色谱法Tswett叶绿素分离试验
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氯化钠的混合液浸泡，用水冲洗到中性 聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶--盐溶液浸泡，用水冲到中性
第3节 薄层色谱分离检测技术 薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)
想一想 在吸附色谱
中，以硅胶为固定相， 当用三氯甲烷为流动 相时，样品中某些组 分保留时间太短，若 改用三氯甲烷–甲醇 （1:1）时，则样品中 各组分的保留时间是 变长，还是变得更短？ 为什么？
4．吸附柱色谱操作技术
（1）装柱
A.质量要求
装柱之前，先将空柱洗净干燥，再将空柱垂直固定 在铁架台上。如果色谱柱下端没有砂芯横隔，就取一小团 脱脂棉，用玻璃棒将其推至柱底，再在上面平铺上一层厚 0.5~1cm的洗过、干燥石英砂，有助于分离时色层边缘整 齐，加强分离效果。柱的长度与直径比一般为10 ~ 20:1。 色谱柱的填装要均匀，不能有气泡。
液体流动相 （5）流动相（mobile phase） 气体流动相
超临界流体流动相
(6）色谱分离本质:
利用混合物中各组分在流动相和固定相之间相互作用力 （如溶解能力、吸附力、极性、亲和力等）的强弱不同， 而使各组分在色谱柱中分别以不同的速度移动而达到分离 的定性与定量分析的方法。
二、色谱法分类
B .装法
①湿法装柱
②干法装柱
（2）加样
①干法加样 ②湿法加样
（3）洗脱 ①洗脱剂
一种溶剂或几种溶剂按一定比例组成混合溶剂 ②操作要求 A.保持吸附层上方有一定量的洗脱剂，防止断层和旁流 B.控制洗脱剂的流速（5～10滴/min)
（4）收集 ①等份收集
(亦可用自动收集器) ②按变换洗脱剂收集
化
3．流动相(又称为洗脱剂 ) （1）流动相影响因素
官能团极性与数目
A.被测物质的结构、性质 物质的结构
结构空间排列
常见官能团的极性由小到大的顺序是：烷烃＜烯烃＜醚类＜ 硝基化合物＜酯类＜酮类＜醛类＜硫醇＜胺类＜酰胺＜醇 类＜酚类＜羧酸类。
B.流动相极性: 相似相溶 C.吸附剂活性
（2）如何选择流动相？ 最佳方案总是实验确定
（3）应用:分离酸性及中性化合物 (如醇类和芳香烃等)
2．吸附剂
（1）硅胶 (SiO2·XH2O)
A.吸附机制：表面有许多硅羟基（-Si-OH）的氢键作用
B.吸附活性
C.失活或脱活
D.活化
硅胶活性与含水量的关系
硅胶含水量%
活度级
活性
0
I
大
5
II
15
III
wenku.baidu.com
25
IV
38
V
小
（2）氧化铝
A.吸附机制:其表面铝羟基（Al-OH）的氢键作用 B.活性
液-固色谱(LSC)
液相色谱(LC) 液-液色谱(LLC)
1.流动相状态
气相色谱(GC)
气-固色谱(GSC) 气-液色谱(GLC)
超临界流体色谱(SFC)
2.按分离原理分类
吸附色谱 分配色谱（DC） 离子交换色谱（IEC) 分子排阻色谱(MEC） 亲和色谱
3.根据实验操 作形式
柱色谱 (CC） 薄层色谱（TLC）
使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱分离效能较低 (2)有机凝胶又称半硬质凝胶
性能：能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动相， 有一定可压缩性，可填得紧密，柱分离效能较高。但在有 机溶剂中有轻度膨胀。 (3)新型凝胶 ---葡萄聚糖凝胶
3．流动相
（1）要求 流动相必须与凝胶本身非常相似，能溶解样品，浸
氧化铝含水量% 0 5 15 25 38
活度级 I II III IV V
活性 大
小
C.氧化铝分类及应用范围
氧化铝种类 pH
应用范围
碱性氧化铝 9～10 分离碱性和中性化合物，如生物碱。
中性氧化铝
分离酸性、中性和碱性化合物，如生物
7.5
碱、挥发油、萜类、甾体以及在酸碱
中不稳定的酯类、苷类等化合物。
润凝胶，且具有较低的黏度，有利于大分子的扩散 (2）选用方法
水溶性样品 -------水溶液为流动相 非水溶性样品 ------有机溶剂为流动相 (3）常用的流动相 四氢呋喃、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、三氯甲烷和 水等
4．凝胶柱色谱操作技术
（1）溶胀 （2）装柱 （3）加样 （4）洗脱 （5）再生 用恰当的方法除去凝胶中的污染物，使其恢复其原来的性质 交联葡萄糖凝胶---温热的0.5mol/L氢氧化钠和0.5mol/L的
酸性氧化铝
4～5
分离酸性和中性化合物，如氨基酸、酸 性色素。
（3）聚酰胺
A.吸附机制：通过分子内的酰胺基与酚、酸、硝基、醌类化 合物形成氢键而产生吸附作用
B.应用范围：适合于含-OH 的天然产物的有效成分分离
（4）大孔吸附树脂 A.吸附机制：大孔网状结构的高分子化合物，不溶于酸、
碱及有机溶剂，吸附性与筛分性原理相结合 B.应用范围：主要用于水溶性化合物(如皂苷）的分离纯
（5）检验 可以为后续操作
二、凝胶柱色谱技术 1．分离原理
（1）凝胶
(2)分离原理
凝胶的孔穴大小与 被分离组分大小相当，尺 寸大的组分分子可以渗入 到凝胶的大孔内，但进不 了小孔，甚至于完全被排 斥先流出色谱柱。尺寸小 的组分分子，大孔小孔都 可以渗进去，最后流出。
2．固定相
(1)无机凝胶又称硬质凝胶----多孔硅胶、多孔玻璃珠 性能：化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐高温，
平面色谱(PC） 纸色谱（PC) 薄膜色谱（TFC）
三、色谱法的特点
分离效能高 分离与分析功能兼备 自动化程度高 应用范围广
第2节 经典柱色谱技术
一、液-固吸附柱色谱技术 1．分离原理 （1）液-固吸附柱：色谱法固定相是固体吸附剂，流动相为液 体的柱色谱法
（2）分离机制:吸附剂表面对不同组分吸附力的不同和流动相 对各组分的溶解能力（或称解吸能力、洗脱能力）的差异，最 终导致混合物中各组分流出色谱柱的先后顺序（或在色谱柱中 停留的时间即保留时间）不同而达到分离。
一、色谱法
第1节 色谱法概述
Tswett叶绿素分离实验
（1）色谱：植物色素经溶剂冲洗分离后如同白光色散成七 色光带的现象
（2) 色谱法：用于产生色谱的分离方法 （3）色谱柱（chromatographic column）
装有用于分离的填充物的细长管（如玻璃管、不锈钢管）
（4)固定相（stationary phase） 固体固定相 液体固定相
第3节 薄层色谱分离检测技术 薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)
想一想 在吸附色谱
中，以硅胶为固定相， 当用三氯甲烷为流动 相时，样品中某些组 分保留时间太短，若 改用三氯甲烷–甲醇 （1:1）时，则样品中 各组分的保留时间是 变长，还是变得更短？ 为什么？
4．吸附柱色谱操作技术
（1）装柱
A.质量要求
装柱之前，先将空柱洗净干燥，再将空柱垂直固定 在铁架台上。如果色谱柱下端没有砂芯横隔，就取一小团 脱脂棉，用玻璃棒将其推至柱底，再在上面平铺上一层厚 0.5~1cm的洗过、干燥石英砂，有助于分离时色层边缘整 齐，加强分离效果。柱的长度与直径比一般为10 ~ 20:1。 色谱柱的填装要均匀，不能有气泡。
液体流动相 （5）流动相（mobile phase） 气体流动相
超临界流体流动相
(6）色谱分离本质:
利用混合物中各组分在流动相和固定相之间相互作用力 （如溶解能力、吸附力、极性、亲和力等）的强弱不同， 而使各组分在色谱柱中分别以不同的速度移动而达到分离 的定性与定量分析的方法。
二、色谱法分类
B .装法
①湿法装柱
②干法装柱
（2）加样
①干法加样 ②湿法加样
（3）洗脱 ①洗脱剂
一种溶剂或几种溶剂按一定比例组成混合溶剂 ②操作要求 A.保持吸附层上方有一定量的洗脱剂，防止断层和旁流 B.控制洗脱剂的流速（5～10滴/min)
（4）收集 ①等份收集
(亦可用自动收集器) ②按变换洗脱剂收集
化
3．流动相(又称为洗脱剂 ) （1）流动相影响因素
官能团极性与数目
A.被测物质的结构、性质 物质的结构
结构空间排列
常见官能团的极性由小到大的顺序是：烷烃＜烯烃＜醚类＜ 硝基化合物＜酯类＜酮类＜醛类＜硫醇＜胺类＜酰胺＜醇 类＜酚类＜羧酸类。
B.流动相极性: 相似相溶 C.吸附剂活性
（2）如何选择流动相？ 最佳方案总是实验确定
（3）应用:分离酸性及中性化合物 (如醇类和芳香烃等)
2．吸附剂
（1）硅胶 (SiO2·XH2O)
A.吸附机制：表面有许多硅羟基（-Si-OH）的氢键作用
B.吸附活性
C.失活或脱活
D.活化
硅胶活性与含水量的关系
硅胶含水量%
活度级
活性
0
I
大
5
II
15
III
wenku.baidu.com
25
IV
38
V
小
（2）氧化铝
A.吸附机制:其表面铝羟基（Al-OH）的氢键作用 B.活性
液-固色谱(LSC)
液相色谱(LC) 液-液色谱(LLC)
1.流动相状态
气相色谱(GC)
气-固色谱(GSC) 气-液色谱(GLC)
超临界流体色谱(SFC)
2.按分离原理分类
吸附色谱 分配色谱（DC） 离子交换色谱（IEC) 分子排阻色谱(MEC） 亲和色谱
3.根据实验操 作形式
柱色谱 (CC） 薄层色谱（TLC）
使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱分离效能较低 (2)有机凝胶又称半硬质凝胶
性能：能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动相， 有一定可压缩性，可填得紧密，柱分离效能较高。但在有 机溶剂中有轻度膨胀。 (3)新型凝胶 ---葡萄聚糖凝胶
3．流动相
（1）要求 流动相必须与凝胶本身非常相似，能溶解样品，浸
氧化铝含水量% 0 5 15 25 38
活度级 I II III IV V
活性 大
小
C.氧化铝分类及应用范围
氧化铝种类 pH
应用范围
碱性氧化铝 9～10 分离碱性和中性化合物，如生物碱。
中性氧化铝
分离酸性、中性和碱性化合物，如生物
7.5
碱、挥发油、萜类、甾体以及在酸碱
中不稳定的酯类、苷类等化合物。
润凝胶，且具有较低的黏度，有利于大分子的扩散 (2）选用方法
水溶性样品 -------水溶液为流动相 非水溶性样品 ------有机溶剂为流动相 (3）常用的流动相 四氢呋喃、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、三氯甲烷和 水等
4．凝胶柱色谱操作技术
（1）溶胀 （2）装柱 （3）加样 （4）洗脱 （5）再生 用恰当的方法除去凝胶中的污染物，使其恢复其原来的性质 交联葡萄糖凝胶---温热的0.5mol/L氢氧化钠和0.5mol/L的
酸性氧化铝
4～5
分离酸性和中性化合物，如氨基酸、酸 性色素。
（3）聚酰胺
A.吸附机制：通过分子内的酰胺基与酚、酸、硝基、醌类化 合物形成氢键而产生吸附作用
B.应用范围：适合于含-OH 的天然产物的有效成分分离
（4）大孔吸附树脂 A.吸附机制：大孔网状结构的高分子化合物，不溶于酸、
碱及有机溶剂，吸附性与筛分性原理相结合 B.应用范围：主要用于水溶性化合物(如皂苷）的分离纯
（5）检验 可以为后续操作
二、凝胶柱色谱技术 1．分离原理
（1）凝胶
(2)分离原理
凝胶的孔穴大小与 被分离组分大小相当，尺 寸大的组分分子可以渗入 到凝胶的大孔内，但进不 了小孔，甚至于完全被排 斥先流出色谱柱。尺寸小 的组分分子，大孔小孔都 可以渗进去，最后流出。
2．固定相
(1)无机凝胶又称硬质凝胶----多孔硅胶、多孔玻璃珠 性能：化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐高温，
平面色谱(PC） 纸色谱（PC) 薄膜色谱（TFC）
三、色谱法的特点
分离效能高 分离与分析功能兼备 自动化程度高 应用范围广
第2节 经典柱色谱技术
一、液-固吸附柱色谱技术 1．分离原理 （1）液-固吸附柱：色谱法固定相是固体吸附剂，流动相为液 体的柱色谱法
（2）分离机制:吸附剂表面对不同组分吸附力的不同和流动相 对各组分的溶解能力（或称解吸能力、洗脱能力）的差异，最 终导致混合物中各组分流出色谱柱的先后顺序（或在色谱柱中 停留的时间即保留时间）不同而达到分离。
一、色谱法
第1节 色谱法概述
Tswett叶绿素分离实验
（1）色谱：植物色素经溶剂冲洗分离后如同白光色散成七 色光带的现象
（2) 色谱法：用于产生色谱的分离方法 （3）色谱柱（chromatographic column）
装有用于分离的填充物的细长管（如玻璃管、不锈钢管）
（4)固定相（stationary phase） 固体固定相 液体固定相