详细版微生物分子育种技术.ppt
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四个必要条件：工具酶，基因，载体和受体细胞。
......
5
第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
为了在分子水平上对 DNA 进行人工切割和拼接等操作， 需要采用一系列重要的酶作为工具。
一般把这些用以进行 DNA 分子切割、片段修饰和连接等 重组操作的酶称为工具酶。
重组 DNA 技术涉及的工具酶种类繁多、功能各异。限制 性核酸内切酶、 DNA连接酶、反转录酶、 DNA聚合酶等
1 重组 DNA 技术的基本过程
重组DNA技术：
第一节
是将一个含有目的基因的DNA片段经体外操作与载体连接， 并转入到受体细胞，使之在受体细胞内扩增、表达的操作过 程。
......
4
第十章 第一节 重组DNA技术
1 重组 DNA 技术的基本过程
重组 DNA 技术的基本过程： ① 含目的基因的 DNA 片段的分离与制备； ② 载体的构建； ③ 含目的基因的 DNA 片段与载体相连接； ④ 将重组分子送人受体细胞，并在其中复制、扩增； ⑤ 筛选带有重组 DNA 分子的转化细胞； ⑥ 鉴定外源基因的表达产物。
其他略 DNA克隆
DNA测序
......
13
第十章 第二节 酶的定向进化
定向进化技术：
第二节 通过DNA重排技术等人为方法制造大量变异体，施加以确
定的选择压，让目标生物向着确定的方向加速进化的育种 方法。
......
14
第十章 第二节 酶的定向进化
定向进化的方法：
1、定点突变，指定位点上引人特定的碱基对变化的技术（已 知序列）。
......
7
第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
2 DNA连接酶 与 DNA分子的体外连接 DNA连接酶的作用是催化双链 DNA 缺口处相邻的两个脱
氧核昔酸残基连接。 常用的 DNA 连接酶有两种：
大肠杆菌编码的 DNA连接酶（黏性末端） 大肠杆菌T4噬菌体编码的 T4DNA连接酶（黏性、平末端）
2、易错 PCR，PCR时会以一定的频率发生碱基错配，可进行 随机诱变。
3、DNA重排，将同源DNA随机切成小片段后用PCR进行重聚以 得到大量重组DNA的育种方法。 （随机）
......
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第十章 第三节 基因组重排
第三节
基因组重排技术： 利用多亲本同时进行原生质体融合产生大量随机融合子，
从融合子中挑选需要方向特性的育种方法。
思考题： 1、重组DNA技术？ 2、定向进化技术？ 3、DNA重排技术？ 4、基因组重排技术？ 5、代谢工程？
......
1
Biblioteka Baidu
第十章 微生物分子育种技术
重组 DNA 技术的发展从根本上改变了生物技术的研究 和开发模式。
可以直接地、有针对性地在 DNA 分子水平上改造生物 的遗传性状。
通过转人外源基因，微生物和动植物细胞可以产生出自 身原来没有的蛋白质。
第十章 第一节 重组DNA技术
3 外源基因的获得
1、DNA文库或cDNA文库（真核的mRNA逆转录得到），需要筛 选确定； 2、DNA的人工合成（引物或者大片段的不连续合成） 3、PCR扩增（目标DNA两端设计引物扩增出来）
......
12
第十章 第一节 重组DNA技术
4 载体-宿主系统
获得的DNA需要与媒介（类似噬菌体、质粒）“重组” （人工拼接）后，进入“宿主”（生物反应器或目标微生物） 表达。
......
6
第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
1 限制性内切酶
识别和切割双链 DNA 分子内特殊核昔酸顺序的酶统称为 限制性内切酶，简称限制酶。
限制酶分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ 型。只有 Ⅱ型酶被广泛应 用于 DNA 分子的体外重组。
Ⅱ 型酶特点： ① 识别特定的核昔酸序列；② 具有特 定的酶切位点，切割后形成黏性末端（或平末端）；③ 没有 甲基化修饰酶功能，条件简单。
......
8
第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
2 DNA连接酶 与 DNA分子的体外连接 带有非互补戮性末端的片段（找相应的酶） 带有相同薪性末端的片段（防止自环化） 带有平末端的片段（效率不高）
......
9
第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
3 DNA 聚合酶与 PCR 技术 DNA连接酶的作用是体外实现DNA的“复制”过程。
PCR 是聚合酶链式反应的简称，是一种体外决速扩增特定 DNA 片段的技术。
......
10
第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
4 其他工具酶
重组 DNA 技术中还经常用到反转录酶、末端脱氧核昔酸 转移酶、 T 4多核昔酸酶、碱性磷酸酶、核酸外切酶和单链核 酸内切酶等。
......
11
同样，利用重组 DNA 技术，也可以使一些原来存在量 极低的、但有重要工业或医学用途的小分子或蛋白质之外的 大分子物质得以大量生产。
微生物生长迅速、培养成本低成为理想宿主。
......
2
第十章 微生物分子育种技术
1. 重组DNA技目术录
2．酶的定向进化 3．基因组重排 4．代谢工程
......
3
第十章 第一节 重组DNA技术
......
16
第十章 第四节 代谢工程
第四节
代谢工程： 又称为途径工程，或代谢设计，是利用DNA重组技术修饰
细胞中特定的生化反应或引入新的生化反应，以提高特定 代谢物的产量或改善细胞的其他性能的方法。
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第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
为了在分子水平上对 DNA 进行人工切割和拼接等操作， 需要采用一系列重要的酶作为工具。
一般把这些用以进行 DNA 分子切割、片段修饰和连接等 重组操作的酶称为工具酶。
重组 DNA 技术涉及的工具酶种类繁多、功能各异。限制 性核酸内切酶、 DNA连接酶、反转录酶、 DNA聚合酶等
1 重组 DNA 技术的基本过程
重组DNA技术：
第一节
是将一个含有目的基因的DNA片段经体外操作与载体连接， 并转入到受体细胞，使之在受体细胞内扩增、表达的操作过 程。
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第十章 第一节 重组DNA技术
1 重组 DNA 技术的基本过程
重组 DNA 技术的基本过程： ① 含目的基因的 DNA 片段的分离与制备； ② 载体的构建； ③ 含目的基因的 DNA 片段与载体相连接； ④ 将重组分子送人受体细胞，并在其中复制、扩增； ⑤ 筛选带有重组 DNA 分子的转化细胞； ⑥ 鉴定外源基因的表达产物。
其他略 DNA克隆
DNA测序
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第十章 第二节 酶的定向进化
定向进化技术：
第二节 通过DNA重排技术等人为方法制造大量变异体，施加以确
定的选择压，让目标生物向着确定的方向加速进化的育种 方法。
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第十章 第二节 酶的定向进化
定向进化的方法：
1、定点突变，指定位点上引人特定的碱基对变化的技术（已 知序列）。
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第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
2 DNA连接酶 与 DNA分子的体外连接 DNA连接酶的作用是催化双链 DNA 缺口处相邻的两个脱
氧核昔酸残基连接。 常用的 DNA 连接酶有两种：
大肠杆菌编码的 DNA连接酶（黏性末端） 大肠杆菌T4噬菌体编码的 T4DNA连接酶（黏性、平末端）
2、易错 PCR，PCR时会以一定的频率发生碱基错配，可进行 随机诱变。
3、DNA重排，将同源DNA随机切成小片段后用PCR进行重聚以 得到大量重组DNA的育种方法。 （随机）
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第十章 第三节 基因组重排
第三节
基因组重排技术： 利用多亲本同时进行原生质体融合产生大量随机融合子，
从融合子中挑选需要方向特性的育种方法。
思考题： 1、重组DNA技术？ 2、定向进化技术？ 3、DNA重排技术？ 4、基因组重排技术？ 5、代谢工程？
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第十章 微生物分子育种技术
重组 DNA 技术的发展从根本上改变了生物技术的研究 和开发模式。
可以直接地、有针对性地在 DNA 分子水平上改造生物 的遗传性状。
通过转人外源基因，微生物和动植物细胞可以产生出自 身原来没有的蛋白质。
第十章 第一节 重组DNA技术
3 外源基因的获得
1、DNA文库或cDNA文库（真核的mRNA逆转录得到），需要筛 选确定； 2、DNA的人工合成（引物或者大片段的不连续合成） 3、PCR扩增（目标DNA两端设计引物扩增出来）
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第十章 第一节 重组DNA技术
4 载体-宿主系统
获得的DNA需要与媒介（类似噬菌体、质粒）“重组” （人工拼接）后，进入“宿主”（生物反应器或目标微生物） 表达。
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第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
1 限制性内切酶
识别和切割双链 DNA 分子内特殊核昔酸顺序的酶统称为 限制性内切酶，简称限制酶。
限制酶分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ 型。只有 Ⅱ型酶被广泛应 用于 DNA 分子的体外重组。
Ⅱ 型酶特点： ① 识别特定的核昔酸序列；② 具有特 定的酶切位点，切割后形成黏性末端（或平末端）；③ 没有 甲基化修饰酶功能，条件简单。
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第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
2 DNA连接酶 与 DNA分子的体外连接 带有非互补戮性末端的片段（找相应的酶） 带有相同薪性末端的片段（防止自环化） 带有平末端的片段（效率不高）
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第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
3 DNA 聚合酶与 PCR 技术 DNA连接酶的作用是体外实现DNA的“复制”过程。
PCR 是聚合酶链式反应的简称，是一种体外决速扩增特定 DNA 片段的技术。
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第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
4 其他工具酶
重组 DNA 技术中还经常用到反转录酶、末端脱氧核昔酸 转移酶、 T 4多核昔酸酶、碱性磷酸酶、核酸外切酶和单链核 酸内切酶等。
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同样，利用重组 DNA 技术，也可以使一些原来存在量 极低的、但有重要工业或医学用途的小分子或蛋白质之外的 大分子物质得以大量生产。
微生物生长迅速、培养成本低成为理想宿主。
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第十章 微生物分子育种技术
1. 重组DNA技目术录
2．酶的定向进化 3．基因组重排 4．代谢工程
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第十章 第一节 重组DNA技术
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第十章 第四节 代谢工程
第四节
代谢工程： 又称为途径工程，或代谢设计，是利用DNA重组技术修饰
细胞中特定的生化反应或引入新的生化反应，以提高特定 代谢物的产量或改善细胞的其他性能的方法。
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