猪乙型脑炎病毒灭活疫苗佐剂筛选及免疫效果评估

猪乙型脑炎病毒灭活疫苗佐剂筛选及免疫效果评估流行性乙型脑炎在日本首次发现,又称日本乙型脑炎,由日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)引起的侵害人中枢神经系统,母猪流产和公猪睾丸炎的人兽共患传染病。在缺少抗病毒药物治疗感染JEV的情况下,免疫接种是预防猪乙脑最有效的方法。

为了筛选出能增强猪乙型脑炎灭活疫苗免疫原性的佐剂,本研究将603纳米佐剂、Gel 01、ISA206、IMS 1313佐剂和灭活的猪源基因Ⅰ型SCYA201201株细胞培养物混合制备成4种不同佐剂灭活疫苗,进行小鼠中抗体消长规律、攻毒保护以及免疫小鼠后的免疫应答试验,为新型佐剂JEV灭活疫苗的研制提供科学依据。1.不同佐剂JEV灭活疫苗的制备将猪乙型脑炎病毒SCYA201201株在BHK-21上连续传代,用0.2%甲醛灭活24h。

按使用说明分别将603纳米佐剂、Gel 01、ISA206和IMS 1313佐剂加到灭活的病毒液中,制备成猪乙型脑炎灭活疫苗。通过安全性试验、物理性状和无菌检验制备出了质量合格的4种不同佐剂细胞灭活苗:ISA206油乳剂灭活疫苗、IMS1313水佐剂灭活疫苗、Gel 01水佐剂灭活疫苗、603油乳剂灭活疫苗。

2.不同佐剂JEV灭活疫苗产生的抗体消长规律将上述制备的4种JEV灭活疫苗分别采用腹腔注射的方式免疫3周龄小鼠,并在一周后加强免疫一次,同时设置商品化疫苗(HW1株)和PBS作为对照组。在免疫前和免疫后2、4、6、8、10周应用ELISA方法检测灭活疫苗的IgG抗体水平。

结果显示:4种不同佐剂灭活疫苗免疫小鼠1周后,除对照组外,其余4种不同佐剂灭活疫苗组和商品化灭活疫苗组的小鼠都产生抗体。加强免疫后4种灭活疫苗组小鼠抗体水平进一步提高,免疫后6周各组小鼠抗体水平达到最高值,与

免疫商品化灭活苗小鼠表现出差异显著(P<0.05),免疫8周后各组小鼠抗体水平变化不大,逐渐趋于稳定。

并于免疫后10周抗体水平有下降趋势。其中Gel 01佐剂疫苗组抗体水平是4种灭活疫苗中最高,603纳米佐剂灭活疫苗组抗体水平在4种灭活疫苗中最低。

3.不同佐剂JEV灭活疫苗诱导的免疫应答将制备的4种灭活疫苗分别免疫小鼠,运用MTS法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖情况,用试剂盒检测上清中IL-2、IL-4和INF-γ细胞因子的水平和血清中IgG1和IgG2A的含量。结果显示:4种灭活疫苗免疫组的淋巴细胞增殖均高于PBS对照组,4种灭活疫苗均能使IL-2、IL-4、INF-γ、IgG1和IgG2A的含量上升,诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答。

其中JEV Gel 01佐剂疫苗组中IL-2、IL-4和IFN-γ的含量较高,与PBS对照组差异显著(P<0.05);Gel 01和1313佐剂疫苗组中,IgG2A的含量显著高于IgG1的含量(P<0.05);JEV Gel 01佐剂疫苗组在刺激小鼠体液免疫和细胞免疫应答效果最好。4.不同佐剂JEV灭活疫苗小鼠免疫攻毒保护试验4种灭活疫苗采用腹腔注射方式分别免疫3周龄小鼠,并于1周后加强免疫一次,二免后1周选用半数致死量相对稳定的猪乙型脑炎SC201301株(Ⅲ型)腹腔攻毒,每只0.6ml。

结果显示:ISA206佐剂灭活疫苗、IMS1313佐剂灭活疫苗、Gel 01佐剂灭活疫苗、603纳米佐剂灭活疫苗对小鼠的保护率分别为80%、70%、90%、60%,其中Ge101佐剂灭活疫苗的保护效果最好。再将Gel 01佐剂灭活疫苗免疫小鼠,选用基因Ⅰ型乙脑病毒(YA1)进行攻毒保护试验,结果显示:Gel 01佐剂灭活疫苗组对基因Ⅱ型保护率分别100%,Gel 01佐剂灭活疫苗能抵抗基因型乙脑病毒的侵袭。

5.最佳佐剂JEV灭活疫苗对猪的安全性及免疫抗体的影响选取佐剂与抗原的最佳组合,Gel 01佐剂灭活疫苗免疫猪,观察灭活疫苗的安全性和对猪的免疫

效果。结果显示:Gel 01佐剂灭活疫苗对猪安全、无副作用,而且免疫后二周,Gel 01佐剂灭活疫苗组与商品疫苗组相比抗体水平显著上升(P<0.05),加强免疫后两周抗体水平出现上升,显著高于HW1株商品化灭活苗组(P<0.05),说明Gel 01佐剂灭活疫苗能刺激猪产生乙脑抗体。