2023高通量测序技术在肿瘤精准诊疗中的临床应用

2023高通量测序技术在肿瘤精准诊疗中的临床应用摘要高通量测序技术与传统的基因检测技术相比，实现了多样本、多位点、多变异类型的大规模平行检测，在提供临床诊疗信息的同时还能挖掘大量具有研究价值的信息，其在临床的应用范围日益广泛。

另一方面，基于基础研究的不断深入，医药产业的转化产出也逐渐加大，靶向治疗、免疫治疗等新型方式将肿瘤带入“个体化精准诊疗”时代，从病种管理逐渐发展到基因管理，以患者基因组大数据为核心，实现疾病的分类、诊断、治疗与预后方案的制定，因此基因检测在整个肿瘤的管理过程中占据了不可替代的重要作用。

目前，高通量测序在肿瘤临床应用中涉及了靶向治疗、辅助诊断、评估预后、复发或耐药监测等诸多方面，本文对以上各方面的临床实践现状和进展进行详细介绍。

近年来，肿瘤精准诊疗的概念不断“微观化”，同时伴随着生物信息学与测序技术的交叉融合，基因检测越来越广泛地应用于临床各个领域。

高通量测序技术，即二代测序（next generation sequencing，NGS）一次检测即可实现对大量DNA片段进行测序，极大地推动了精准诊疗概念在肿瘤全程管理中的建立［1 ］。

肿瘤的治疗方式经历了变化的轨迹：从手术治疗到放疗、化疗，再到靶向治疗、免疫治疗等新方法，肿瘤的发生发展机制复杂，但其本质是基于驱动基因变异导致的疾病，基因检测可获取相应变异信息。

因此，随着基因组学的不断深入发展，NGS技术在肿瘤临床应用中扮演的角色也越来越重要。

一、NGS相比传统分子技术的优势当NGS技术还未应用于临床肿瘤伴随诊断时，已有多个基于免疫组化技术、荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术和荧光免疫杂交技术等传统分子检测技术的产品作为靶向治疗药物的伴随诊断试剂盒在国内外获得批准。

这些传统分子检测技术存在明显局限性：（1）检测通量低，单次检测只能测出有限的基因变异数目和类型；（2）无法检出未知的变异，可能会发生罕见变异的漏检，导致假阴性结果［2 ］；（3）无法区分具体变异位点，如表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因19号外显子的缺失变异有多种核苷酸变异形式，PCR方法无法区分具位点［3 ］；（4）近年来肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）、微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）与免疫治疗效果的相关性研究，同源重组修复缺陷（homologous recombination deficiency，HRD）与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制剂治疗效果的研究越来越多，传统分子检测无法为这两种治疗方法提供有效的标志物信息［4 ］。

与传统检测技术相比，NGS技术具有较多优势：（1）可同时检出多个变异信息，提供更全面的信息，包括肿瘤相关基因分型与预后评估、多个靶向治疗药物靶点信息、免疫治疗方案选择、预后评估等［4 ］；（2）实现患者病情发展的实时监测［5 ］；（3）单基因单变异位点平均成本较低［6 ］。

然而，技术之间的优劣对比没有绝对界限，能够满足临床需要的选择才是最优的技术。

NGS技术也有其自身的局限性，其对PCR的信号放大作用依赖度高，尤其在液体活检领域，低丰度变异的判别仍是考验；NGS技术目前测序读长较短，在高GC区域、同源序列区域、重复序列区域的捕获效率、覆盖程度可能出现不均一的情况［7 ］。

NGS检测的时间和经济成本较高、操作复杂、对实验室的硬件设施要求较高，且NGS检测结果信息量大，需要有相应专业背景的人员进行数据解读。

传统PCR检测技术检测通量较小，时间和经济成本较低、操作简便、易在医院落地。

因此，传统PCR检测技术与NGS技术在临床的应用仍会是互补的存在状态。

二、NGS在肿瘤辅助诊断中的应用肿瘤的发生发展是基因变异与环境共同影响的长期过程，其中约有5%~10%的肿瘤属于遗传性肿瘤综合征，由一个或多个基因变异导致，变异多为常染色体显性遗传，如遗传性乳腺癌、甲状腺髓样癌等［8 ］。

如何对高危人群筛查，进行有效的防治和干预，是遗传性肿瘤领域的重点。

NGS可作为遗传性综合征相关基因变异筛查的有效手段，通过定制靶向基因包检测相关基因，在一定程度上为高危人群提供关键的信息、作出风险评估。

美国国立癌症综合网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）、美国临床肿瘤学会（American Society of ClinicalOncology，ASCO）均提到，推荐符合临床指征的高危人群进行相关的基因检测［9 , 10 ］。

如林奇综合征（Lynch syndrome，LS）相关的高危人群建议对错配修复（mismatch repair，MMR）相关基因如MutL同源物1基因（mutL protein homolog 1，MLH1）、MutS同源物2基因（mutS homolog 2，MSH2）、MutS同源物6基因（mutS homolog 6，MSH6）、PMS1同源物2基因（PMS1 homolog 2，PMS2）等进行检测［11 , 12 , 13 , 14 ］；遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征（hereditary breast-ovarian cancer，HBOC）相关的高危人群建议对乳腺癌易感基因1/2（breast cancer susceptibility gene 1/2，BRCA1/2）、BRCA1相关环域蛋白1基因（BRCA1 associated RING domain 1，BARD1）、BRCA2定位协作基因（partner and localizer of BRCA2，PALB2）、磷酸酯酶与张力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN）、细胞周期检测点激酶2基因（checkpoint kinase 2，CHEK2）等基因进行检测［12 ］。

然而值得注意的是，NGS检出的信息量巨大，如何评估基因与疾病的关联性、发病率、风险程度等还缺乏全面的研究和指南［15 ］，另一方面多基因包检测试剂盒的应用会导致意义未明变异（variants of uncertain significance，VUS）结果出现的概率增加，在临床实践中如何对这些变异进行解读、评估与管理仍然存在极大的挑战［16 ］。

因此NGS 在遗传性肿瘤综合征中的应用，尤其是多基因包检测试剂盒在临床的检测仍需谨慎。

基因检测在细胞病理学诊断方面也可起辅助作用，如甲状腺结节的术前细针穿刺（fine-needle aspiration，FNA）在临床上约有20%~30%的病理结果为“意义不明确的结节类型”（Bethesda Ⅲ、Ⅳ）［17 ］，其中甲状腺结节的恶性率仅有15%左右，如不做明确诊断，可能会导致临床上对于甲状腺癌的过度治疗。

V-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1基因（v-raf murine sarcoma viral oncogene homologue B1，BRAF）等基因的突变可以协助判断，但BRAF V600E单位点无法全面评估，NGS多基因的检测可辅助临床细胞学判断意义不明确的甲状腺结节的良恶性［18 ］。

此外，骨与软组织肿瘤类别繁杂、病理形态多样，临床病理诊断难度较大，而不同类型的软组织肿瘤具有特异的基因融合/重排或拷贝数变异等分子标志物，如尤文肉瘤断裂区域1基因（EWS RNA binding protein 1，EWSR1）-SMAD家族成员3基因（SMAD family member 3，SMAD3）、GRB2关联结合蛋白1基因（GRB2-associated binding protein 1，GAB1）-ABL-1非受体酪氨酸激酶基因（ABL proto-oncogene 1，non-receptor tyrosine kinase，ABL1）等基因融合的检出可协助纤维母细胞性肿瘤的诊断。

NCCN指南已将NGS检测推荐用于肉瘤的辅助诊断中［19 ］。

三、NGS在肿瘤靶向治疗和免疫治疗中的应用靶向治疗药物可在分子水平上特异作用于相关基因靶点，通过阻止信号分子与受体的结合、抑制激酶的活化等机制精准抑制目标细胞增殖、诱导凋亡等，已成为临床肿瘤治疗中非常重要的方式［20 ］。

截至2023年2月，我国国家药品监督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）已批准了17款基于NGS的检测试剂盒。

这些检测试剂盒多为小基因包靶向测序试剂盒，通过定向相关基因组区域进行测序获得变异信息，与非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）相关的获批试剂盒最多［21 ］。

随着分子靶点的研究，截至2023年初，在NSCLC中多个耐药靶点、难治靶点、罕见靶点获得了突破性进展。

目前埃万妥单抗、莫博赛替尼、舒沃替尼已获FDA批准可用于晚期EGFR基因第20号外显子插入变异的NCLSC中，填补了EGFR基因20号外显子插入变异对一代、二代表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）（如吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼等）不敏感［22 ］，缺乏有效药物的空白；如2021年，首款针对Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因（Kirsten rats arcomaviral oncogene homolog KRAS）基因p.G12C变异的靶向药索托拉西布获批上市，弥补了KRAS基因变异靶向药缺乏的空白［23 ］；2022年FDA批准T-DXd（DS-8201）用于HER2（erb-b2 receptor tyrosine kinase 2）基因变异的转移性NSCLC 患者，是NSCLC的首款HER2靶向药物，具有里程碑意义。

而随着PARP抑制剂的疗效研究在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤中取得的进展，临床对于同源重组修复（homologous recombination repair，HRR）基因检测及HRD检测的需求也逐渐增大，其中HRD检测中阴阳性的判定需结合BRCA基因变异状态和基因组瘢痕（genomic scar，GS）标志物的综合评分［24 ］。

除了BRCA1/2基因以外，其他HRR基因的变异同样也会导致HRD状态，如共济失调毛细血管扩张突变基因（ATMserine/threonine kinase，ATM），共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3相关激酶基因（ATR serine/threonine kinase，ATR），BARD1，布鲁姆综合征蛋白基因（BLM RecQ like helicase，BLM）、BRIP1、CHEK2、MRE11减数分裂重组11同源物A基因（MRE11A homolog A，double strand br repair nuclease，MRE11A），PALB2，RAD51同源物基因C/D （RAD51 paralog C/D，RAD51C/D），SLX4结构特异性核酸内切酶亚基基因（SLX4 structure-specific endonuclease subunit，SLX4），X射线修复补缺陷修复2基因（X-ray repair cross complementing 2，XRCC2）等基因。