凝胶渗透色谱仪(GPC)基础知识及操作培训
现代材料分析测试技术 凝胶渗透色谱 GPC
• 含有固化剂的EPOXY
酚醛树脂在室温条件下的自然 固化现象观察
8 6 4
RI/mv
2 0 -2 -4 15
1d 2d 5d 11d 19d
20
25 t/min
30
35
补充内容：水相GPC的应用
• 用于溶解于水的聚合物 • 较有机相GPC要复杂得多
水相GPC中存在的问题
• 非体积排除效应
• 分子尺寸不能直接反映分子质量及其分布 的信息。
聚合物分子量的特点
1.分子量大 2.多分散性
3.分子量统计平均值+分布系数才能确切 描述聚合物分子量
GPC分离机理
二、GPC仪器的基本配置
• • • • • • 溶剂贮存器(Solvent) 泵(Pump) 进样系统(Autosample ) 色谱柱(column) 检测器(detector) 数据采集与处理系统(Data Acquirement and Process System) • 废液池 (Waste)
（1）分子质量变化不大
• 这是由于分子链发生了氧化现象，生成了 其它物质，如羟基被氧化为醛、酮或酯的 结构，这时聚合物整体的分子链长度没有 明显的改变，但聚合物的性质发生了变化， 这时可以通过红外的方法检测其分子链结 构组成的变化。
（2）分子质量降低
• 有些高聚物的老化是因为分子链的断裂， 这时分子量急剧下降，使产品性能发生显 著的变化。如纤维强度下降，变脆，达不 到使用要求。
仪器基本配置流程图
3 2.5 2
RI/mv
1.5 1 0.5 0 -0.5 0 5 10 15 20 25 30 35 t/min
泵(515 HPLC Pump)
• 要求精度很高
J2ScientificGPC凝胶渗透色谱操作指导
J2ScientificGPC凝胶渗透色谱操作指导J2 Scientific GPC凝胶渗透色谱操作指南应用部分在您阅读本指南之前，最好先熟悉仪器的操作，并已经掌握<软件中文操作手册>中的内容。
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凝胶渗透色谱原理简介Accuprep系统结构及工作框图注意事项如何建立适合我的应用的方法GPC柱的维护和重新装填如何备份数据常见故障分析凝胶渗透色谱原理简介凝胶渗透色谱，简称GPC，是一项比较传统的分离技术，GPC的柱子由化学惰性的中空小球组成，利用空间排阻的原理对样品进行分离，详见下图:小分子通过填料“球”中的孔大分子不能从孔中通过由于小分子化合物会从填料的孔中穿过，而大分子从填料周围的空间穿过，会造成小分子与大分子之间的行程差距，这样大分子与小分子会先后从柱中馏出，起到分离的作用。
由于这一分离技术不受样品极性的影响，所以对于色谱用户来说，是一种非常有效解决色谱柱不能分开的样品的手段，尤其是对于脂肪类，蛋白及色素类大分子干扰物，这些物质对于色谱柱，进样口来说非常危险，而在生物源样品当中的含量一般又比较高，那么在进行样品分析之前进行一步GPC净化就显得非常必要了。
Accuprep系统结构及工作框图TM是由美Accuprerp国J2 Scientific公司生产的凝胶渗透样品净化系统，早在上世纪80年代就引入中国，目前其产品型号主要有手动AccuPrepJr和自动AccuPrep两种，在2005年该公司又推出了新型TM 的AccuprerpMPS系统，体积进一步小型化，并能整合计算机及在线浓缩，SPE等多种技术，更加趋于成熟。
由于目前大家采购这一仪器主要是为了提高效率，本指南将重点放在对自动仪器的介绍方面。
TM自动系 TM手动系Accuprerp统 Accuprerp统AccuPrep MPS自动系统 AccuPrep MPS +AccuVap GPC在线浓缩系统一台完整的GPC系统包括几个部分:触摸屏，控制模块，输送泵，检测器，自动进样器和软件部分。
凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱目录一、基本原理 (2)1.1 凝胶的特性 (2)1.2 色谱的分离原理 (3)1.3 凝胶渗透色谱在分离技术中的应用 (5)二、仪器设备 (6)2.1 凝胶渗透色谱仪的主要组成部分 (7)2.2 主要性能指标及选择 (9)2.3 仪器设备的清洁与维护 (9)三、样品前处理 (11)3.1 样品的选择与制备 (11)3.2 样品浓缩与净化 (12)3.3 样品检测方法的建立 (13)四、实验操作流程 (14)4.1 样品进样 (16)4.2 柱塞泵的设置与调节 (17)4.3 检测器的选择与校准 (18)4.4 数据处理与结果分析 (19)五、理论基础与数学模型 (20)5.1 凝胶渗透色谱的理论基础 (22)5.2 数学模型在凝胶渗透色谱中的应用 (23)5.3 实验数据的解释与处理 (24)六、应用领域 (26)6.1 在化学领域中的应用 (28)6.2 在生物医学领域中的应用 (29)6.3 在环境科学领域中的应用 (30)七、常见问题与解决方案 (31)7.1 常见问题及原因分析 (32)7.2 预防措施与解决策略 (33)八、实验安全与防护 (34)8.1 实验室安全规程 (36)8.2 个人防护装备的使用 (37)8.3 应急处理措施 (38)九、最新研究进展 (39)9.1 新型凝胶材料的研究与应用 (40)9.2 色谱技术的创新与发展 (41)9.3 聚合物凝胶渗透色谱法的探索 (43)一、基本原理它的基本原理是利用具有不同孔径大小的多孔凝胶颗粒作为固定相，将待分离的混合物通过凝胶柱进行分离。
在色谱过程中，待分离的混合物会与凝胶颗粒发生相互作用，从而导致不同成分在凝胶颗粒之间的分配系数和扩散速率的差异。
根据这些差异，混合物中的各个成分可以通过不同的时间顺序依次通过凝胶柱，从而实现对混合物中各组分的高效分离。
GPC的关键参数包括：凝胶颗粒的大小和形状；溶液流速；压力；洗脱剂的选择和浓度。
GPC-1：凝胶渗透色谱操作手册
凝胶渗透色谱操作手册一． 高聚物的分子量及分子量分布对于小分子化合物，无论有机的或无机的，都有固定的分子量，并且可以通过分子式直接计算出来。
但对于高聚物来说，除了少数几种蛋白质之外，分子大小都是不一样的，它是由许多具有相同链节结构，但不同链长即不同分子量的各种大小分子所组成的混合物。
所以，高聚物的分子量实际上是各种大小不同高分子的分子量的统计平均值。
高聚物的分子量具有多分散性，每一个高聚物都有它的分子量分布。
常用的高聚物的平均分子量有四种表示方法：数均分子量，重均分子量，Z 均分子量和粘均分子量。
1． 数均分子量M n数均分子量被定义为在一个高聚物体系中，高聚物的总重量（以克为单位）除以高聚物中所含各种大小分子的总摩尔数，即数均分子量是高聚物体系中各种分子量的摩尔分数与其相应的分子量的乘积所得的总和。
它是按分子数的统计平均。
n---摩尔数 w---重量 N---摩尔分数 M---分子量∑∑∑∑∑===−−iii ii i i n M N n M n n wM 2． 重均分子量M w在一个高聚物体系中，各种大小分子的重量分数与其相应的分子量相乘，所得的各个乘积的总和，定义为重均分子量。
它是按重量统计平均的。
W---重量分数∑∑∑∑∑===iii ii i i 2i i w __M W w M w M n M n M 3． Z 均分子量M zZ 均分子量是按Z 量的统计平均。
Z 的定义为Z=w i M i 。
Z 均分子量的定义为：一个高聚物试样中，各分子量的Z 值的分数及其相当的分子量的乘积的总和。
∑∑∑∑∑∑===2i i 3i i i i 2i i i i i z __M n M n M w M w Z M Z M 由于Z=w i M i 没有具体的物理意义，因此Z 均分子量也没有具体的物理意义。
4． 粘均分子量M η用溶液粘度法测得的平均分子量为粘均分子量。
定义为：∑=α1αi i η__)M W (Mα为[η]=kM α公式中的指数。
第2节 凝胶色谱(GPC)
3.凝胶色谱分离机理
3.1凝胶色谱的色谱过程方程
凝胶色谱柱是用多孔材料填充的，其分离能力与 填料孔径无关。 GPC柱的总体积有3部分组成，即填料骨架体积、 填料孔体积及填料颗粒间体积。其中填料骨架体 积对分离不起作用，柱空间体积主要由后两部分 组成。因此当把色谱方程VR＝VM+KVS用于凝胶 色谱时，VM代表填料颗粒间体积，VS代表填料孔 体积，VR也称为淋洗体积。样品在分离过程中， 大分子的保留体积为VM，小分子的保留体积为 VM+VS。分配系数K在0到1之间。
2.1间接测定法
这是通过测定淋洗体积推测相应的分子量。 如用虹吸法或计滴法来测定淋洗体积。随 着凝胶色谱的不断发展，仪器流动相速度 的稳定性不断提高，也可以直接测定保留 时间作为分子量标记。 间接法测定分子量的优点是仪器设备简单， 但不能直接得出分子量的数值，需采用标 准进行校正，数据处理较为复杂。
2.3光散射法
用此法可以直接测出淋出液中聚合物的重均分子 量，是一种测定绝对分子量的方法。 该法所使用的仪器为小角激光光散检测器（low angle laser light scattering, LALLS），其工作原 理如下：当光通过高分子溶液时，会产生瑞利散 射，散射光强度及其对散射角θ（即入射光与散射 光测量方向的夹角）和溶液浓度C的依赖性与聚合 物的分子量、分子尺寸、分子形态有关，因此可 用光散射的方法研究高分子溶液的分子量等参数。
3.2.4 热力学理论
该理论认为，决定GPC分离的因素，不仅有胶体的孔径大 小，而且包括在一定溶剂中高聚物分子构像的尺寸分布。 Casassa研究了溶液中不同构像的分子链在同一胶体孔洞 大小上的分离他假设孔洞内外的溶质分子处于平衡，而且 两相是那样的稀,以致高聚物之间无作用。他用无规飞行 统计来描述分子的构像，即符合方程式： 2 式中，Pn（r）表示距坐标原点为矢量r的位置上，无规飞 行出现n次的几率密度；b2表示聚合物链段的平均平方长 度。上式在分散（dissipative）物理过程中是基本的，适 用于各种边界条件。
凝胶渗透色谱法GPC
样品 填充物颗粒 尺寸大的高分子不能渗透到凝胶孔穴中而受到排斥，只能从凝胶粒间流过，最
先流出色谱柱，即其淋出体积最小；中等体积的高分子可以渗透到凝胶的一些 大孔中而不能进入小孔，比体积大的高分子流出色谱柱的时间稍后、淋出体积 大 中
稍大；体积比凝胶孔穴尺寸小得多的高分子能全部渗透到凝胶孔穴中，最后流
超速离心沉降平衡法
粘度法 凝胶渗透色谱法GPC 飞行时间质谱
1×104～1×106
1×104～1×107 1×103～1×107 1×104以下
Mw ，Mz
粘均 Mh 各种平均 Mn ，Mw
相对
相对 相对 绝对
凝胶渗透色谱法GPC
凝胶渗透色谱法: Gel permeation chromatography, GPC； 又称体积排阻色谱法：Size exclusion chromatography, SEC； 是一种根据尺寸分离高分子的色谱技术
1 1 1 K1 lg M 2 lg M1 lg 1 2 1 2 K2
出色谱柱、淋出体积最大。
孔穴
小
因此，聚合物的淋出体积与高分子的体积即分子量的大小有关，分子量越
大，淋出体积越小。分离后的高分子按分子量从大到小被连续的淋洗出色谱柱
并进入检测器。
GPC-传统校正曲线
传统校正曲线 a)浓度检测器 b)一个使用标准分子量样品校正过的GPC/SEC柱子 c)检测相对分子量和分子量分布
浓度检测器不断检测淋洗液中高分子的浓度。
常用的浓度检测器为示差折光仪，其浓度响 应是淋洗液的折光指数与纯溶剂（淋洗溶剂）
的折光指数之差，由于在稀溶液范围内，与
溶液浓度成正比，所以直接反映了淋洗液的 浓度即各级分的含量，下图是典型的GPC谱
GPC原理及应用
GPC原理及应用GPC是凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography）的缩写，也叫凝胶渗透层析，是一种高效液相层析技术。
GPC通过选择具有不同大小的凝胶微球作为填料，根据样品溶质在凝胶微球之间穿过的速度差异，来分离和测定样品中不同分子量的物质。
下面将对GPC的原理和应用进行详细介绍。
1.GPC的原理：GPC的原理基于溶胶分子在凝胶填料内的渗透和扩散过程。
当样品进入GPC柱内时，其中的分子按照大小顺序渗透和扩散，较大分子渗透速度较慢，较小分子渗透速度较快。
最终，通过GPC柱尾部逐渐流出的物质被检测器检测到，从而根据峰形和峰高得到样品中分子量分布的信息。
2.GPC的仪器和填料：GPC的仪器通常包括一个耐压柱和一个检测器。
耐压柱内常用的填料有硅胶凝胶、聚合物凝胶、交联聚合物凝胶等。
这些填料具有大小不一的孔隙结构，可以使不同分子量的物质在填料中有不同的渗透速度。
3.GPC的操作步骤：（1）选取适当的填料和溶剂，根据待测样品的性质和分子量范围来选择。
（2）将待测样品溶解在溶剂中，并进行过滤以去除杂质。
（3）将样品溶液注入耐压柱中，通过泵送使样品通过填料。
（4）接收柱尾流出的溶液，并利用检测器进行检测。
（5）绘制出峰形图，并根据峰高和峰形来分析样品中的分子量分布。
4.GPC的应用：（1）分子量分析：GPC可用于测定聚合物、蛋白质、多肽等样品中的分子量分布。
这对于许多工业领域、材料科学和生命科学的研究具有重要意义。
（2）质量控制：GPC可以用于检测和监控聚合物产品的分子量分布，可以用来判断产品的质量稳定性和一致性。
（3）材料筛选：GPC可以用于对不同样品中的聚合物进行分子量分析，从而筛选出合适的材料用于特定应用，例如制备高效电池和传感器材料。
（4）药物研发：GPC可以用于测定药物分子中的分子量分布，帮助药物研发人员追踪和调整合成过程中分子量的变化。
GPC作为一种高效液相层析技术，在多个领域都有重要的应用价值。
GPC-1：凝胶渗透色谱操作手册
6． 到 设 定 的 运 行 时 间 后 ， 仪 器 自 动 停 止 数 据 采 集 ， 窗 口 底 栏 显 示 Single inject-complete。
2． 点 Single，输入样品名，选择 inject broad samples，选择 method set（与 Project 同 名），输入进样体积及样品测试时间（THF 系统，3 根柱子，35 分钟；DMF 系统，2 根柱子，25 分钟）。
3． 在 Instrument Method 中，选择 410.instr（或 UV）。 4． 待示差检测器流路为正常测样流路时，点 Monitor 观察基线。待基线稳定后，点
niMi2 = niMi
wiMi = wi
Wi M i
W---重量分数
3． Z均分子量Mz Z均分子量是按Z量的统计平均。Z的定义为Z=wiMi。Z均分子量的定义为：一个高聚 物试样中，各分子量的Z值的分数及其相当的分子量的乘积的总和。
__
∑∑ ∑∑ ∑∑ Mz =
ZiMi = Zi
wiMi2 = wiMi
常用的高聚物的平均分子量有四种表示方法：数均分子量，重均分子量，Z 均分子 量和粘均分子量。
1． 数均分子量Mn 数均分子量被定义为在一个高聚物体系中，高聚物的总重量（以克为单位）除以高聚 物中所含各种大小分子的总摩尔数，即数均分子量是高聚物体系中各种分子量的摩尔 分数与其相应的分子量的乘积所得的总和。它是按分子数的统计平均。
2． 515 泵 流速范围在 0.00－10.00mL/min，但对于GPC柱子，流速不能超过 1.0mL/min。
Waters-1515-2414-凝胶渗透色谱（GPC）操作规程讲解学习
Waters-1515-2414-凝胶渗透色谱（GPC）操作规程讲解学习Waters 1515-2414 凝胶渗透色谱（GPC）操作规程一、溶剂和样品准备1. 选择溶剂：尝试和选择对聚合物具有良好溶解性的THF或者DMF 作为溶剂；2. 溶剂处理：采用溶剂过滤系统（真空抽滤）对色谱纯溶剂进行过滤和脱气处理；3. 样品配制：选用处理后的溶剂配置待测样品溶液，样品体积≥4mL；样品浓度根据估算的分子量确定（Mw＝103～104，浓度为1.5～2mg/mL；Mw ＝104～105，浓度为1～1.5mg/mL；Mw＝105～5 x 105，浓度为0.5～1mg/mL；Mw＝5 x 105～106，浓度为0.1～0.5mg/mL；Mw ＞106，浓度为0.05～0.1mg/mL）；4. 样品溶解：提供足够时间使聚合物完全溶解（一般在室温下静止过夜）；注：可轻微摇动样品以促进溶解但不可剧烈摇动；5. 样品过滤：样品溶解后，采用一次性微孔滤膜（孔径0.22μm）对样品溶液进行过滤，保存滤液待用；注意：每个样品需要准备两个样品瓶（分别用于溶解样品和放置过滤后的溶液）和两个注射器（分别用于过滤和进样）二、仪器启动1. 将经过真空抽滤的溶剂倒入溶剂存贮瓶中；2. 依次打开稳压电源－计算机－泵－柱温箱－示差折光检测器开关；3. 启动Breeze软件，输入用户名Breeze；选择1515-2414系统，确定；4. 在Breeze软件系统中点击运行样品－点击流量图标设置泵流速0.2mL/min，注意：设置变化时间为2min，即以0.1mL/min缓慢增加流速，使色谱柱所受压力缓慢变化；5. 在示差折光检测器面板上，点击T emp oC设置温度40 oC（set/control）；再点击Home－Shift 1－显示Purge图标；此时示差检测器为Purge流路，冲洗示差检测器的样品池及参比池；点击平衡系统/监视基线图标－调用PS-purge方法－点击平衡/监视器，监控基线；Purge时间为10h；6. 10h后（此时基线已稳定），在运行样品界面点击设置泵流速1mL/min（设置变化时间8min，以0.1mL/min缓慢增加流速），平衡0.5h；7. 在示差折光检测器面板上，点击Shift 1，取消Purge（回到正常测样流路），平衡3～5min；再依次点击Diag－Optimize LED(16~17正常) －Enter －Home；三、样品测试1. 点击Breeze软件系统中的单进样图标－输入待测样品名－选择功能（宽分布进样）－选择方法组PS－输入进样体积（20μL）及样品测试时间（45min）－点击单进样，准备进样；此时窗口显示等待进样；2. 选用1mL注射器，安装色谱专用平头针头，采用过滤后样品溶液润洗进样注射器后，再抽取过滤后的样品溶液；将针口朝上排出气泡（注意针头不要有液珠，否则会污染进样口，必要时用镜头纸擦拭）；将进样阀门拨到Inject位置（即垂直状态），将进样注射器插入进样器内并插到底（不用过于用劲），进样；进样结束后迅速将进样阀门拨到Load位置；此时窗口显示进样正在运行；注意：进样结束后，使用抽滤后的溶剂及时清洗针头；3. 到设定的运行时间后，仪器自动停止数据采集，此时窗口显示单进样结束；20min后，按步骤1和2进下一个样品；注意：实验过程中及时观察溶剂存贮瓶中溶剂量；如需补加，必须在仪器停止数据采集时（最好在泵流速为0时）添加溶剂，且砂滤头必须在液面下。
GPC基础知识
1
GPC色谱柱类型
普通凝胶柱
• 按照不同的排阻极限分成很多种型号(如GPC-80X) • 每种排阻极限的柱子使用同一种凝胶颗粒 • 在一段范围内校正曲线成线性
混合凝胶柱
• 一种型号(如GPC-80M) • 使用混合凝胶颗粒 • 在较宽范围内校正曲线都成线性，可消除不同柱子串联时可能产生非线性校正曲线导致结果偏差的问题
lg
M1
1
12
lg
K1 K2
3
不需要窄分布标样，只需要宽分布标样 标样和样品为同一种物质 标样数量最少能够只有1个
标样的分子量Mw和Mn必须
标样校正曲线呈线性
渐进试差法(宽分布标样校正法)
3
渐进试差法(宽分布标样校正法)
在一定条件下，有：
ln M A BV (1)
Z+1均分子量 Mz+1 =
ΣMi 3Hi S Mi 2Hi
Hi： 峰高 Mi：分子量
8
数均分子量 (Mn)
• 拉力、抗冲击性
重均分子量 (Mw)
• 脆度
Z 均分子量 (Mz)
• 弹性、硬度
分布宽度指数D(分散度)= Mw/Mn 关于多分散试样 Mn ＜ Mw ＜ Mz
平均分子量含义
9
高聚物多分散性表征
样品间分子量分布宽度的比较，最直截了当的方法是将实验所得到的分子量分布曲线作对比。 分子量分布曲线有两种形式：
• 用重量分数W对分子量作图的曲线叫做微分分布曲线； • 用累积重量分布对分子量作图的曲线叫做积分分布曲线。
还有一种更一般化且最常用的方法确实是重均数均比，即：Mw/Mn。
2
QF=104 / 2.50 = 41.5
gpc凝胶渗透色谱仪操作指南
gpc凝胶渗透色谱仪操作指南读者如何操作GPC凝胶渗透色谱仪。
[仪器准备工作]首先，对于任何仪器操作，安全是第一要务。
在操作GPC凝胶渗透色谱仪之前，确保你已经熟悉了所有的安全操作程序和紧急情况的处理方法。
接下来，确保所有的仪器部件都处于良好状态。
检查管路和接头，确保它们没有损坏或者堵塞。
检查流动相和溶剂的储存罐，确保它们有足够的溶剂供应。
最后，打开色谱仪的电源，进行必要的预热和平衡。
[样品准备]在操作GPC凝胶渗透色谱仪之前，确保你已经准备好了样品。
首先，将样品溶解在适当的溶剂中。
然后，使用过滤器过滤样品以去除任何悬浮物。
最后，记得将样品放入样品瓶中，并且贴上标签，包括样品的名称和相关信息。
[仪器设置]在GPC凝胶渗透色谱仪操作中，正确的仪器设置是至关重要的。
首先，根据你的样品类型和需要，选择合适的柱子和流动相。
然后，设置色谱仪的流速和温度。
流速的选择应该能够保证样品在适当的时间内通过柱子，而温度的选择应该能够保证分离效果。
最后，确保检测器和数据采集系统都已经设置好，并且校准正确。
[运行样品]当一切都准备好后，就可以开始运行样品了。
首先，用流动相平衡柱子一段时间，以确保它的状态稳定。
然后，将样品注入色谱仪，并开始运行。
在运行过程中，注意观察数据采集系统，确保记录到合适的数据。
最后，当运行完成时，停止色谱仪并处理收集到的数据。
[数据分析]最后，当得到了样品的数据后，需要进行数据分析。
首先，将数据导入数据处理软件中，并进行平滑和去噪。
然后，根据峰的形状和峰面积，对样品的组分进行分析和定量。
最后，根据分析结果，得出相关的结论和建议，并将结果整理成报告。
以上就是操作GPC凝胶渗透色谱仪的详细步骤。
希望这篇指南能够帮助你顺利进行操作和数据分析。
Waters-1515-2414-凝胶渗透色谱(GPC)操作规程讲解学习
Waters 1515-2414 凝胶渗透色谱（GPC）操作规程一、溶剂和样品准备1. 选择溶剂：尝试和选择对聚合物具有良好溶解性的THF或者DMF 作为溶剂；2. 溶剂处理：采用溶剂过滤系统（真空抽滤）对色谱纯溶剂进行过滤和脱气处理；3. 样品配制：选用处理后的溶剂配置待测样品溶液，样品体积≥4mL；样品浓度根据估算的分子量确定（Mw＝103～104，浓度为1.5～2mg/mL；Mw ＝104～105，浓度为1～1.5mg/mL；Mw＝105～5 x 105，浓度为0.5～1mg/mL；Mw＝5 x 105～106，浓度为0.1～0.5mg/mL；Mw＞106，浓度为0.05～0.1mg/mL）；4. 样品溶解：提供足够时间使聚合物完全溶解（一般在室温下静止过夜）；注：可轻微摇动样品以促进溶解但不可剧烈摇动；5. 样品过滤：样品溶解后，采用一次性微孔滤膜（孔径0.22μm）对样品溶液进行过滤，保存滤液待用；注意：每个样品需要准备两个样品瓶（分别用于溶解样品和放置过滤后的溶液）和两个注射器（分别用于过滤和进样）二、仪器启动1. 将经过真空抽滤的溶剂倒入溶剂存贮瓶中；2. 依次打开稳压电源－计算机－泵－柱温箱－示差折光检测器开关；3. 启动Breeze软件，输入用户名Breeze；选择1515-2414系统，确定；4. 在Breeze软件系统中点击运行样品－点击流量图标设置泵流速0.2mL/min，注意：设置变化时间为2min，即以0.1mL/min缓慢增加流速，使色谱柱所受压力缓慢变化；5. 在示差折光检测器面板上，点击Temp ºC设置温度40 ºC（set/control）；再点击Home－Shift 1－显示Purge图标；此时示差检测器为Purge流路，冲洗示差检测器的样品池及参比池；点击平衡系统/监视基线图标－调用PS-purge方法－点击平衡/监视器，监控基线；Purge时间为10h；6. 10h后（此时基线已稳定），在运行样品界面点击设置泵流速1mL/min（设置变化时间8min，以0.1mL/min缓慢增加流速），平衡0.5h；7. 在示差折光检测器面板上，点击Shift 1，取消Purge（回到正常测样流路），平衡3～5min；再依次点击Diag－Optimize LED(16~17正常) －Enter －Home；三、样品测试1. 点击Breeze软件系统中的单进样图标－输入待测样品名－选择功能（宽分布进样）－选择方法组PS－输入进样体积（20μL）及样品测试时间（45min）－点击单进样，准备进样；此时窗口显示等待进样；2. 选用1mL注射器，安装色谱专用平头针头，采用过滤后样品溶液润洗进样注射器后，再抽取过滤后的样品溶液；将针口朝上排出气泡（注意针头不要有液珠，否则会污染进样口，必要时用镜头纸擦拭）；将进样阀门拨到Inject位置（即垂直状态），将进样注射器插入进样器内并插到底（不用过于用劲），进样；进样结束后迅速将进样阀门拨到Load位置；此时窗口显示进样正在运行；注意：进样结束后，使用抽滤后的溶剂及时清洗针头；3. 到设定的运行时间后，仪器自动停止数据采集，此时窗口显示单进样结束；20min后，按步骤1和2进下一个样品；注意：实验过程中及时观察溶剂存贮瓶中溶剂量；如需补加，必须在仪器停止数据采集时（最好在泵流速为0时）添加溶剂，且砂滤头必须在液面下。
ECO GPC用户培训
北京绿绵科技有限公司
GPC原理
GPC（Gel Permeation Chromatography ），凝胶渗透色谱，又称为尺寸 排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，简称SEC），它是基于体积 排阻的分离机理，通过具有分子筛性质的固定相，用来分离相对分子质量 较小的物质，并且还可以分析分子体积不同、具有相同化学性质的高分子 同系物
主要流出物
先流出物
流 向
t
t
收集被分析物
高分子量废弃物
Bio-Beads
GPC 净化效果对比图
经过GPC净化
未经过 GPC净化
ห้องสมุดไป่ตู้PC
净化标准方法
USEPA SW-846 : method 3640A
DFG method S 19
GBT 19650-2006 谱-质谱法
动物肌肉中478种农药及相关化学品残留量的测定 气相色
2．集样品过滤与进样一体
节约时间、样品瓶
ECO GPC 核心部件
GPC 凝胶净化柱（核心部件） 400mmⅹ25mm glass column（国际农残标准柱）
400mmⅹ10mm glass column（迷你柱）
700mmⅹ25mm glass column（EPA标准柱） 300mmⅹ20mm glass column（高效快速柱） 350mmⅹ25mm glass column（S19快速柱） 内置过滤系统、螺旋柱头以及五层刮片特殊设计，均可自 行填充，且自由更换溶剂体系 填料：Bio-Beads, Type S-X3,200-400
GBT 5009.218-2008
凝胶渗透色谱(GPC)、凝胶色谱设备安全操作规定
凝胶渗透色谱(GPC)凝胶渗透色谱（GPC）又称凝胶色谱，是高分子化合物的分子量测定和分布分析的重要方法之一。
GPC是一种以凝胶过滤为基础的分离技术，通过溶液中高分子量化合物在凝胶柱的过滤作用下发生分离和分子量分布测定。
GPC是一种广泛使用的技术，涉及到工业、生产等多个领域，因此设备的安全操作至关重要。
下面介绍凝胶色谱设备的操作规定。
设备安全操作规定一、设备安装1.在设备安装前，应仔细阅读设备的说明书，并根据说明进行安装。
2.安装地点应选择平稳、通风、无尘、无环境振动和电磁干扰的地方。
3.在安装凝胶色谱柱时，切勿使柱子接触到有机溶剂，以免磨损和污染。
4.在连接系统管路时，要求密封性好，避免泄漏和外界污染。
二、操作前准备1.确认设备电源、水源和气源等是否正常，并根据实际需要进行调整和适当调节。
2.准备好实验所需试剂、溶剂、标准品等，并按要求进行标记和分类。
3.检查柱子封头是否紧固，柱温控制是否正常，出样口和检测器设备是否连接正常。
三、样品准备1.样品需先过滤，去掉杂质和颗粒，然后进行适当的稀释处理，以避免过高的浓度造成的毛刺。
2.样品的溶剂应与流动相相同，以避免对流动相造成干扰和影响。
3.在进行样品预处理和进样前，必须先清洗进样器和采样针，以避免样品交叉污染和干扰。
四、操作过程中的注意事项1.注意保持操作环境干净，避免灰尘、污染物等杂质进入柱子和系统中。
2.切勿突然关闭机器或脱离电源，应按照说明书要求进行操作，避免对设备和数据造成损伤和误差。
3.在操作过程中，随时监测输出信号，注意记录相关的参数和数据，便于后期的分析和处理。
4.如果设备出现异常情况，应立即停止操作，寻找问题并解决，以免对实验数据造成影响和误差。
总结凝胶渗透色谱是一种常用的高分子量分析技术，应用广泛。
在进行实验操作时，设备的安全是至关重要的。
在操作过程中，我们需要仔细阅读说明书，按要求进行设备安装和调试，准备好富有经验的工作人员，保持设备和操作环境的干净和整洁，随时注意操作中的细节注意事项。
凝胶净化色谱基础知识
凝胶净化色谱基础知识1.凝胶净化色谱GPC（Gel Permeation Chromatography）凝胶净化色谱是根据溶质分子大小进行分离的色谱技术，选择性仅与分子大小的差异有关。
要改进分离度只能靠凝胶的孔径大小和孔径分布的最佳化来实现。
试样的分离并不依赖于溶剂与试样间的相互作用力（与一般色谱的不同）。
2.分离原理凝胶具有化学惰性，它不具有吸附、分配和离子交换作用。
一个含有各种分子的试样溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质。
因此，随着溶剂的恒速淋洗，大小不同的分子得到分离，试样中较大的分子先流出色谱柱，较小的分子的后流出。
图1 凝胶颗粒图2 凝胶色谱分离原理3. 凝胶色谱的分类凝胶色谱可分为凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography ，GPC ）和凝胶过滤色谱（Gel Filtration Chromatography ，GFC ）。
（1）凝胶渗透色谱：用于分离有机溶剂可溶物以有机溶剂为流动相常用固定相填料：苯乙烯-二乙烯基苯共聚物（2）凝胶过滤色谱：用于分离水溶性化合物以水溶液为流动相常用固定相填料：亲水性有机凝胶（交联葡聚糖凝胶、琼脂糖）4. 凝胶净化系统(1) 输液泵将流动相与样品打入净化柱，试样中各组分按照分子大小顺序洗脱，大分子油脂、色素、生物碱、聚合物先淋洗出来，农药等较小分子后淋洗出来，检测器检测出信号，组分收集器收集含有目标组分的洗脱液。
(2) 流动相的选择原则：应考虑与仪器、净化柱 、样品溶解性相符的溶剂。
（例如，搭配紫外检测器的GPC ，应选择无紫外吸收的流动相。
GPC凝胶色谱操作规程
GPC凝胶色谱操作规程GPC凝胶色谱（Gel Permeation Chromatography）是一种用于分离和测定高分子聚合物分子量分布的方法。
下面是一份简要的GPC凝胶色谱操作规程，包括样品准备、仪器操作、数据处理等步骤。
一、样品准备1. 将待测样品溶解在适量的溶剂中，使其浓度达到适合测定的范围。
2. 溶液中的固体颗粒应尽量去除，可通过过滤或离心操作来完成。
二、仪器操作1. 打开仪器电源，启动GPC系统。
2. 检查仪器各个部分的连接是否紧密，确保没有泄漏。
3. 检查流动相的质量和纯度，必要时进行更换。
4. 使用适当的毛细管或注射器将样品注入到色谱柱中。
5. 设置流动相的流速和温度，一般情况下，流速根据实验需要选择，温度一般设置在室温下进行。
6. 开始运行GPC实验，记录运行开始的时间。
三、GPC实验运行1. 设定好GPC柱的温度、流速和检测器的灵敏度等参数。
2. 打开检测器的电源，选择合适的检测波长或检测器类型。
3. 开始样品分离，记录分离过程中的响应信号，并保存数据。
四、数据处理1. 使用专用的GPC数据处理软件对得到的数据进行处理。
2. 根据响应信号与时间的关系曲线，计算出不同分子量的聚合物峰面积。
3. 将样品的峰面积与标准聚合物的峰面积进行比较，计算出待测样品的分子量分布。
4. 根据实验需要，可以生成相关的分子量分布曲线或分子量平均值等结果。
五、注意事项1. 在操作过程中，应注意保持实验环境的洁净，并避免灰尘和异物的污染。
2. 使用前应检查样品是否有异常，如有溶解不完全、有颗粒物等，应予以处理或更换。
3. 注意操作时的安全性，避免与有毒或腐蚀性物质接触。
4. 操作结束后，及时将仪器清洗干净，并进行必要的维护。
以上是一份简要的GPC凝胶色谱操作规程，但实际操作中可能因仪器和实验需求的不同会有一些细微的差距，因此在操作时应根据具体情况进行调整。
另外，此规程也建议参考实验室的操作指南和相关文献，以确保操作的准确性和可重复性。
安捷伦凝胶渗透色谱
安捷伦凝胶渗透色谱安捷伦凝胶渗透色谱（GPC）是一种用于分离和表征高分子化合物的方法，如聚合物、蛋白质、多糖等。
以下是关于安捷伦凝胶渗透色谱的详细说明：1. 仪器组成：安捷伦凝胶渗透色谱系统由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据采集系统和计算机等组成。
2. 工作原理：凝胶渗透色谱的原理是基于分子大小不同，通过多孔凝胶固定相的孔径大小，按分子大小依次分离样品中的各个组分。
在分离过程中，大分子物质先被洗脱，小分子物质后被洗脱。
3. 实验操作流程：凝胶渗透色谱实验的一般流程包括以下步骤：样品准备：将待分析的样品进行适当处理，以便于后续的色谱分离。
流动相准备：选择合适的流动相，一般使用THF、DMF、水相、氯仿、三氯苯等作为流动相。
样品进样：将样品通过进样器注入色谱柱。
洗脱分离：使用高压输液泵将流动相通过色谱柱，按分子大小顺序分离样品中的各个组分。
检测和记录：使用检测器检测各个组分的信号，并通过数据采集系统记录数据。
结果处理：通过计算机处理数据，得到各个组分的分子量分布和浓度等信息。
4. 应用范围：安捷伦凝胶渗透色谱广泛应用于高分子化合物的分析，如聚合物、蛋白质、多糖等。
其应用范围包括高分子聚合物分子量的测定、线性高分子化合物多分散指数的测定、聚合物稳定性的评价及降解过程分析、高分子材料产品质量控制等方面。
5. 注意事项：在进行凝胶渗透色谱实验时，需要注意以下几点：样品准备要适当，以利于后续的色谱分离。
流动相的选择要合适，根据不同的样品选择不同的流动相。
实验过程中要保持严格的温度和流速控制，以保证实验结果的准确性。
对于某些样品，可能需要使用不同的色谱柱或流动相来达到最佳的分离效果。
安捷伦凝胶渗透色谱是一种非常有效的分析高分子化合物的方法，可以提供关于样品分子量分布、分子大小等信息，帮助研究人员深入了解样品的性质和组成。
凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱(GPC)技术，是一种多功能的高效分离手段。
目前GPC应用于抗生素、激素和血清药物浓度测定方面，但由于GPC的价格昂贵，普及程度有限。
随着凝胶技术和相关制备技术的发展，以及分析化学对GPC理论认识的深入， GPC技术开始在食品、环境、石油、地质、医药等领域得到应用。
近年来国内外研究人员在GPC技术上取得了许多突破性进展，同时也显示出巨大的应用潜力。
凝胶渗透色谱的基本原理是：当带有不同电荷的试样液体流经具有适当尺寸和形状的微孔时，通过毛细作用把液体中溶质粒子分散到孔隙表面，使得与分散介质的相互作用最小，而与溶剂之间的相互作用最强。
此时，固定在孔隙表面上的溶质将以分散状态向分散介质扩散。
如果样品中各组分在各自的组成和结构上完全相同，那么它们在分散介质上的扩散速率相等;如果组分的结构不同，则扩散速率将不相同。
凝胶孔径的大小与样品中各组分的分配系数有关，一般而言，小分子的分配系数较大，大分子的分配系数较小。
根据样品中各组分在凝胶孔隙中分布速率的差异，就可以计算出各组分在样品中的含量。
凝胶中所含的样品液体通常为分散状态，因此试样溶液在整个过程中始终与孔壁接触。
孔隙直径、试样组成、样品液体中所含的各种物质的分配系数等对于溶质的分散和GPC的灵敏度都有重要影响。
例如，聚电解质样品溶液和乳浊液均匀地分散在孔腔表面上，比含有悬浮颗粒的溶液更容易被GPC检测。
GPC又称色层分离法或色谱法，就是根据试样中各组分在凝胶孔隙中分布速率的差异进行分离的方法。
GPC的基本操作步骤包括：混合试样溶液→装柱→洗脱→柱后处理→检测。
GPC技术利用混合试样的溶液和水一起填充柱，其优点是对于挥发性溶质（如氨基酸），没有因加热而损失的现象。
GPC技术是非破坏性的，而且具有高效、快速、简便、经济等优点。
GPC技术能够准确地测定天然产物中的组分，包括天然抗生素、维生素、激素和其他有机化合物。
在农业中，GPC技术已被用于果实贮藏及果树分级等方面。
GPC法测定聚合物分子量和分子量分布基础教育
列出实验测定时某些可能的误差，对分子量 的影响如何？
同样分子量样品支化的和线性的分子哪个先 流出色谱柱？
教育
18
推导出：
log M 2
1
12
log
K1 K2
11 12
log M1
教育
10
实验仪器
图4 Waters 1515/2414型凝胶渗透色谱仪
教育
11
实验仪器
仪器构造
进样器 泵
色谱柱 柱温箱
检测器
四氢呋喃THF
示差检测器 废液瓶
图5 仪器构造示意图
教育
12
实验仪器
色谱柱和柱内填料
图6 色谱柱教及育填料
13
实验仪器进样阀和定量原理来自图7 进样阀和教育定量原理
14
实验步骤
流动相：色谱级四氢呋喃（THF）、真空脱气 样品准备：
1. 样品浓度：根据估算的分子量确定。
Mw＝103～104，浓度为1.5～2 mg/mL Mw＝104～105，浓度为1～1.5 mg/mL Mw＝105～5×105，浓度为0.5～1 mg/mL Mw＝5×105～106，浓度为0.1～0.5 mg/mL Mw＞106，浓度为0.05～0.1 mg/mL；
主要内容
实验目的 实验原理 实验仪器 实验步骤 数据分析 思考题 实验报告要求
教育
1
实验目的
1. 了解GPC法测定聚合物分子量及分子量分布 的原理。
2. 了解Waters 1515/2414型凝胶渗透色谱 仪的构造。
3. 掌握GPC法测定聚合物分子量及分子量分布 的操作步骤。
4. 学会用Breeze软件分析聚合物的分子量和 分子量分布。
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体积排除流程示意图
进样口 混合器
色 谱 柱
检测器
溶剂
废液
GPC的基本结构
• 输液系统（包括溶液储存器、输液泵、进样器等）； • 色谱柱系统（包括柱温控制箱）； • 检测器（RI、UV、LS、VS等）； • 数据收集及数据处理系统包括模数转换器、计算机、打印
机/绘图仪等）。
数均分子量
Ni个
分子个数（N）
N2个
N1个
Nj个
M1 M2
Mi
Mj
分子量（M）
Mn =
M1N1+M2N2+...+MiNi+…MjNj N1+N2+…+Ni…+Nj
重均分子量
20
Wig
重量（N）
W2g
W1g
Wjg
M1 M2
Mi
Mj
分子量（M）
M1W1+M2W2+...+MiWi+…MjWj Mw =
色谱分类方法-按两相状态分
色谱术语
➢ 基线：色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时流出曲线 ➢ 峰高：色谱峰顶点与基线的距离 ➢ 保留值
凝胶色谱法
• 凝胶色谱法又称分子尺寸排阻色谱法，主要用于高聚物的相对分子质量及 其分布的测试，是液相色谱的一种分离模式。 SEC：Size Exclusion Chromatography，尺寸排阻色谱 GPC：Gel Permeation Chromatography，凝胶渗透色谱 GFC：Gel Filtration Chromatography，凝胶过滤色谱 从分离原理看，使用分子尺寸排阻色谱（SEC）较为确切。
酰胺凝胶 • 木质素凝胶等
评价色谱柱性能的两个重要参数
1. 柱效率N 色谱柱效率可借用“理论塔板数”N 进行描述.
测定N的方法：用一种相对分子量均一的纯物质，如邻二氯 苯、苯甲醇、乙腈、苯等，作GPC测定，得到色谱峰，从图 中可以求得从样品加入到出现峰顶位置的淋洗体积VR，以及 由峰的两侧曲线拐点作出切线与基线所截得的基线宽度即为 峰底宽W，然后按照下式进行计算N：
对于相同长度的色谱柱，N值越大，意味着柱效率越高。
评价色谱柱性能的两个重要参数
2. 分离度R
式中，V1，V2分别为对应于样品1和样品2的两个峰 值的淋洗体积；W1，W2分别为峰1和峰2的峰底宽。
显然，若样品达到完全分离，R应等于或大于1，如 果R小于1，则分离是不完全的。
19
聚合物分子量的表示方法
SEC分类
• 凝胶渗透色谱 (GPC)
• 主要用于聚合物领域 • 以有机溶剂为流动相 (氯仿，THF，DMF) • 常用固定相填料：苯乙烯－二乙烯基苯共聚物
• 凝胶过滤色谱 (GFC)
• 主要用于生命科学领域 • 以水溶液为流动相 • 常用固定相填料：亲水性有机凝胶(葡聚糖，琼脂糖，聚
丙烯酰胺等)
进样器 泵
色谱柱 柱温箱
水，THF, DMF
检测器
分子尺寸排阻色谱柱的选择
油相柱 油相柱 水相柱
品牌
Agilent Technologies
Agilent Technologies
TSK
型号
Polargel-L PL1117-6830
Polargel-M PL1117-6800
G3000PW(XL) G6000PW(XL)
凝胶渗透色谱仪基础知识及操 作培训
Gel Permeation Chromatograph（Agilent 1260）
主要内容
1 色谱分析方法导论2 凝胶渗透色谱的原理3 仪器系统及软件介绍
4
测试应用
3
色谱分析方法导论
➢20世纪中期，大量采用一些经典的分离方法：沉淀、蒸馏和 萃取。
➢现代分析中，大量采用色谱和电泳分离方法。
➢迄今为止，色谱方法是最 为有效的分离手段。应用 涉及每个科学领域。
➢50年代，色谱发展最快， 出现一些新型色谱技术， 以适应复杂组分分析方法 的要求。
色谱分类方法
• 按照固定相外形分： 柱色谱（填充柱、空心柱）、平板色谱（薄层色谱和纸色
谱） • 按组份在固定相上的分离机理分：
吸附色谱：不同组份在固定相的吸附作用不同 分配色谱：不同组份在固定相上的溶解能力不同 离子交换色谱：不同组份在固定相（离子交换剂）上的 亲和力不同 凝胶色谱（尺寸排阻色谱）：不同尺寸分子在固定相上 的渗透作用 • 按两相状态分
GPC基本原理
• 色谱柱是GPC的核心部件，内装有颗粒状、多孔的凝胶填 料。比如；苯乙烯和二乙烯基苯共聚的交联聚苯乙烯凝胶。 凝胶填料的表面和内部有各种大小不同的孔洞通道。
• 进行实验时，以某种溶剂充满色谱柱，使之占据颗粒之间 的全部空隙和颗粒内部的空洞，再以这种溶剂以恒定的流 速淋洗，然后用同样溶剂配成的聚合物溶液注入凝胶色谱 柱；
分子量范围,Mw
低分子量
覆盖大部分分子量范 围
GPC色谱柱的选择
• 按照样品所溶解的溶剂来选择柱子所属系列 (氯仿，THF，DMF) 必须选择合适的溶剂来溶解聚合物
• 按照样品分子量范围来选择柱子型号 样品分子量应该处在排阻极限和渗透极限范围内，并且最 好是处在校正曲线线性范围内
载体是GPC产生分离作用的关键
• 1953年，Porath和Flodins首先用交联聚糖凝胶在水中分离水溶性高分子 （ GFC）
• 1964年，J.C. Moore在总结前人的基础上，结合大网状结构离子交换树脂 制备的经验，将高交联度聚苯乙烯凝胶用作柱填料，同时配以连续式高灵 敏度的示差折光仪，制成了快速且自动化的高聚物分子量分布的测定仪， 从而创立了液相色谱中凝胶渗透色谱技术。
GPC基本原理
• 溶液中的溶质分子即向填料内部孔洞扩 散，较小的分子除了能进入大孔外，还 能进入较小的孔，较大的分子只能进入 较大的孔，而比最大的孔还要大的分子 就只能留在填料颗粒之间的空隙中；
• 从渗透的深度来说，较小的分子能渗入 孔洞更深的内部。因此，随着溶剂的恒 速淋洗，大小不同的分子就得到分离； 较大的分子先被淋洗出来，较小的分子 后被淋洗出来。
对载体的要求： 1. 良好的化学稳定性和热稳定性 2. 有一定的机械强度 3. 不易变形 4. 流动阻力小 5. 对试样没有吸附作用 6. 分离范围越大越好（取决于孔径分布） 7. 载体的粒度越小，越均匀，堆积的越紧密，色谱柱分离
效率越高。
载体的种类
• 交联聚苯乙烯凝胶 • 多孔性玻璃 • 半硬质及软质填料包括聚乙酸乙烯酯凝胶及聚丙烯