基因克隆及在大肠杆菌中的表达

KGF-2基因克隆及在大肠杆菌中的表达
1引言
角质形成细胞生长因子-2 ( Keratinocyte Growth Factor-2，KGF-2)，又称为成纤维细胞生长因子-10 (Fibroblast Growth Factor-10，FGF-10)，是FGFs超家族中角质细胞生长因子家族的一员。

1.1 KGF-2的来源和基因结构
KGF-2主要是由成纤维细胞及其他间充质来源的细胞分泌，如成纤维细胞、损伤修复中的肉芽组织以及上皮组织周围的γδT细胞均可分泌KGF-2。

此外，上皮组织的损伤还可上调KGF-2的表达。

人kgf-2基因位于染色体的5p12-p13区域，其基因为单拷贝，由3个外显子和2个内含子组成。

1997年，Emoto等[1]克隆了人的kgf-2的cDNA，其编码的蛋白质由208个氨基酸组成，N端有39个氨基酸组成的疏水信号肽，成熟蛋白含169个氨基酸，其中4个半胱氨酸形成2对二硫键，另一个折叠在肽中。

理论相对分子质量为19.3KD，对肝素具有较强的亲和作用。

Kgf-2的立体结构与其它FGF家族成员相似，为β三叶草型。

1.2 KGF-2的功能
KGF-2通过与上皮细胞细胞膜上受体作用特异性促进上皮细胞的增殖、分化和迁移，是胚胎器官发育中重要的多功能信号分子。

KGF-2能够通过刺激表皮细胞的增殖、迁移和分化直接促进伤口的愈合，在组织的重塑过程中起趋化作用[2]。

KGF-2通过与损伤位点黏膜的表皮细胞上的受体结合，引起细胞向受伤处迁移，保护角质细胞免受ROS诱导的细胞凋亡，由此来加快伤口的愈合。

此外，KGF-2同时也能通过刺激其它在组织修复和再生过程中有着非常重要作用的细胞因子(如血小板衍生生长因子，转化生长因子和成纤维细胞生长因子)的表达来间接作用于
组织的重塑[3]。

KGF-2有两种细胞膜表面受体：FGFR1Ⅲb和FGFR2Ⅲb。

KGF-2与FGFR2Ⅲb的亲和力高，是其特异性配体。

KGF-2与受体结合后，促使受体处于细胞内的Ｃ端酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的受体具有酪氨酸蛋白激酶活性，并与一系列靶蛋白发生作用，引发信号级联反应，发挥生物学功能[4,5]。

在脊椎动物器官形态发生过程中，KGF-2 在间充质-上皮相互作用中十分关键，如在四肢形成过程中，KGF-2在侧板中胚层的有限区域表达，它诱导尖外胚层嵴细胞的分化，刺激细胞增殖导致肢芽形成[6]。

脊椎动物器官的分支状形态发生也与FGFs家族相关，研究表明在小鼠肺的发育过程中，KGF-2可能是一个十分关键的生长因子和趋化物质[7]。

其它经历分支状发生的器官，像泪腺和胰腺，KGF-2在其发育过程中也发挥一定作用[8,9]。

另外，KGF-2几乎参与颅面区所有的结构发育，无论是早期的形成过程，还是后期的生长调节，KGF-2/KGFR2b 信号通路都是十分关键的[10]。

在生殖系统的发育过程中，KGF-2 也起着重要的作用。

在前列腺的发育过程中，间充质通过分泌KGF-2 等细胞因子来诱导前列腺上皮细胞发育。

Donjacour等研究FGF-10雄性小鼠模型时发现，大多数这种小鼠出生时雄性第二性器官缺失或萎缩，包括前列腺、精囊、尿道球腺和尾部输精管[9]。

另外，Yucel等利用基因敲除小鼠模型证实，KGF-2 等生长因子在生殖结节的正常发育过程中协同其他细胞因子起着非常重要的作用[10]。

这些研究结果说明KGF-2可能在前列腺和其他附属性器官发育中起十分重要的作用。

目前已经发现KGF-2在脊椎动物四肢、牙齿和毛发（羽毛），以及肺、耳、盲肠、颌下腺、胰腺和前列腺等器官的形成过程中起着极为重要的作用[11]。

KGF-2也有辐射防护作用[12]。

KGF-2可以提高辐射后小鼠的肠干细胞的存活率，并对辐射引起的气道上皮细胞的通透性升高具有拮抗作用。

Knan等人应用离子微集落刺激法发现，KGF能显著降低辐射引起的肠道损伤。

Waters 和Savla等人用测定荧光素异硫氰酸盐标记的牛血清白蛋白（FITC-BSA）的外渗来反应培养的Calu-3和16HBE140单层细胞的通透性，结果发现在同等剂量的辐照条件，KGF（50ng/ml）预处理的培养单层细胞对FITC-BSA的通透性明显下降，而KGF对未辐射过的单层细胞的通透性无影响。

通过激活蛋白激酶C（PKC），KGF可以加速辐射诱导的DNA 损伤修复，并维持细胞骨架蛋白F-肌纤蛋白的稳定和保护细胞间连接。

1.3 Kgf-2在大肠杆菌中的表达优势
近年来的研究发现kgf-2基因在毕赤酵母中表达时，目的产物容易遭受宿主蛋白酶的降解[13]。

大肠杆菌表达系统具有容易操作、能高效表达的特点，而且就重组蛋白的生物学活性而言，两种方式表达的重组蛋白均具有类似天然蛋白的生物学功能，其刺激NIH/3T3细胞增殖能力也几乎相当。

因此本研究希望利用大肠杆菌表达系统来实现该基因的高效稳定表达。

2 主要仪器及原料
2.1 材料
2.1.1 菌株来源
BL21菌株由军事医学科学院馈赠
2.1.2 寡核苷酸引物
实验所需引物由上海生工公司合成
pet28kgf(+)：CGGAATTCGGTCAAGACATGGTGTCACC
pet28kgf(-)：CGCTCGAGTTATGAGTGTACCACCATTGGA
2.1.3 试剂
PCR反应体系：dNTP溶液，Taq酶，XhoⅠ，Mg2+溶液
DNA电泳体系：琼脂糖，MarkerⅢ，6×loading Buffer ，TAE 缓冲液，Goldview
蛋白电泳体系：10%过硫酸铵，TEMED，巯基乙醇，30% 胶母液，分离胶缓冲液（pH 8.8），浓缩胶缓冲液（pH6.8），10×电极缓冲液（pH 8.3），2 ×上样缓冲液，染色液，脱色液
试剂盒：质粒提取试剂盒，PCR产物回收试剂盒
培养基：LB液体培养基，LB固体培养基
溶液：60mmol/L氯化钙溶液
抗生素：卡那霉素，氨苄青霉素
2.2 实验仪器
PCR仪：Eppendorf公司
DNA电泳仪：北京六一
蛋白电泳仪：北京六一
低温离心机：美国Beckman公司
摇床：ZHWY2008B
制冰机：SIM-F124（SANYO）
恒温水浴锅：GFL1002
超低温-20冰箱：MDF-U5410（SANYO）
4 ℃冰箱：BCD-257SLB
漩涡混匀器：VORTEX-GENIE2
超净工作台：HD-1360新型
格兰仕WD750ASL23微波炉
电转化仪
3 实验方法[14,15]
3.1 质粒DNA的提取
分别取BL21（pET28a）和BL21（pET22b kgf-2）菌液接种于5ml(含氨苄青霉素和卡那霉素)的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，各自用试剂盒法提取质粒DNA ，步骤如下：
（1）将5 ml菌液13 000rpm离心30s，收集沉淀。

（2）倒掉上清，将沉淀完全悬浮于100μl悬浮液（溶液Ⅰ）中。

（3）加入150μl裂解液（溶液Ⅱ）轻柔地颠倒混匀10次左右，溶液逐渐变得粘稠清亮。

（4）加入150μl中和液（溶液Ⅲ），轻柔地颠倒混匀10次左右。

（5）13 000rpm离心8-10分钟左右，将上清液小心转移入一个新的1.5 ml离心管中，加入等体积的（约400μl）结合液，颠倒混匀。

（6）将混合液吸入离心纯化柱中，静置至少3分钟，13 000rpm离心30 s，倒掉收集管中的废液。

（7）将纯化柱重新套入废液收集管中，加入600μl 80% 的异丙醇，13 000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

（8）取出纯化柱，将其套入一个干净的1.5 ml 离心管，开盖放置2-3分钟，加入50μl 双蒸水于硅胶膜上，不能粘在管壁上，室温下放置5分钟后，13 000rpm离心1分钟。

（9）将洗脱液重新吸入纯化柱中，再洗脱一次，这样可获得较高产量的质粒DNA。

（10）离心管中收集的液体即是洗脱下来的质粒DNA。

模板pET22b 重组子质粒电泳确认后准备进行PCR，pET28a质粒电泳确认后4℃保存准备酶切。

3.2 PCR扩增目标基因
（1）取一个PCR管，在其中按顺序添加以下各成分反应液
反应液：
正链引物pet28kgf(+) 1μl
负链引物pet28kgf(-) 1μl
dNTP 1μl
Buffer 5μl
模板pET22b重组子1μl
双蒸水40μl
Taq酶1μl
总体积50μl
（2）稍作离心。

（3）将反应管放入PCR仪中，按下列条件设计好程序，进行PCR 反应。

（4）反应程序：
94 ℃条件下模板DNA预变性5分钟
变性94 ℃30s
退火52℃30s
延伸72 ℃2min
30个循环后，72 ℃条件下延伸10min补平单链。

（5）PCR反应结束后取2μl反应液用1.2% 琼脂糖凝胶进行电泳，鉴定PCR产物是否存在以及大小。

（6）电泳确认后，余下的PCR产物用试剂盒法进行纯化。

3.3 酶切
A PCR产物酶切体系
ddH2O 33μl
PCR回收产物10μl
Eco RⅠ1μl
XhoⅠ1μl
XhoⅠ缓冲液5μl
定容50μl
B pET28a 酶切体系
第一次酶切：
ddH2O 34μl
pET28a10μl
Eco RⅠ1μl
Eco RⅠ缓冲液5μl
定容50μl
酶切产物经回收后，进行第二次酶切
第二次酶切：
ddH2O 34μl
pET28a 10μl
XhoⅠ1μl
XhoⅠ缓冲液5μl
定容50μl
（1）用手指轻弹管壁使溶液混匀，用离心机甩一下，使溶液集中在管底。

（2）混匀反应体系后，将Eppendorf管插于泡沫塑料板上，37 ℃水浴下反应6-8小时。

（3）酶切完全后用试剂盒法纯化产物。

（4）取2μl纯化后产物进行1.2 %琼脂糖凝胶电泳，确认酶切是否完全。

3.4 连接
（1）在一1.5mlEppendorf 管中加入2μl酶切后的载体pET28a和6μl 酶切后的PCR产物片断。

（2）添加1μl的10 ×DNA缓冲液以及1μl的DNA连接酶。

即PCR产物6μl
pET28a 2μl
10×连接缓冲液1μl
T4连接酶1μl
总体积10μl
（3）混匀后用离心机将液体全部甩到管底。

（4）16℃条件下保温过夜。

（5）利用宿主的感受态细胞进行转化实验。

3.5 转化
3.5.1细菌感受态的制备
（1）取5μl的BL21菌种接种于5 ml的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。

（2）取100μl培养液转接于5 ml的LB液体培养基中37℃振荡培养2-2.5小时左右，使A600达0.4左右。

（3）将培养液1.5ml移至Eppendorf 管中，冰浴20分钟，使其停止生长。

（4）4℃条件下，3 000r/min离心5分钟，弃取上清液。

（5）添加0.75 ml预冷的60mmol/L氯化钙溶液，用枪轻轻吹打。

（6）冰浴20-30分钟后，4℃条件下，3000r/min离心5分钟，尽可能弃取上清液。

（7）细胞沉淀用100μl预冷的60mmol/L氯化钙溶液悬浮，冰浴放置，备用。

3.5.2转化
（1）将电击杯放在冰上预冷，冻存的感受态细胞取出冰上融解。

（2）各取100μl的感受态细胞分别加入1μl连接液和1μl酶切后的空
载体，小心混匀，冰浴上放置20分钟。

（3）将混合液加入预冷的电击杯中，注意擦干杯外的水，防止电火花，放入电转化仪的反应槽内接上电源。

（4）2.5千伏，200欧，电容25微法拉，电击。

（5）听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入LB液体培养基，将混合液洗出，分别转移到1.5ml的离心管中。

（6）37℃复苏培养1小时，使其充分表达抗性。

（7）取适量涂平板，将平板倒置在培养箱中，37 ℃培养16-24小时。

3.6 菌落PCR
（1）转化后的实验组细胞在含有卡那抗生素的LB平板上会长出许多白色抗性菌落，对照组也长出少量的白色菌落。

分别取实验组和对照组的2个白色菌落接种于含有卡那抗生素的LB液体培养基37 ℃培养16-24小时。

（2）分别取实验组和对照组2 μl的培养液于PCR管中，95 ℃变性10分钟。

（3）再分别在其中按顺序添加以下各成分反应液
反应液：
正链引物pet28kgf(+) 1μl
负链引物pet28kgf(-) 1μl
DNTP 1μl
Buffer 5μl
双蒸水39μl
Taq酶1μl
总体积50μl
（4）按程序进行反应，程序同3.2。

（5）PCR反应结束后取2μl反应液用1.2% 琼脂糖凝胶进行电泳检测转化结果。

3.7 IPTG诱导kgf-2表达
（1）选取阳性鉴定结果的2个菌落接种于5ml含卡那霉素的LB培养基中，37 ℃振荡培养过夜。

（2）分别取50μl培养液于5ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养2-3小时左右，至A600达0.5左右。

（3）取出1.0ml 样品作为IPTG 诱导前的样品，-20℃保存。

（4）其余样品中添加5μl的IPTG 在37℃振荡培养4小时。

（5）将诱导前样品与诱导后样品5 000r/min离心5min 。

分别回收菌体沉淀。

（6）沉淀样品中分别加入双蒸水悬浮细菌，洗涤后5 000r/min离心5min，回收菌体。

（7）菌体沉淀中加入25μl的PBS 缓冲液和25μl 的2×SDS 上样缓冲液，在漩涡混合器上剧烈振荡1 min，使菌体完全溶菌。

（8）将样品分别在沸水浴中保持5 min，立即放入冰浴中冷却。

（9）将诱导前样品与诱导后样品保存在-20℃，准备进行SDS-PAGE 电泳。

3.8SDS-PAGE电泳
3.8.1电泳胶的准备
（1）制胶板的安装（短玻璃面朝内），要求密封，以免胶液泄漏。

（2）配制15%的分离胶。

双蒸水 2.75ml
30%胶母液 3.75ml
分离胶缓冲液0.9ml
10%SDS 75μl
10%APS 60μl
TEMED 5μl
（3）将配制好的分离胶加入制胶槽中，注意应随着边缘缓慢加入，千万别进气泡。

凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳子齿约0.5 cm 处。

（4）轻轻在分离胶溶液上覆盖一层双蒸水封胶，使凝胶表面变得平整，静放30分钟到一个小时，使凝胶聚合。

凝胶聚合后，在分离胶和
水层之间将会出现一个清晰的界面，可以微微倾斜模具，检测凝胶是否聚合。

（5）除去上面的水层，再用滤纸吸尽残留的液体。

（6）配制5%的浓缩胶
30%胶母液0.5ml
浓缩胶缓冲液0.37ml
双蒸水 2.1ml
10%SDS 25μl
10%APS 25μl
TEMED 5μl
（7）迅速将配制好的浓缩胶加到分离胶上面，并将梳子插入凝胶内，至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐，小心避免混入气泡。

将凝胶垂直放置于室温下，约30min凝胶聚合。

（8）凝胶聚合后，即进行电泳。

3.8.2 电泳
（1）将胶板放入电泳槽中，在上下电泳槽中加入1×电极缓冲液，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中。

轻轻拔出梳子，注意不要将加样孔撕破。

（2）在电泳槽的泳道中分别添加20μl标准蛋白质与样品。

标准蛋白质和样品在加样前应离心1s，以除去蛋白碎片。

加样时用微量移液器将样品加入样品孔的底部，避免带入气泡。

（3）接通电源，上槽接负极，下槽接正极，起始电压80伏，待溴酚兰前沿进入分离胶，电压为120伏。

（4）电泳大致需要1-3小时。

待溴酚兰前沿到达电泳槽底部时，切断电源，从电极上拔掉电极插头，取出玻璃板。

3.8.3 染色与脱色
（1）电泳结束后，带上手套，从电泳槽中取出凝胶板，小心移去两玻璃板之间的隔片，利用专用的铲子轻轻撬开玻璃板，小心从制胶板上将凝胶剥下，弃去浓缩胶。

在右下角切去小片作为定位标记。

（2）用清水洗胶，将分离胶放入染色液中，置于50℃温水浴中，染色30分钟，小心不要将胶撕破。

（3）从染色液中将胶取出用水漂洗后，将胶放入脱色液中进行脱
色，直到背景蓝色褪淡，见到条带，根据具体情况，大约换3-4次脱色液即可。

4 结果与分析
4.1 pET28a 质粒提取电泳结果
用试剂盒法从大肠杆菌中提取pET28a 质粒的电泳结果如图1所示， pET28a 质粒的大小约为6000bp ，电泳泳动速率较慢，离点样孔较近，且由于质粒拷贝数较低和提取过程中振荡较剧烈使质粒产量偏低，电泳结果比较模糊。

图1 pET28a 的电泳图
1孔道为DNA Marker
2，3，4，5孔道为提取的质粒
4.2 PCR 产物回收结果
PCR 产物经电泳检测存在后，用试剂盒法进行纯化的电泳结果如图2所示，大小为600bp 左右，与理论目标片段相同且浓度增加，电泳条带非常清楚。

4500bp
1200bp
5 4 3 2 1
3 2 1
图2 PCR产物回收电泳图
1孔道为DNA Marker
2，3孔道为纯化的PCR产物
4.3 转化结果和鉴定
连接好的载体和酶切后的空载体分别转化大肠杆菌BL21，在含有卡那霉素的LB平板上过夜培养的结果如图3所示，由于载体酶切后成线性不易转化大肠杆菌，所以对照组的菌落数很少或几乎没有，而实验组载体与目的基因连接成环状易于转化，菌落数为对照组的几倍。

图3 转化的大肠杆菌生长情况
4.4 菌落PCR鉴定结果
1200bp
500bp
实验组对照组
挑取的阳性菌落裂解并经PCR扩增后的电泳结果如图4所示，在600bp左右有明显的条带，对照组在此处无明显条带。

这说明转化结果是成功的，可以进行下一步的蛋白分离和鉴定实验。

但可能由于裂解菌落时间不够充分，或者电泳的分辨率较低，细菌基因组的条带却没能够显示。

1 2 3 4 5 6 7
4500bp
2000bp
1200bp
500bp
图4菌落PCR鉴定结果
1孔道为DNA Marker
2孔道为对照组的PCR产物
3，4，5，6，7孔道为实验组的PCR产物
4.5 Kgf-2的表达结果
转化后的菌落挑取阳性克隆子经培养后，对其进行IPTG诱导，SDS-PAGE的电泳结果如图5所示：实验组在35-25KD之间明显有多余的一条带，从分子量上来看比kgf-2的理论值24KD要大一些。

可能由于目的基因融合表达了载体上的一部分基因所致。

可以说IPTG的诱导表达是成功的。

图5 目标蛋白电泳图
1孔道为蛋白Marker
2，3孔道为对照组
4，5，6孔道为实验组
5 讨论
5.1 转化注意事项
转化效率的高低和感受态宿主细胞的制备有着很大的关系。

只有经过特殊处理的培养细胞才能接受外源DNA ，且整个转化过程都应该无菌操作，严防杂菌污染。

并且转化效率与外源DNA 浓度之间在一定范围内成正比，所以在转化之前先要测定载体和外源DNA 的浓度以使两者的比例适中。

但外源DNA 的量过多转化效率反而会降低。

一般，质粒DNA 的体积不应超过感受态细胞体积的十分之一。

5.2 SDS-PAGE 注意事项
在配制胶的过程中，一定要注意安全，两种丙烯酰胺单体及溶液都有毒性，操作时要戴手套。

整个过程的关键是分离胶和浓缩胶能否凝固，对其影响最大的就是10%的APS ，它应该现配现用，不能保存过长时间，否则胶不易凝固。

在用考马斯亮兰染色时可以在50℃左右的水浴中进行，这样在较短的时间内就可以达到预期的效果，脱色时也可以过夜。

1 2 3 4 5 6
116
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
5.3 表达结果的讨论
本实验kgf-2基因的表达量低，经SDS-PAGE电泳检测结果不是很明显。

这可能由于实验所采用的kgf-2基因是经重组后的突变体，且经基因序列分析kgf-2 基因发现其中含有15 个大肠杆菌稀有密码子，包括编码7 个精氨酸、1个亮氨酸和7个甘氨酸的密码子，其中有2个精氨酸稀有密码子和1个甘氨酸稀有密码子是连续出现的。

在这种情况下，在大肠杆菌BL21中表达时可能会存在障碍，因此表达的蛋白可能达不到理想的结果[16]。

6 创新之处
由于kgf-2本身的特殊性，在真核生物如酵母菌中表达容易被蛋白酶降解，因此目的基因的表达量受到严重影响。

本课题以大肠杆菌为宿主菌，研究目的基因在其中的表达状况，以寻找更适用于kgf-2基因的表达系统。

7 待讨论问题
由于kgf-2 基因中含有15 个大肠杆菌稀有密码子，因此用普通的大肠杆菌表达会有限制。

Rosetta（DE3）宿主菌是从BL21 衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。

该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AUA 、AGG 、AGA 、CUA 、CCC 和GGA 的tRNAs 。

采用Rosetta 菌株避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制，也可以对表达的蛋白进行后续的生物活性鉴定。

但大肠杆菌表达该基因时表达水平较低，要找到高效稳定的表达菌株还需要进一步的研究。

参考文献
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致谢
本课题是在张瑞平老师的悉心指导下完成的。

我首先要感谢我的指导老师张瑞平老师，从选题，实验设计，结果的分析，论文的写作等方面对我的帮助。

张老师严谨的科学态度，踏实的科研作风，渊博的学术知识，执着的求实作风，以及正值，务实和创新精神对我自身科研水平的提高和意志品格的培养产生了很大的影响，使我明白了在今后的学习和工作中应树立的正确态度，让我受益匪浅。

谨此表示忠心的感谢！
本实验是在分子生物学实验室完成的，这要感谢许东倩老师在实验药品和实验仪器上的大力支持。

在实验过程中许老师也给予我很大的帮助。

同时也要感谢同实验室做实验的同学们的鼓励与支持。

最后祝所有帮助过我的人学习进步，事业有成！
贾树丹
2008年5月20日。