湿热灭菌验证(姚燕萍).pdfx

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灭菌科学基础
灭菌模式
在实验温度不变的情况下，理 想微生物致死率(存活曲线)
Number of Survivors per unit (N)
106 105 104 103 102 DT Value = 2.5 minutes 90 99 99.9 99.99 99.999 99.9999
No = 106
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术语
生物负荷（Bioburden) 湿热（Moist Heat)
产品灭菌前所有带有的存活微生物的总数。采用残存概率法 灭菌时需进行产品的生物负荷测试。 指用于灭菌的蒸汽、蒸汽-空气混合物及过热水。
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术语
生物指示剂（Biological Indicator,BI)
含有接种在基质中或载体上的微生物的挑战系统，用来测试 湿热灭菌工艺实际效果。BI系统的数量和耐热性是已知的 。
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灭菌科学基础
微生物存活曲线示例：
使用上图中的数值，生物指示剂的存活曲线公式如下： Log NF = -F(T,z) /DT + Log N0 Log NF = -F/2.5 + Log 106 该公式还可用于计算暴露到一定的致死条件下预期的存活数量（也就 是无菌保证水平）。如果F（物理）值是30分钟，计算出的 NF 是10-6 （也就是暴露30分钟后BI有百万分之一的生长机会）。 Log NF = -F/2.5 + Log 106 Log NF = -30/2.5 + Log 106 Log NF = -12 + 6 Log NF = -6 NF = 10-6
对每一种灌装的溶液体积及容器体积 对每种装载方式 接受标准 ------ 验证必须有三个连续的合格（F0达到8）的实验
生物致死性 ------ 三次联合实验的同时还要进行生物指示剂挑战 性实验
对每一种灌装的溶液体积及容器体积 对每种装载方式 接受标准 ----- 溶液中生物指示剂必须全部杀死 (满足SAL ≤ 10-6) 最难灭菌点必须满足SAL ≤ 10-6
确保所有的阀门，仪表正确编号，并有清楚状态标识 所有管道应清楚地标识其内容物及流向 门和密封圈情况良好 温度和压力感应器已正确安装 水位探针可以正确检测水位 侧喷水测试情况良好 等等….
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运行确认
确保灭菌柜按照设计程序运行，所有温度、压力、时间 均在限度范围内，报警功能准确有效:
使用的产品要具有代表性（尺寸、厚薄、体积） 在最强的受热条件下验证
中断循环：灭菌温度：最高灭菌温度；中断前暴露时间：x分钟（如适用） 完整循环：灭菌温度：最高灭菌温度；最长暴露时间：正常暴露时间 + y分钟
•
黏度对热传递影响的对比测试 ------ 两种热穿透测试样品，分别灌装
0.9% NaCl和70%葡萄糖溶液。两种样品放置于相邻位置，灭菌，对F0值 对比分析。[结果两者的F0值没有显著性差异，软袋的热穿透样品可以使 用任何黏度低于70%葡萄糖黏度的溶液]
灭菌工艺验证的前期实验
4. 确定灭菌温度和压力
溶液中有最强耐热性，该溶液将用于验证和再验证中灌装生物指示剂测 试样品。当研发新的配方的溶液时要重新考虑。 • 耐热性对比测试 ------ 通过将生物指示剂暴露到不同的时间/温度条件下，
确定各种产品溶液对生物指示剂耐热性的影响。 [使用枯草芽孢杆菌5230 （正常在0.9%氯化钠溶液中D值=0.5±0.1分钟）对其在0.9%氯化钠溶液中 的耐热性和在产品中的耐热性进行比较]
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灭菌科学基础
物理杀灭力(F Physical)
指以灭菌工艺的物理参数为基础的物理杀灭力. Fphysical 值是杀灭率对时间的积分. Fphysical的计算公式如下： L = 10(T-Tref)/z, Fphysical = L x d
生物杀灭力（Fbiological）
指通过微生物的实际杀灭或生物指示剂的挑战试验得来 的灭菌过程的生物杀灭力。
•
灭菌工艺的初始验证
1. 装载方式的确定:
灭菌验证前应定义产品的装载方式，保证装载不影响产品在腔体内的受热， 并且确定最大和最小装载。
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灭菌工艺的初始验证
2.在最低灭菌温度下进行热穿透和生物指示剂的挑战试验 ----- 确定最短灭菌保温时间 物理致死性 ------ 对每一个灭菌装载进行三次热穿透和热分布联 合试验:
湿热灭菌验证
灭菌基础 灭菌柜确认 灭菌工艺的验证 灭菌再验证 包装完整性验证 化学药品灭菌/无菌工艺验证指导原则
术语
无菌保证水平(SAL，Sterility Assurance Level)
灭菌后出现非无菌产品的机率（可能性）。该值越小， 表明产品中微生物存在的概率越低。对于最终灭菌的产 品，设计上要保证小于一百万个产品有一个非无菌产品 的可能性（也就是，SAL<=10-6)。
灭菌科学基础
杀灭率（Lethal Rate)
指某一温度下灭菌1分钟与121.1℃下灭菌1分钟的比值，即某一 温度下灭菌1分钟所相当的标准灭菌时间，即F0和FT的比值 （L=F0/FT），可用如下的公式计算： L = 10(T-Tref/z).
F值(F-Value ，Lethality Factor)
生物指示剂的管理：
a) 微生物名称 d) 孢子浓度 b）来源 e) 有效期 c) D值 e) 贮存条件
灭菌再验证
证明灭菌柜的性能以及产品、工艺没有改变
频率：
根据风险确定
• • 针对灭菌柜: 每半年，可以涵盖在产品装载的再验证中 针对产品工艺规格: 每年，针对每一种规格产品的装载
验证方式：
热电偶（探针）分布方式：
随机分布或分布在有代表性的位置
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灭菌工艺的初始验证
4. 生物指示剂（BI）挑战实验:
最低灭菌温度验证中必须同时进行微生物挑战实验 10个样品放置在热穿透探针样品旁 生物指示剂选择考虑：
a) b) c) 结合产品特性，使用残存概率法的灭菌工艺（BI的耐热性应大于 产品的生物负荷的耐热性） 结合工厂生物负荷历史数据。 留有一定的安全系数。
灭菌工艺验证的前期实验
1. 产品中的冷点试验
产品冷点试验 运行一个灭菌循环，根据同一容器 中几个温度探针的相对温度差来确 定容器内部受热最慢的位置。该试 验的目的是确定灭菌验证中探针的 位置。 考虑因素 1. 2. 包装容器的几何构造 新的溶液和包装容器的组合
灭菌工艺验证的前期实验
2. 最难灭菌点的确定
• • • • • 灭菌温度：正常设定灭菌温度 暴露时间：正常暴露时间减 1 或 n 分钟 装载方式：最大和最小装载（受热最差情况） 实验项目：联合实验+生物指示剂挑战实验 接受标准：与初始验证一致
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包装容器及封口的完整性验证
验证产品在生产过程中及生产后有效期内均可防止被污染 • 验证方法：物理扩散或微生物浸入实验
• 温度 ------ 考虑产品、包材所能耐受的温度，研发资料中会有相应 的资料可以确定 压力 ------ 主要是要根据在灭菌过程的升温，保温和冷却阶段的产 品容器内压力变化来设定相应的程序来给灭菌柜施加相应的压力 （通过PLC控制的程序控制过滤的压缩空气的进入），从而保证产 品容器内外压力平衡，保护包材的完整性
• 残存概率法:
依据未灭菌产品中生物负荷的数量和耐热性，来确定被灭菌产品非无 菌的概率小于10-6的灭菌方法。该方法用于热不稳定的产品。选择这 种灭菌工艺需要确定未灭菌产品中生物负荷的控制限度和耐热性。要 进行常规的生物负荷监控，包括确定孢子的耐热性。
Fra Baidu bibliotek
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灭菌柜确认-安装确认
确保灭菌柜的安装符合设计标准:
指灭菌效力的度量值。 F(Tref,z) 是在规定的Z值条件 下,一个灭菌 程序赋予被灭菌物品在参照温度T下的等效灭菌时间，简称T度灭菌 时间。
F0 值（标准灭菌时间）
指Z值为10℃，一个湿热灭菌程序赋予被灭菌物品在121.1℃下的等 效灭菌时间。例如, 当Z值为10℃,BI 在116℃下灭菌25.9分钟的效 果相当于在121.1℃下灭菌8分钟。
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运行确认
满载热分布确认:
证明腔体内温度可以达到设定要求，并且热分布均匀
方法： • • • • 选取某种装载：通常是准备要验证的装载 灭菌参数选择：正常灭菌时间和温度 热电偶（探针）分布方式：均匀的分布在每个灭菌车上。
可接受标准： 暴露（保温）阶段同一时间各监测点与平均温度的最大偏差≤1.0℃或最 低温度与最高温度温差不超过2.0 ℃
开关门程序：在灭菌循环完成后，柜内压力降到规定的压力下, 电子压力开关才 允许电气和真空系统工作 运行空载检查安全和报警系统（模拟挑战报警系统，如低水位报警等一系列报警 功能） 运行空载检查灭菌器的运行程序 常规/预防维护程序：建立维护程序，并给相关人员充分培训以便执行到位 校正要求：根据所有需要校正的仪器设备清单逐项检查确认 空载和满载热分布测试各三次：证明灭菌器内温度分布的均匀性
主要接种点的确定 考虑的因素 包装容器的构造 包装容器的材料
对新的或改造的产品进行一系 1. 列的试验来确定主要的接种点， 2. 主要接种点在后续的所有的验 证中采用。主要的接种点是最 难灭菌的点。如果验证中评估 所有代表性的点，可以不进行 该试验。
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灭菌工艺验证的前期实验
3. 确定（再）验证的主溶液 ------ 确定一种溶液，生物指示剂在该
Percent Destruction
存活曲线公式 Log NF = -F/DT + Log No
101 100 10-1 10-2 10-3
Area of Probability of Survivors
10-4 10-5
NF = N30 min = 10-6
10-6
5
10
15
20
25
30
Equivalent Minutes at Temperature T (FT value)
DT=BI在参照温度（T）下的D值 LR=在整个灭菌循环中BI数量的对数减少值
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灭菌科学基础
时间、温度、杀灭率 (L) 和灭菌效力 (F)举例
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灭菌科学基础
致死率曲线
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灭菌科学基础
灭菌过程中温度-时间曲线
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灭菌方法选择（参考PDA TR#1）
是 热不稳定物料 否
残存概率法
用过度杀灭设计方法
多孔/硬质物体 装载类型 是否需考虑 空气去除 是 否
液体
否
是否需要 空气过压
是
是否存在 预真空灭菌柜 是 是
产品能直接 和水接触吗？ 否
否
使用预 真空过程
使用重力 下排过程
使用任何湿 热灭菌过程
使用SAM或 过热水过程
使用SAM 过程
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灭菌方法
• 过度杀灭法:
用一个假设的最差状况，来确定被灭菌产品非无菌的概率小于10-6的 灭菌方法。当使用过渡杀灭法时，验证程序必须证明F0大于12。该方 法用于热稳定的产品。采用该方法对于生物负荷测试和过程监控的要 求较低。
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灭菌科学基础
D值(Decimal Reduction)
微生物的耐受性参数，指在一定温度下，使微生物的 数量减少一个数量级或90%所需要的时间。D值越大，说 明微生物的耐热性越强。
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D值测试仪
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灭菌科学基础
温度系数 (z值)
Z值指某一种微生物 的D值减少到原来的 1/10（下降一个对 数单位）时，所需 升高的温度值 （℃），通常取 10℃。Z值描述了灭 菌温度变化对对生 物指示剂耐热性的 影响。
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术语
热力灭菌工艺常用的生物指示剂 灭菌方式 微生物（孢子） 嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 湿热121℃ 凝结芽孢杆菌Bacillus coagulan 梭状芽孢杆菌Clostridium sporogenes 干热150℃ 枯草芽孢杆菌黑色变种Bacillus subtilis var.niger D值范围 （min) 1.5-3.0 0.3-0.7 0.4-0.8 0.4-0.8 ＞1.0
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灭菌工艺的初始验证
3. 联合实验包括:
热分布实验
10+1（备份）根热电偶（探针）放置在灭菌车上（考虑几何分 布上的均匀性） 2根热电偶（探针）放置在柜体控制探针旁 2根热电偶（探针）用于监控循环水温度
热穿透实验
10+1（备份）根根热电偶（探针）放置在产品内部(监控产品温 度和F0值)