七项呼吸道病毒检测试剂盒 鉴定 使用说明书

七项呼吸道病毒检测试剂盒（鉴定）使用说明书

【产品名称】

通用名称：七项呼吸道病毒检测试剂盒

英文名称：D3 Ultra DFA Respiratory Virus Screen & ID Kit

【包装规格】

鉴定试剂：80人份/盒

【预期用途】

用于临床定性检测7种呼吸道病毒：甲型（A型）流感病毒，乙型（B型）流感病毒，呼吸道合胞病毒，腺病毒，副流感病毒1、2和3型。

【检验原理】

荧光素（FITC）标记的单克隆抗体与病毒抗原结合，形成稳定的抗原-抗体复合物，在荧光显微镜下观察，呈现特异性绿色荧光。

【主要组成成份】

组份名称规格主要成分

1 DFA染色试剂鉴定试剂流感A试剂：

2 mL

每试剂瓶为一项与病毒

抗原相对应的荧光单克

隆抗体

流感B试剂：2 mL

腺病毒试剂：2 mL

呼吸道合胞病毒试剂：2 mL

副流感1试剂：2 mL

副流感2试剂：2 mL

副流感3试剂：2 mL

2 40X浓缩洗液25 mL PBS

3 固定液15 mL 甘油

4 阳性质控板5块包被病毒抗原

【储存条件及有效期】

2ºC-8ºC避光保存18个月。

【适用仪器】

荧光显微镜，激发波长490 nm，发射波长520 nm。

【样本要求】

鼻咽部取样后保存于生理盐水中，应在24小时内送检。

【检验方法】

1、取样：用鼻咽拭子从病人的鼻咽部取样或者使用鼻腔灌洗液，将鼻咽拭子放入储存管中（含有生理盐水）。

2、样本准备步骤：

①将样本充分震荡混匀约10-15秒。

②在400-600xg转速下离心5-10分钟。

③弃上清。

④在沉淀中加2-3 mL PBS缓冲液（不能使用试剂盒中的浓缩洗液），充分震荡混匀约10-15秒。

⑤在400-600xg转速下离心5-10分钟。

⑥吸走上清和黏液层，小心不要吸到沉淀。

⑦重复步骤4到6，直至黏液层被完全去除。

⑧在沉淀中加0.5-1 mL的PBS缓冲液。

⑨用移液器反复吹吸来重悬细胞沉淀，形成一个略混浊的悬液。

3、直接样本测试步骤：

①在8孔板上的孔内滴加25 µL的细胞悬浊液，每样本需滴加七孔。

②样本完全风干。

③在20ºC到25ºC，用预冷的100%丙酮固定细胞约5-10分钟。

④从丙酮中取出载玻片并风干。

⑤在固定并风干的细胞上，每一孔分别滴加不同的DFA鉴定染色试剂，试剂要完全覆盖细胞。

⑥可选步骤：在呼吸道病毒抗原对照板的每孔内滴加相对应的鉴定试剂。抗原对照板包含了被病毒感染的细胞和未感染的细胞（板上标有NEG的孔为阴性对照孔，但滴加的是DFA染色试剂（任选一种），检验试剂是否有假阳性）。

⑦将载玻片放于35ºC到37ºC的恒温箱内孵育15到30分钟，为保持其湿润最好放置于带盖的盒子内。

⑧用事先稀释好的洗液（试剂盒中40X浓缩洗液）漂洗染色细胞。为了更有效地洗涤，请将玻片在洗液中反复浸蘸4次左右。

⑨使用新的稀释洗液再洗一次。

⑩用去离子水再洗一遍。

4、观察实验结果

滴加2到3滴固定液，并加盖盖玻片，要注意避免产生气泡。在200倍放大荧光显微镜下观察结果。

【结果判断】

200倍显微镜下每视野找到≥2个绿色荧光细胞即为阳性，否则为阴性。阴性细胞被Evans Blue染成红色。【检验结果的解释】

建议在检测样本前，首先对对照进行检测，以保证测试的可靠性，当观察到被感染的细胞中的明亮的苹果绿荧光时为阳性反应。未感染的阴性细胞则被荧光试剂中所包含的伊文斯蓝染为暗红色。实验人员应注意不要将成团细胞吸附抗体而产生的荧光与病毒特异性的荧光染色相混淆。在少数情况下，因为中毒或不恰当的储存而导致的死细胞会非特异性的吸附抗体，呈现为灰暗和模糊的绿色荧光，充分洗涤可以帮助消除此类非特异性染色。

对于每种病毒，典型的苹果绿荧光染色样式如下：

流感病毒A型和B型：荧光染色为胞浆型，胞核型或两者皆有。胞浆型染色通常为带大块细胞包涵物的颗粒状荧光。而胞核型染色为均一的明亮荧光。

RSV：胞浆型荧光，为颗粒状并在合胞处有小块的细胞包涵物。

腺病毒：颗粒状的胞浆型荧光，明亮的胞核型荧光，或者两者皆有。

副流感病毒1、2、3型：胞浆型荧光，为颗粒状并有不规则的包涵物。2型和3型可引起合胞体的形成。

在很多研究中均报道在单份样本中发现超过一种以上的病毒的同时感染。如果在8孔玻片上多个孔中均发现有荧光细胞则表明有多重病毒同时存在。根据与针对单种病毒的荧光试剂反应后是否有荧光染色来确定样本中存在的病毒。在此类情况下，结果应报道为“直接样本检测发现某某病毒和某某病毒”或“细胞培养分离出某某病毒和某某病毒”。

A. 直接样本检测结果

样本的质量取决于其中所含上皮细胞的数量，通过在放大倍数200倍下对不同视野进行观察来评价样本的质量。合格的样本要求在每个视野下至少有两个上皮细胞。阴性结果为在至少含有20个柱状上皮细胞的样本中无荧光染色。如果样本中上皮细胞数量少于20个则为样本不合格，此类样本的检测结果被视为无效，应重新采样再进行检测，或者将剩余的样本进行细胞培养后再检测。

如对合格的样本检测后未发现荧光染色的细胞，结果应被报告为“可能为阴性，在直接样本检测中未发现流感病毒A型，流感病毒B型，副流感病毒1、2、3型，腺病毒和呼吸道合胞病毒”。但是这些阴性结果应通过细胞培养加以确认。

检测为阴性的样本，如果细胞培养后检测为阳性结果，则应被报告为“细胞培养后分理出某病毒”，此处的某病毒为所检测出的流感病毒A型，流感病毒B型，副流感病毒1、2、3型，腺病毒和呼吸道合胞病毒。（见【检测结果的解释】B部分）

如果样本中发现被荧光染色的细胞，则表明该试剂所对应的病毒为阳性。结果应被报告为“直接样本检测某病毒阳性”，此处的某病毒为所检测出的流感病毒A型，流感病毒B型，副流感病毒1、2、3型，腺病毒和呼吸道合胞病毒。

B.细胞培养分离/确认试验的检测结果

需对整个细胞点或单层细胞进行检查以确定是否有荧光染色的阳性细胞。如果未发现被荧光染色的细