氨基酸检测方法
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氨基酸标准品
STR ODS-II
自动氨基酸分析仪
• 对于“ 柱前”和“ 柱后”自动氨基酸分析仪来说，采用何种方法更 好？
• 要控制反应时间，采用柱后衍生方法更方便。 这就是为什么采用柱 后衍生法所得结果之重复性更好的原因。
• 柱后衍生重复性, RSD 约为 1% • 柱前衍生重复性, RSD > 2%
Shimadzu 氨基酸分析系统
氨基酸分析流程图
分离柱
• 强酸性阳离子交换树脂
(带有磺化基团的苯乙烯－二乙烯基苯共聚物)
• Na型 and Li型
• Shim-pack AMINO-Na ，用于水解氨基酸分析 • Shim-pack AMINO-Li ，用于生物体氨基酸分析
水解氨基酸色谱图
生物体氨基酸色谱图
OPA柱前衍生化色谱图
生物体氨基酸标准品
Shim-pack CLC-ODS
FMCO 方法
(9-fluorenylmethyoxycarbonyl chloride)
通用试剂，用于缩氨酸 N端保护
荧光胺方法
• pH＝7时与伯氨基酸快速反应 • 易于水解
DANS-Cl 方法
(1-dimethylaminonaphthalene-5-sufonyl chloride)
0.4
1.6
Arginine
0.1
0.9
Valine
0.4
1.0
(n=10)
线性
高灵敏度分离色谱图
25 pmol 氨基酸标准品
样品预处理
• 脱脂 • 去蛋白 • 蛋白质水解 • 样品稀释 • 过滤
脱脂
• 脂类组分会影响分析柱 • 使用弱极性溶剂
• 乙酸乙酯 • 氯仿 • 正己烷等
• 两相分离后, 水相必须使用0.45 um 滤膜过滤
• 与伯氨基酸和仲氨基酸反 应效率低
PITC 方法
(phenylisothiocyanate)
PITC PTC
• For peptide and protein sequencing as Edman抯 reagent
• 伯氨基酸和仲氨基酸 (碱性条件)
• 反应时间长
• 使用UV检测器，灵敏度低
PTC - 氨基酸色谱图
次氯酸盐
OPA 试剂
茚三酮方法和OPA方法比较
反应 反应温度 反应速度
检测器 反应物稳定性
茚三酮 一，二级氨基酸
130 C 快
UV-VIS检测器 不稳定
OPA 一级氨基酸
室温 快
荧光检测器 稳定
柱前衍生
衍生化后的氨基酸
色谱柱
色 谱 柱 : 反相柱 (ODS) 试 剂 : OPA ( 荧光检测)
FMOC (荧光检测) 荧 光 胺(荧光检测) DANS-Cl (荧光检测) PITC (UV)
• 脯氨酸和羟基脯氨酸不与OPA试剂 发生反应
• 在与OPA反应前两种氨基酸应先使 用下列试剂进行氧化
• 次氯酸盐 • 氯胺－T
OPA 衍生反应辅助试剂
• 有硫醇存在时，OPA才会与伯氨基酸发生反应
乙硫醇 2- 硫基乙醇 3- 硫基丙酸
( 非挥发性)
OPA 方 法
氨基酸
阳离子交换柱
柱温箱
荧光检测器
氨基酸分析
• 1958 Spackman, Stein and Moore 第一次实现氨基酸自动分离和定量
NH2 R C COOH
H
UV-210nm
氨基酸衍生化方法
• 柱后衍生 • 柱前衍生
氨基酸
试剂
色谱柱
衍生化后的氨基酸 色谱柱
检测器 检测器
柱后衍生
氨基酸
色谱柱
试剂
色谱柱 : 阳离子交换柱
试剂 : 茚三酮方法 --- UV/VIS 检测器 OPA方法 --- 荧光检测器
流动相
[ Na型 ] A 溶液 : 0.2N 柠檬酸钠
(用高氯酸调 pH至 3.2) B 溶液 : 0.6N 柠檬酸钠 / 0.2M 硼酸
(用4M NaOH调 pH至 10.0) C溶液 : 0.2N NaOH(用于清洗色谱柱)
[ Li 型] A 溶液 : 0.15N 柠檬酸锂 / 7% 甲氧基乙醇
检测器
柱后衍生化分离柱
阳离子交换柱
使用阳离子交换柱，峰分离度较差。 分析所有的氨基酸所需时间较长。
• 蛋白质水解氨基酸 (45 min) • 生物体氨基酸 (120 min)
茚三酮方法
伯氨基酸和仲氨基酸（亚氨基酸） 检 测 : 440nm ( 脯 氨 酸) or 570nm (primary) 反应温度 : 130 ℃ 反应速度 : 快 速 试剂稳定性 : 不稳定（ 必须冷藏） 衍生化产物稳定性 : 稳定
0.3
0.9
Serine
0.2
1.3
Leucine
0.4
1.3
Glutamic acid
0.2
1.3
Tyrosine
0.3
1.2
Proline
0.2
0.9
Phynylalanine
0.3
1.3
Glycine
0.2
0.9
Histidine
Байду номын сангаас0.1
1.1
Alanine
0.3
1.0
Lysine
0.1
1.5
Cystine
有捕集柱
流动相中的氨
重复性 (各250 pmol)
Rretention time Area value Retention timeretention timeArea value
Asparatic acid
0.2
1.2
Methionine
0.4
1.1
Threonine
0.2
1.0
Isoleucine
茚三酮方法
氨基酸
阳离子交换柱
柱温箱 130 ℃
反应器加热器
UV/VIS 检测器
茚三酮试剂
OPA 方 法
( 邻 苯 二 甲 醛)
伯氨基酸 检 测：荧光检测器 (Ex=350nm, Em=460nm) 反应温度： 室 温 反应速度： 快 速 试剂稳定性 : 较 差 衍生化产物稳定性： 较 差
脯氨酸和羟基脯氨酸分析
(用硼酸调 pH至 2.6) B溶液 : 0.3N 柠檬酸锂 / 0.2M 硼酸
用4M LiOH调 pH至 10.0)
PH梯度
H
R-C-COOH NH3+
H R-C-COOH
NH2
H R-C-COO-
NH2
分离是通过 离子力进行的
N-acetylcystine作为辅助试剂
什么是氨捕集柱?
无捕集柱
检测器
柱前衍生分离柱
反相色谱柱 (ODS)
使用反相柱，色谱峰分离良好。 分析某些类型的氨基酸所需时间很短
• 蛋白质水解氨基酸 (20 min) • 生物体氨基酸 (60 min)
OPA Method
(o-phthaldialdehyde)
伯氨基酸 检测 : 荧光检测器 (Ex=380nm, Em=420nm) 反应温度：室温 反应速度：快速
STR ODS-II
自动氨基酸分析仪
• 对于“ 柱前”和“ 柱后”自动氨基酸分析仪来说，采用何种方法更 好？
• 要控制反应时间，采用柱后衍生方法更方便。 这就是为什么采用柱 后衍生法所得结果之重复性更好的原因。
• 柱后衍生重复性, RSD 约为 1% • 柱前衍生重复性, RSD > 2%
Shimadzu 氨基酸分析系统
氨基酸分析流程图
分离柱
• 强酸性阳离子交换树脂
(带有磺化基团的苯乙烯－二乙烯基苯共聚物)
• Na型 and Li型
• Shim-pack AMINO-Na ，用于水解氨基酸分析 • Shim-pack AMINO-Li ，用于生物体氨基酸分析
水解氨基酸色谱图
生物体氨基酸色谱图
OPA柱前衍生化色谱图
生物体氨基酸标准品
Shim-pack CLC-ODS
FMCO 方法
(9-fluorenylmethyoxycarbonyl chloride)
通用试剂，用于缩氨酸 N端保护
荧光胺方法
• pH＝7时与伯氨基酸快速反应 • 易于水解
DANS-Cl 方法
(1-dimethylaminonaphthalene-5-sufonyl chloride)
0.4
1.6
Arginine
0.1
0.9
Valine
0.4
1.0
(n=10)
线性
高灵敏度分离色谱图
25 pmol 氨基酸标准品
样品预处理
• 脱脂 • 去蛋白 • 蛋白质水解 • 样品稀释 • 过滤
脱脂
• 脂类组分会影响分析柱 • 使用弱极性溶剂
• 乙酸乙酯 • 氯仿 • 正己烷等
• 两相分离后, 水相必须使用0.45 um 滤膜过滤
• 与伯氨基酸和仲氨基酸反 应效率低
PITC 方法
(phenylisothiocyanate)
PITC PTC
• For peptide and protein sequencing as Edman抯 reagent
• 伯氨基酸和仲氨基酸 (碱性条件)
• 反应时间长
• 使用UV检测器，灵敏度低
PTC - 氨基酸色谱图
次氯酸盐
OPA 试剂
茚三酮方法和OPA方法比较
反应 反应温度 反应速度
检测器 反应物稳定性
茚三酮 一，二级氨基酸
130 C 快
UV-VIS检测器 不稳定
OPA 一级氨基酸
室温 快
荧光检测器 稳定
柱前衍生
衍生化后的氨基酸
色谱柱
色 谱 柱 : 反相柱 (ODS) 试 剂 : OPA ( 荧光检测)
FMOC (荧光检测) 荧 光 胺(荧光检测) DANS-Cl (荧光检测) PITC (UV)
• 脯氨酸和羟基脯氨酸不与OPA试剂 发生反应
• 在与OPA反应前两种氨基酸应先使 用下列试剂进行氧化
• 次氯酸盐 • 氯胺－T
OPA 衍生反应辅助试剂
• 有硫醇存在时，OPA才会与伯氨基酸发生反应
乙硫醇 2- 硫基乙醇 3- 硫基丙酸
( 非挥发性)
OPA 方 法
氨基酸
阳离子交换柱
柱温箱
荧光检测器
氨基酸分析
• 1958 Spackman, Stein and Moore 第一次实现氨基酸自动分离和定量
NH2 R C COOH
H
UV-210nm
氨基酸衍生化方法
• 柱后衍生 • 柱前衍生
氨基酸
试剂
色谱柱
衍生化后的氨基酸 色谱柱
检测器 检测器
柱后衍生
氨基酸
色谱柱
试剂
色谱柱 : 阳离子交换柱
试剂 : 茚三酮方法 --- UV/VIS 检测器 OPA方法 --- 荧光检测器
流动相
[ Na型 ] A 溶液 : 0.2N 柠檬酸钠
(用高氯酸调 pH至 3.2) B 溶液 : 0.6N 柠檬酸钠 / 0.2M 硼酸
(用4M NaOH调 pH至 10.0) C溶液 : 0.2N NaOH(用于清洗色谱柱)
[ Li 型] A 溶液 : 0.15N 柠檬酸锂 / 7% 甲氧基乙醇
检测器
柱后衍生化分离柱
阳离子交换柱
使用阳离子交换柱，峰分离度较差。 分析所有的氨基酸所需时间较长。
• 蛋白质水解氨基酸 (45 min) • 生物体氨基酸 (120 min)
茚三酮方法
伯氨基酸和仲氨基酸（亚氨基酸） 检 测 : 440nm ( 脯 氨 酸) or 570nm (primary) 反应温度 : 130 ℃ 反应速度 : 快 速 试剂稳定性 : 不稳定（ 必须冷藏） 衍生化产物稳定性 : 稳定
0.3
0.9
Serine
0.2
1.3
Leucine
0.4
1.3
Glutamic acid
0.2
1.3
Tyrosine
0.3
1.2
Proline
0.2
0.9
Phynylalanine
0.3
1.3
Glycine
0.2
0.9
Histidine
Байду номын сангаас0.1
1.1
Alanine
0.3
1.0
Lysine
0.1
1.5
Cystine
有捕集柱
流动相中的氨
重复性 (各250 pmol)
Rretention time Area value Retention timeretention timeArea value
Asparatic acid
0.2
1.2
Methionine
0.4
1.1
Threonine
0.2
1.0
Isoleucine
茚三酮方法
氨基酸
阳离子交换柱
柱温箱 130 ℃
反应器加热器
UV/VIS 检测器
茚三酮试剂
OPA 方 法
( 邻 苯 二 甲 醛)
伯氨基酸 检 测：荧光检测器 (Ex=350nm, Em=460nm) 反应温度： 室 温 反应速度： 快 速 试剂稳定性 : 较 差 衍生化产物稳定性： 较 差
脯氨酸和羟基脯氨酸分析
(用硼酸调 pH至 2.6) B溶液 : 0.3N 柠檬酸锂 / 0.2M 硼酸
用4M LiOH调 pH至 10.0)
PH梯度
H
R-C-COOH NH3+
H R-C-COOH
NH2
H R-C-COO-
NH2
分离是通过 离子力进行的
N-acetylcystine作为辅助试剂
什么是氨捕集柱?
无捕集柱
检测器
柱前衍生分离柱
反相色谱柱 (ODS)
使用反相柱，色谱峰分离良好。 分析某些类型的氨基酸所需时间很短
• 蛋白质水解氨基酸 (20 min) • 生物体氨基酸 (60 min)
OPA Method
(o-phthaldialdehyde)
伯氨基酸 检测 : 荧光检测器 (Ex=380nm, Em=420nm) 反应温度：室温 反应速度：快速