适量脾细胞（1×108）与骨髓瘤细胞 (2×107）进行混合，在聚乙二醇（PEG）作 用下诱导它们融合，时间控制在1分钟以内， 然后用培养液将聚乙二醇融合液缓缓稀释。
2. 杂交瘤细胞的筛选：
脾细胞 (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞 脾细胞/脾细胞
骨髓瘤细胞/ 骨髓瘤细胞
脾细胞
骨髓瘤细胞
不能长期存活
筛选出
不能长期存活
3.HAT培养基筛选原理
H：次黄嘌呤; A：氨基喋呤; T：胸腺嘧啶
(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)
次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT )
H
外源性途径(旁路途径)
谷氨酰胺 or 单磷酸尿苷酸
二氢叶酸还原酶
A
常用的大规模培养方法：
➢ 动物接种法 将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种
于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹 腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。 ➢ 大规模细胞培养法
利用微载体、微囊、旋转瓶、中空纤维培养系统 等进行大规模培养。
动物免疫 BALB/c
杂交瘤技术操作流程图解
X抗原
体液免疫
➢ 是当机体受到抗原刺激后，来源于骨
髓的小淋巴细胞——B淋巴细胞进行增生 和分化为浆细胞，进而合成各种免疫球 蛋白(抗体)，然后在体液中发挥免疫作用 的过程。
第二节 单克隆抗体
➢ 单克隆抗体是将能产生抗体的细胞与具
有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通 过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为 纯一的单克隆细胞系，而产生的抗体。
三、小分子抗体
➢ 基因工程的小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗
体的可变区，其相对分子量仅为原抗体的1/80到1/3。
➢ 目前制备的单克隆抗体都是鼠源性的，大
量应用于人体时可产生人抗鼠抗体，使其作 用和效果都受到严重影响，甚至有毒副作用。
➢ 改造鼠源性单克隆抗体的目的有两个:一
是降低免疫原性，二是降低相对分子量，增 加组织穿透能力。
人－鼠嵌合抗体 改形抗体
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Variable region
Constant region
一、人－鼠嵌合抗体
➢ 抗体与抗原结合的功能取决于抗体分子
的可变区（V），同种性免疫原性则决定于 抗体分子的稳定区（C）。
➢ 人－鼠嵌合抗体：鼠源性单克隆抗体的
可变区基因和人免疫球蛋白的稳定区基因连 接起来，再共转染骨髓瘤细胞，就可表达出 完整的人－鼠嵌合抗体。
CDR FR
CDR: complementarity determining region FR: framework region