重测序分析简介
微生物重测序
微生物重测序
微生物重测序是一种技术，用于确定微生物群落的遗传多样性。
它通过对多个微生物样品中的DNA片段进行组装，以及比对其序列来识别出微生物类群的方法。
它不仅可以识别出微生物群落中的物种，还可以检测出微生物群落中的遗传变化。
微生物重测序技术是一种新兴的研究手段，能够快速、高效地揭示微生物群落的遗传多样性。
它可以用来识别和分类各类微生物，并追踪变化，从而为生物多样性的保护和管理提供科学基础。
微生物重测序技术的原理是，将微生物样品中的DNA 提取出来，然后将提取的DNA片段组装成完整的DNA序列，并将其与已知的微生物基因组序列进行比对，从而分析出样品中的微生物类群。
一般情况下，使用16S rRNA作为DNA序列比对的参考序列，因为16S rRNA在不同物种之间变异较小，可以用于识别和分类各类微生物。
微生物重测序技术非常方便，可以大大缩短分析时间，并且可以检测出微生物群落中的遗传变化。
通过对不同样品中的微生物多样性进行比较，可以获得关于微生物群落的更多信息。
例如，可以判断微生物群落的变化是否
出现于一个环境因子的影响，或者是否出现于病原体的活动。
此外，微生物重测序还可以为发现新物种提供帮助。
比如，通过对细菌样品中的DNA序列进行比对，可以发现一些与已知物种的DNA序列相似但不完全相同的新物种。
因此，微生物重测序是一种非常有用的技术，可以用来快速、高效地检测微生物群落中的遗传变化，以及发现新物种。
它不仅可以为生物多样性的保护和管理提供科学基础，也可以为生物多样性的发现和研究提供帮助。
基因组重测序
基因组重测序背景介绍 全基因组重测序，是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。
与已知序列比对，寻找单核苷酸多态性位点（SNP ）、插入缺失位点（InDel ，Insertion/Deletion ）、结构变异位点（SV ，Structure Variation ）位点及拷贝数变化(CNV) 。
可以寻找到大量基因差异，实现遗传进化分析及重要性状候选基因的预测。
涉及临床医药研究、群体遗传学研究、关联分析、进化分析等众多应用领域。
随着测序成本的大幅度降低以及测序效率的数量级提升，全基因组重测序已经成为研究人类疾病及动植物分子育种最为快速有效的方法之一。
利用illumina Hiseq 2000平台，将不同插入片段文库和双末端测序相结合，可以高效地挖掘基因序列差异和结构变异等信息，为客户进行疾病研究、分子育种等提供准确依据。
重测序的两个条件：（1）该物种基因组序列已知；（2）所测序群体之间遗传性差异不大（ >99% 相似度 ）在已经完成的全基因组测序及其基因功能注释的基础上，采用全基因组鸟枪法（WGS ）对DNA 插入片段进行双末端测序。
技术路线生物信息学分析送样要求1.样品总量：每次样品制备需要大于5ug 的样品。
为保证实验质量及延续性，请一次性提供至少20ug的样品。
如需多次制备样品，按照制备次数计算样品总量。
2.样品纯度：OD值260/280应在1.8～2.0 之间；无蛋白质、RNA或肉眼可见杂质污染。
3.样品浓度：不低于50 ng/μL。
4.样品质量：基因组完整、无降解，电泳结果基因组DNA主带应在λ‐Hind III digest 最大条带23 Kb以上且主带清晰，无弥散。
5.样品保存：限选择干粉、酒精、TE buffer或超纯水一种，请在样品信息单中注明。
6.样品运输：样品请置于1.5 ml管中，做好标记，使用封口膜封好；基因组DNA如果用乙醇沉淀，可以常温运输；否则建议使用干冰或冰袋运输，并选择较快的运输方式。
全基因组重测序数据分析详细说明
全基因组重测序数据分析详细说明全基因组重测序（whole genome sequencing, WGS）是一种高通量测序技术，用于获取个体的整个基因组信息。
全基因组重测序数据分析是指对这些数据进行处理、分析和解读，以获得有关个体的遗传变异、基因型、表达和功能等信息。
下面详细说明全基因组重测序数据分析的过程和方法。
首先，全基因组重测序数据的质量控制是必不可少的。
这一步骤包括对测序数据进行质量评估、剔除低质量序列，并进行去除接头序列和过滤序列等预处理操作，以确保后续分析的准确性和可靠性。
接下来，需要对全基因组重测序数据进行序列比对，将读取序列与参考基因组进行比对，以确定每个读取序列在参考基因组上的位置。
常用的比对工具包括Bowtie、BWA、BLAST等。
比对的结果将提供每个读取序列的基因组位置信息。
在序列比对完成后，就可以进行个体的变异检测。
变异检测的目的是识别个体的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）、插入缺失变异（insertions/deletions, indels）和结构变异（structural variations, SVs）等基因组变异。
通常，变异检测分为两个步骤：变异发现和变异筛选。
变异发现即根据比对结果，通过一定的算法和统计学原理，找到潜在的变异位点。
然后，利用临床数据库、已知变异数据库和基因功能注释数据库等，进行变异筛选，剔除假阳性和无功能变异，筛选出最有可能的致病变异。
接着，对筛选出的变异位点进行基因型確定。
基因型的确定可以通过直接从比对结果中读取碱基信息，或者通过再次测序来获取高度精确的基因型，以获得更可靠的变异信息。
随后，对变异位点进行注释和功能预测。
注释是指对变异位点进行功能和可能影响的基因、基因组区域和调控元件等进行注释。
常用的注释工具包括ANNOVAR、SnpEff、VEP等。
功能预测则是根据变异位点的位置和可能影响的功能进行预测，如是否影响蛋白质功能、是否在编码序列、是否在启动子或增强子区域等。
全基因组重测序数据分析
全基因组重测序数据分析1. 数据质量控制：对测序数据进行质量控制，包括去除低质量的碱基、过滤含有接头序列和接头污染的序列等。
这一步骤可以使用各种质控工具，例如FastQC、Trim Galore等。
2. 比对到参考基因组：将经过质控的测序数据与参考基因组进行比对。
参考基因组一般是已知的物种的基因组序列，在人类研究中通常使用人类参考基因组。
比对工具主要有BWA、Bowtie等。
3. 变异检测：从比对结果中检测出样本与参考基因组之间的差异，称为变异检测。
这包括单核苷酸变异（SNV）、插入/缺失（Indel）、结构变异（SV）等。
常用的变异检测工具有GATK、SAMtools、CNVnator等。
4. 注释和解读：对检测到的变异进行注释和解读，以确定其对基因功能和疾病相关性的影响。
注释可以包括基因、转录本、蛋白质功能、通路、疾病关联等信息。
常用的注释工具包括ANNOVAR、Variant Effect Predictor等。
5.结果可视化：将分析结果以图表或图形的形式展示出来，以便研究人员更好地理解和解释结果。
常用的可视化工具包括IGV、R软件等。
除了上述步骤，全基因组重测序数据分析还可以应用于其他研究领域，例如种群遗传学、复杂疾病研究、药物研发等。
在进行这些研究时，可能还需要其他分析方法和工具来完成特定的研究目标。
总之，全基因组重测序数据分析是一个复杂而关键的过程，它可以帮助研究人员了解个体的基因组特征，并揭示与疾病发生和发展相关的重要信息。
在不断发展的测序技术和分析方法的推动下，全基因组重测序数据分析将在基因组学领域中发挥越来越重要的作用。
全基因组重测序数据分析详细说明
全基因组重测序数据分析1. 简介(Introduction)通过高通量测序识别发现de novo的somatic和germ line 突变，结构变异-SNV，包括重排突变（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；针对重排突变和SNP的功能性进行综合分析；我们将分析基因功能（包括miRNA），重组率（Recombination）情况，杂合性缺失（LOH）以及进化选择与mutation之间的关系；以及这些关系将怎样使得在disease（cancer）genome中的mutation 产生对应的易感机制和功能。
我们将在基因组学以及比较基因组学，群体遗传学综合层面上深入探索疾病基因组和癌症基因组。
实验设计与样本（1）Case-Control 对照组设计；（2）家庭成员组设计：父母-子女组（4人、3人组或多人）；初级数据分析1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。
2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。
3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。
并根据参考基因组信息对检测到的变异进行注释。
4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。
在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。
对于每个InDel的检测，至少需要3个Paired-End序列的支持。
5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：插入、缺失、复制、倒位、易位等。
重测序ppt20120406
反转(Inversion)
成对reads比对到基因组上应该是一条正向，一条 反向互补。但结果两条reads都正向或反向互补比 对到参考基因组上
移码突变
• 在正常的DNA分子中，碱基缺失或增加非3 的倍数，造成这位置之后的一系列编码发
生移位错误的改变，这种现象称为移码突
变。
移码突变
多态性分布与差异分析
碱基平均测序深度
1 2 3 4 5 10 15
基因组未覆盖率
3.68E-01 1.35E-01 4.98E-02 1.83E-02 6.74E-03 4.54E-05 3.06E-07
基因组覆盖率
63.21% 86.47% 95.02% 98.17% 99.33% 100% 100%
测序深度与覆盖度
9
10
0
0
0x0200 the read fails platform/vendor quality checks
转为二进制后，以上各位代表含义均为0无据
比对
深度、覆盖度 SNP检测 SV检测
统计与注释
通过深度、质量值等筛选 得到可靠结果
重测序分析流程图
SAMtools
三、基因组重测序的发展
• 2008年4月17日的 Nature 杂志上，美国的科学家 发表了首个利用新一代 高通量测序技术得到的 人类全基因组， 这个基 因组正是“ DNA之父” James D.Watson的 。
2013/1/13
三、基因组重测序的发展
大豆重测序
水稻重测序
第一部分 基因组重测序概况 第二部分 重测序分析原理及内容
颠换
参考基因组上的碱基为G，但实际在物种中测得的为A,该位 点突变类型为颠换，且为纯合。
基因组重测序
基因组重测序
基因组重测序（Genome Resequencing）是一种研究族群遗传学和物种进化过程的常用分析方法，它包括对个体或物种基因组的重新测序，以及对基因组的遗传变异的进一步探讨。
基因组重测序可以用来研究物种进化，筛选便利性基因以及鉴定和分析基因组变异。
一、优势
1、基因组重测序的比较优势：重测序比利用芯片进行平面分析方法更加灵活。
能够快速鉴定多种类型的遗传变异，包括插入、缺失、临时变异，以及双倍体变异等。
2、复杂性大：由于重测序可以精细分析基因组中的染色体，因此可以更好地捕捉基因组变异的复杂性。
3、高效性：仪器分析周期短，该技术可以高效地获得基因组芯片和组装基因组变异的信息。
二、应用
1、种群遗传研究：基因组重测序能够针对个体或物种基因组的群体变异和单倍型进行分析，以发现先前未被准确定位的遗传标记和位点，有助于预测物种进入新环境时适应性和抗病性方面的变异。
2、育种研究：基因组重测序可以鉴定出品质和适应性相关的基因和位点，有助于精准育种。
3、公共健康：基因组重测序可以确定某种疾病的发病形态，有助于进
一步深入认识疾病的发生机理以及发病的根源，从而促进公共健康的发展。
三、前景
在未来，基因组重测序技术将会被广泛应用于基因组学中，例如用于进化生物学和疾病基因组学研究，它也可用于转基因技术和育种。
同时也会继续发展新的基因组重测序技术，更新、完善重测序技术，为科学家和科技工作者提供更多先进的应用技术。
全基因组重测序基础及高级分析知识汇总
全基因组重测序基础及⾼级分析知识汇总全基因组重测序是通过对已有参考序列（Reference Sequence）的物种的不同个体进⾏基因组测序，并以此为基础进⾏个体或群体⽔平的遗传差异性分析。
通过全基因组重测序，研究者可以找到⼤量的单核苷酸多态性位点（SNP）、拷贝数变异（Copy Number Variation，CNV）、插⼊缺失（InDel，Insertion/Deletion）、结构变异（Structure Variation，SV）等变异位点。
基于以上变异位点作为分⼦遗传标记，在⼈类复杂疾病、动植物经济性状和育种研究及物种起源、驯化、群体历史动态等⽅⾯具有重⼤的指导意义(Bentley2006; Casillas& Barbadilla 2017)。
⼀、 基础理论知识全基因组重测序研究主要是依据在全基因组⽔平发现的分⼦遗传标记进⾏物种的群体遗传学研究，进⼀步的利⽤统计⽅法进⾏影响表型和经济性状候选基因和功能突变的研究。
分⼦群体遗传学研究的理论基础知识及统计分析⽅法⽇趋完善和呈现多样性，作为初学者，有必要对其中的⼀些基础概念有⼀定的了解，才能为后续的深⼊学习、研究提供基⽯。
以下基础知识主要参考国内动物遗传学书籍和最新的⼀篇关于分⼦群体遗传学⽅⾯的综述改变⽽成(吴仲贤编1961; 李宁2011; 吴常信2015; Casillas & Barbadilla 2017)。
⾼通量测序技术作为分⼦群体遗传学研究的有⼒⼯具，在科学研究、⽣产及疾病诊断治疗中起到原来越重要的作⽤，对关于⾼通量测序相关的理论基础知识进⾏⼀定程度的了解，也有助于⽂献阅读和。
1. 群体遗传学基础知识群体（Polulation）：是指⽣活在⼀定空间范围内，能够相互交配并⽣育具有正常⽣殖能⼒后代的同种个体群。
等位基因频率（Alleles frequency）：在⼀个群体中，某类等位基因占该基因位点上全部等位基因数的⽐率。
动植物全基因组重测序简介
全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。
基于全基因组重测序技术，人们可以快速进行资源普查筛选，寻找到大量遗传变异，实现遗传进化分析及重要性状候选基因的预测。
随着测序成本降低和拥有参考基因组序列物种增多，全基因组重测序成为动植物育种和群体进化研究迅速有效的方法。
简化基因组测序技术是对与限制性核酸内切酶识别位点相关的DNA进行高通量测序。
RAD-seq（Restriction-site Associated DNA Sequence）和GBS （Genotyping-by-Sequencing）技术是目前应用最为广泛的简化基因组技术，可大幅降低基因组的复杂度，操作简便，同时不受参考基因组的限制，可快速鉴定出高密度的SNP位点，从而实现遗传进化分析及重要性状候选基因的预测。
简化基因组技术尤其适合于大样本量的研究，可以为利用全基因组重测序技术做深度信息挖掘奠定坚实的基础。
全基因组重测序和简化基因组测序技术可广泛应用于变异检测、遗传图谱构建、功能基因挖掘、群体进化等研究，具有重大的科研和产业价值。
产品脉络图。
重测序
全基因组重测序项目简介全基因组重测序是对已有参考序列（Reference Sequence）的物种的不同个体进行基因组测序，并以此为基础进行个体或群体水平的差异性分析。
通过这种方法，可以寻找出大量的单核苷酸多态性位点（SNP），插入缺失位点（InDel，Insertion Deletion），结构变异位点（SV，Structure Variation），拷贝数变异（Copy Number Variation，CNV）等变异信息，从而获得生物群体的遗传特征。
这对在群体水平上研究物种的进化历史、环境适应性、自然选择等方面具有重大意义。
利用全基因组重测序有助于快速发现与动植物重要性状相关的遗传变异，缩短分子育种的实验周期；有助于发现人类疾病相关的重要变异基因，加快生物医药研发的速度等，这对人类疾病及动植物育种研究等方面具有重大的指导意义。
技术流程提取基因组DNA后，采用物理方法随机打断，选择性回收所需长度的DNA片段（0.2~5Kb），并在两端连接接头以构建测序文库，进行桥式PCR（Bridge Amplification）制备Cluster，最后利用Paired-End的方法对插入片段进行重测序。
生物信息分析1．数据量产出总碱基数量、Totally mapped reads、Uniquely mapped reads统计，测序深度分析。
2．一致性序列组装与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。
3．SNP检测及在基因组中的分布提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。
并根据参考基因组序列对检测到的变异进行注释。
4．InDel检测及在基因组的分布在进行mapping的过程中，进行容Gap的比对并检测可信的Short InDel。
全基因组重测序数据分析
全基因组重测序数据分析全基因组重测序是一种高通量测序技术，可以获取一个个体的整个基因组的序列信息。
全基因组重测序数据分析是从这些序列数据中提取有用信息的过程，包括基因组装、变异检测和功能注释等。
本文将详细介绍全基因组重测序数据分析的步骤和一些常用的分析方法。
全基因组重测序数据分析的第一步是基因组装。
基因组装是指将测序得到的片段序列根据其重叠关系拼接成连续的序列。
目前有许多基因组装软件可供选择，如SOAPdenovo和SPAdes等。
这些软件会将测序片段根据其序列重叠情况进行集成，以获取最长的连续序列。
基因组装后，下一步是进行变异检测。
变异是指个体基因组与参考基因组之间的差异，可以分为单核苷酸变异（SNV）和结构变异（SV）两种类型。
SNV是指个体基因组中的单个碱基发生改变，包括单碱基插入、缺失和替换等。
SV则是指较大的基因组片段发生改变，包括插入、缺失、倒位和重组等。
变异检测的主要目标是通过比对个体的测序数据与参考基因组的序列，识别和注释这些变异。
为了提高变异检测的准确性，通常需要进行数据预处理和质量控制。
数据预处理包括去除接头序列、低质量序列和重复序列等，以提高后续分析的准确性和效率。
质量控制则是评估测序数据的质量，如测序深度、覆盖度和错误率等，以保证分析结果的可靠性。
除了变异检测，全基因组重测序数据还可以用于其他类型的分析，如基因表达分析和基因组结构分析。
基因表达分析可以通过比对测序数据和转录组数据库，识别并定量基因的表达水平。
基因组结构分析可以揭示染色体水平的变异和基因组结构的演化。
这些分析可以帮助研究人员研究基因组的功能和进化等问题。
总之，全基因组重测序数据分析是一个复杂的过程，涉及到多个步骤和分析方法。
通过对测序数据的组装、变异检测和功能注释等分析，可以获得有关个体基因组的详细信息，为基因功能研究和遗传疾病诊断提供重要参考。
随着测序技术的不断发展，全基因组重测序数据分析将会变得更加高效和准确。
三代数据重测序分析流程
三代数据重测序分析流程英文回答：Re-sequencing analysis, also known as resequencing, is a process used to determine the order of nucleotides in a DNA molecule. It is an essential step in genetic research and is particularly useful for studying variations in the genome. The third-generation sequencing technologies have revolutionized the field of resequencing analysis by providing high-throughput and cost-effective methods.The workflow of third-generation resequencing analysis typically involves several steps. Firstly, DNA samples are collected and purified to obtain high-quality genomic DNA. This can be done using various extraction methods, such as phenol-chloroform extraction or commercial DNA extraction kits. The extracted DNA is then fragmented into smaller pieces, which can range from a few hundred to several thousand base pairs in length.Next, the fragmented DNA is subjected to library preparation. This step involves the addition of specific adapters to the DNA fragments, which allow for the attachment of sequencing primers and enable the fragmentsto be amplified and sequenced. Library preparation methods can vary depending on the sequencing platform being used, but commonly involve enzymatic processes such as end repair, A-tailing, and ligation.Once the libraries are prepared, they are loaded onto the sequencing platform for sequencing. Third-generation sequencing technologies, such as PacBio SMRT sequencing or Oxford Nanopore sequencing, offer long-read sequencing capabilities, allowing for the generation of reads thatspan several kilobases in length. This is advantageous for resequencing analysis as it provides a more comprehensive view of the genome and allows for the detection ofstructural variations and complex rearrangements.After sequencing, the raw data is processed andanalyzed to obtain the final resequencing results. This involves several computational steps, including basecalling, read alignment, variant calling, and variant annotation. Base calling converts the raw signal data into nucleotide sequences, while read alignment maps the sequenced reads to a reference genome. Variant calling identifies differences between the sequenced sample and the reference genome, such as single nucleotide polymorphisms (SNPs) or insertions/deletions (indels). Finally, variant annotation provides information about the functional consequences of the identified variants, such as their potential impact on gene function or disease susceptibility.In conclusion, the third-generation resequencinganalysis workflow consists of DNA extraction, library preparation, sequencing, and data analysis. This process allows for the determination of the nucleotide sequence ofa DNA molecule and the identification of genetic variations. The advancements in third-generation sequencingtechnologies have greatly improved the efficiency and accuracy of resequencing analysis, making it an indispensable tool in genetic research.中文回答：重测序分析，也称为重测序，是一种确定DNA分子中核苷酸顺序的过程。
重测序分析简介
重测序参考手册目录目录 (1)1. 重测序简介 (3)2. 重测序实验方法 (3)基因组DNA抽提 (3)基因组DNA样品建库 (3)上机前定量 (4)3. 重测序分析内容 (4)重测序分析流程 (5)重测序分析内容 (5)4. 重测序重要技术参数 (6)5. 重测序分析内容解释 (6)6. 重测序分析内容示例 (6)SNP、INDEL的样本差异分析 (12)7. 成功分析案例/或已发表论文 (14)8. 概念及常用工具链接 (14)1. 重测序简介全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。
全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸多态性位点（SNP），插入缺失位点（InDel，Insertion/Deletion）、结构变异位点（SV，Structure Variation）位点。
众信可以协助客户，通过生物信息手段，分析不同个体基因组间的结构差异，同时完成注释。
2. 重测序实验方法提取基因组DNA，利用Covaris进行随机打断，电泳回收所需长度的DNA片段（0.2~5Kb），加上接头, 进行cluster制备（Solexa）或E-PCR （SOLiD），最后利用Paired-End或者Mate-Pair的方法对插入片段进行重测序。
实验步骤主要包括以下几点：基因组DNA抽提不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。
在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。
尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。
基因组DNA样品建库这是样品准备过程中最主要的环节，也就是真正意义上的建库（通常我们所说的建库包括整个样品准备的过程）。
全基因组重测序数据分析
全基1. 简通过变（d 的功况，dise 比较实验（1）（2）基因组重测序简介(Introduc 过高通量测序识deletioin, du 功能性进行综合杂合性缺失ease （cance 较基因组学，群验设计与样本Case-Contr）家庭成员组序数据分析ction)识别发现de plication 以及合分析；我们（LOH ）以及r ）genome 中群体遗传学综ol 对照组设计组设计：父母novo 的som 及copy numb 们将分析基因及进化选择与中的mutation 综合层面上深计 ；-子女组（4人matic 和germ ber variation 因功能（包括与mutation 之n 产生对应的深入探索疾病基人、3人组或m line 突变，）以及SNP miRNA ），重之间的关系；以的易感机制和基因组和癌症多人）；结构变异-SN 的座位；针对重组率（Rec 以及这些关系功能。
我们将症基因组。
NV ，包括重排对重排突变和combination ）系将怎样使得将在基因组学排突SNP）情在学以及初级数据分析1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。
2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。
3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。
并根据参考基因组信息对检测到的变异进行注释。
4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。
在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。
对于每个InDel的检测，至少需要3个Paired-End序列的支持。
使用生物大数据技术进行基因组重测序分析的方法
使用生物大数据技术进行基因组重测序分析的方法基因组重测序是通过高通量测序技术对生物体的基因组进行测序的过程。
随着生物大数据技术的不断发展，基因组重测序分析已经成为研究生物学领域的重要手段之一。
本文将介绍使用生物大数据技术进行基因组重测序分析的方法和流程。
首先，进行基因组重测序分析的第一步是准备样本和测序文库。
样本可以是细胞、组织或直接从环境中采集的样本。
测序文库是用于测序的DNA片段的集合，可以通过PCR扩增或其他方法制备。
通过采用适当的方法提取DNA，并根据测序目的选择合适的文库制备方法，可以保证测序的质量和准确性。
第二步是进行高通量测序。
高通量测序技术，如Illumina HiSeq、PacBio、ONT等，可以同时测序大量的DNA分子，大大提高了测序效率和产出。
在测序过程中，测序仪会生成大量的短序列读段，也即测序reads。
这些reads包含了样本中DNA分子的片段信息。
第三步是对测序数据进行质量控制和预处理。
测序数据通常存在测序错误、质量不均匀以及过度表示等问题。
因此，需要对测序reads进行去除低质量碱基、去除接头序列、去除重复reads等处理，以减少后续分析中的误差和干扰。
常用的质控工具有TrimGalore、FastQC等。
第四步是将预处理后的reads进行比对到参考基因组上。
参考基因组是已经测序和注释完善的一个生物种群的基因组序列。
比对的目的是确定样本中每个read 对应参考基因组中的位置，从而了解样本的基因组结构和基因组重排等相关信息。
常用的比对工具有Bowtie、BWA、STAR等。
第五步是进行基因组注释。
基因组注释是将比对到参考基因组上的reads与相应的基因、转录本、蛋白质等功能元件进行关联，以分析样本中的基因组变异、表达水平和基因功能等。
常用的注释工具有GATK、Cufflinks等。
第六步是进行变异检测和功能分析。
通过对比参考基因组和样本基因组的差异，可以检测到SNP（单核苷酸多态性）、Indel（插入缺失）、CNV（拷贝数变异）等多种变异类型。
WGS(重测序)分析详解与脚本
WGS（重测序）分析详解与脚本WGS（全基因组测序）是指对整个基因组的DNA序列进行测序的方法。
该技术的广泛应用使得人们能够对个体的基因组进行全面、高通量的分析，解析个体的基因组信息。
WGS分析的基本流程包括样本准备、DNA提取、文库构建、DNA测序和数据分析。
在样本准备阶段，需要准备足够的高质量DNA作为测序样本。
DNA提取的选择和操作要求严谨，以确保获得高品质和充分量的DNA。
DNA文库构建是将DNA片段连接到测序引物上，并进行PCR扩增，以便进行测序。
DNA测序采用高通量测序平台（如Illumina、Ion Torrent等）对文库进行高通量测序，生成数千万到数十亿条序列读取。
数据分析是WGS分析的核心部分，它包括数据质量控制、序列比对、变异检测和功能注释等步骤。
在WGS数据分析中，常用的脚本包括：1. 数据质量控制脚本：用于评估测序数据的质量，检测测序过程中的错误和偏差。
常用的软件工具包括FastQC、Trimmomatic等。
这些脚本可以用于对数据进行修剪、过滤和去除低质量读取，以提高下游分析的准确性和可靠性。
2. 序列比对脚本：用于将测序数据与基因组参考序列进行比对。
常用的比对工具有BWA、Bowtie、HISAT2等。
通过对序列比对的脚本进行设置，可以选择合适的参数对序列进行比对，提高比对的准确性和效率。
3. 变异检测脚本：用于从比对后的测序数据中检测出可能的DNA变异，如单核苷酸多态性（SNP）、插入/缺失（indel）和结构变异等。
常用的变异检测工具包括GATK、Samtools、FreeBayes等。
这些脚本可以根据测序数据的特点和分析需求，选择合适的算法和参数对变异进行准确和高效的检测。
4. 功能注释脚本：用于对检测到的变异进行功能注释，分析它们可能对基因功能和表达的影响。
常用的功能注释工具包括ANNOVAR、Variant Effect Predictor（VEP）等。
这些脚本可以根据基因组注释数据库，对变异进行注释，并提供有关其可能影响的功能和疾病相关信息。
生物大数据技术中的基因组重测序方法与分析
生物大数据技术中的基因组重测序方法与分析基因组重测序是生物大数据技术中的一项核心方法，可用于揭示个体、物种及种群的遗传变异，有助于了解基因组的结构和功能。
本文将介绍基因组重测序的方法和分析流程，以及其在生物研究和医学领域的应用。
基因组重测序是指对一个生物个体的基因组进行全面的测序，包括编码基因、非编码区域以及整个基因组的变异信息。
目前常用的基因组重测序方法主要有两种：全基因组测序（Whole Genome Sequencing，简称WGS）和外显子组测序（Exome Sequencing）。
WGS是对整个基因组进行测序，包括编码基因和非编码区域，能够提供全面的基因组变异信息。
它通过将DNA样品切割成小片段，使用高通量测序技术对这些片段进行测序，再通过基因组拼接算法将这些碎片拼接成完整的基因组序列。
WGS广泛应用于种群遗传学、人类基因组计划等研究项目中，可以发现个体间和物种间的遗传变异。
而外显子组测序则只对编码基因进行测序，这些编码基因是构成蛋白质的重要组成部分。
人类基因组中，编码基因仅占据整个基因组的一小部分，但大部分疾病相关变异发生在编码基因区域。
外显子组测序通过选择富集编码区域的方法，可以更高效地测序这些关键基因，并且产生更少的数据量，降低测序成本。
在基因组重测序完成后，需要进行一系列的分析流程来解读测序数据。
首先，对测序数据进行质控与预处理，去除低质量序列、去除仪器测序误差及接头序列。
然后，将剩余的高质量序列与参考基因组进行比对，以识别个体或物种的特定变异。
从比对结果中，我们可以获得每个个体的SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）和Indel（Insertion/Deletion，插入/缺失）等遗传变异信息。
这些变异信息对于研究遗传疾病、物种起源和进化等具有重要意义。
此外，还可以通过对基因组重测序数据进行拼接分析，将碎片序列拼接成完整的基因组序列，进一步了解个体或物种的基因组结构和功能。
基因组重测序介绍
基因组重测序介绍一、什么是基因组重测序呢？基因组重测序就像是给基因组这个超级复杂的“大拼图”重新拼一次，而且是超级仔细地拼哦。
咱们都知道基因组就像是生物的一个超级密码本，里面藏着好多好多关于这个生物怎么生长、怎么生病、怎么跟周围环境打交道的秘密。
基因组重测序呢，就是把这个密码本重新解读一遍。
比如说我们人类的基因组，那可是超级超级长的一串代码，重测序就像是拿着一个更高级的放大镜，去看看这串代码里有没有新的东西。
这就好比你已经有了一本看过的故事书，但是现在又有了新的解读方式，可能会发现书里原来还有隐藏的小情节呢。
二、为啥要做基因组重测序呢？这可就有趣啦。
想象一下，你是一个侦探，在调查一个生物为什么会有某种奇怪的特性。
基因组重测序就像是你在犯罪现场找到的新线索。
比如说有的植物特别能抗旱，科学家就会想，这植物的基因组里是不是有什么特别的地方呢？那就做个重测序呗。
或者是在研究遗传病的时候，通过重测序可以看看患者的基因组和健康人的基因组到底哪里不一样，就像在一堆差不多的线团里找出那根不一样的线。
还有啊，在农业上，如果想培育出更好的农作物，知道它们基因组的秘密，通过重测序就能朝着想要的方向去改进啦，就像给农作物来个超级定制。
三、基因组重测序是怎么做的呢？这个过程就像是一场超级精细的大工程。
首先得从生物样本里提取出DNA，这个DNA可脆弱啦，得小心翼翼的。
然后把这些DNA 打成一小段一小段的，就像把一根长长的面条剪成一小段一小段的。
接着呢，给这些小片段加上一些特殊的标记，这样就可以在后面的步骤里追踪它们啦。
再用一种超级厉害的仪器去读取这些小片段的信息，这个仪器就像一个超级扫描仪一样。
最后呢，把这些小片段的信息通过计算机程序重新拼接起来，就又得到了基因组的信息啦。
不过这个过程可不像我说的这么简单，中间有好多好多复杂的步骤和要注意的小细节，就像做一道超级复杂的菜，少了一点调料都不行。
四、基因组重测序有啥用呢？那用处可大啦。
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重测序参考手册目录目录 (1)1. 重测序简介 (3)2. 重测序实验方法 (3)基因组DNA抽提 (3)基因组DNA样品建库 (3)上机前定量 (4)3. 重测序分析内容 (4)重测序分析流程 (5)重测序分析内容 (5)4. 重测序重要技术参数 (6)5. 重测序分析内容解释 (6)6. 重测序分析内容示例 (6)SNP、INDEL的样本差异分析 (12)7. 成功分析案例/或已发表论文 (14)8. 概念及常用工具链接 (14)1. 重测序简介全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。
全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸多态性位点（SNP），插入缺失位点（InDel，Insertion/Deletion）、结构变异位点（SV，Structure Variation）位点。
众信可以协助客户，通过生物信息手段，分析不同个体基因组间的结构差异，同时完成注释。
2. 重测序实验方法提取基因组DNA，利用Covaris进行随机打断，电泳回收所需长度的DNA片段（0.2~5Kb），加上接头, 进行cluster制备（Solexa）或E-PCR （SOLiD），最后利用Paired-End或者Mate-Pair的方法对插入片段进行重测序。
实验步骤主要包括以下几点：基因组DNA抽提不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。
在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。
尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。
基因组DNA样品建库这是样品准备过程中最主要的环节，也就是真正意义上的建库（通常我们所说的建库包括整个样品准备的过程）。
样品片段化（Covaris）Covaris利用超声波剪切DNA，并将传统超声波法可控制化、精确化。
DNA可以在小体积中被剪切，减少了因为蒸发带来的样品损耗，并且被剪切的DNA片段大小之间的偏差较小。
Covaris剪切的片段大小较小，并且片段大小范围较传统超声波法窄。
选择合适的打断参数条件，使最后打断的DNA片段大小集中在300-500bp范围内。
末端修复使用Covaris剪切的DNA片段都会形成一些杂合的末端，其中包括了3’ 端悬垂结构、5’端悬垂结构和平末端。
这些大小不一的悬垂结构还会存在一些并没有磷酸化的末端。
本步操作目的就是用T4 DNA聚合酶和Klenow酶将这些大小不一的悬垂结构补平成平末端。
这些酶具有3'端→5'端外切核酸酶活性切除3' 端悬垂结构并具有聚合酶活性补平5'端悬垂结构。
另外，本步骤中T4 PNK可以将片段5’端磷酸化。
最后用AMPure XP Beads对补平反应体系进行纯化。
3'端加A反应本步在补平片段的3’末端连接一个A碱基可以减少在连接接头时片段之间的互连，并且由于接头的3’末端有一个独立T碱基，所以这一步的作用是在连接接头时，让接头与片段之间特异性连接。
接头连接反应本步在DNA片段末端添加一个测序接头，该接头与flow cell上的扩增引物相对应。
接头通过平末端连接在DNA片段的两端，并且通过接头在flow cell上进行桥式PCR扩增，形成测序簇。
纯化连接产物连接反应结束之后用AMPure XP Beads对补平反应体系进行纯化，最后用resuspension buffer 纯化至20ul的连接产物。
用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，切取所要求的片段大小的DNA片段，并用MInElute Gel Extraction Kit进行回收。
扩增目的片段本步通过PCR反应扩增已连好两个接头的DNA目的片段，PCR引物对应着接头的末端。
本步PCR使用高保真酶和尽可能少的循环数以减少假阳性的出现。
纯化终产物本步用用AMPure XP Beads对PCR反应体系进行纯化。
通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR 反应后的纯化产物，注意其片段大小和文库浓度。
上机前定量有很多客户会问到，如何保证他/她获得相应的数据量？为什么有时候出来数据量不够，有时候又会多出来许多？这个问题主要与上机前的定量有关。
目前Hiseq2000机器，每个Lane可以产生30G的数据量，因此往往需要将多个样品合并在一起进行测序，在上机前将各个样品按照预期数据量的比例进行混合，所以定量步骤的小量偏差可能导致数据量上的分布不均匀。
定量完成后，进行簇生成步骤，将序列固定到测序用的flowcell上，接下来就可以进行测序了。
3. 重测序分析内容重测序是利用测序获得的样本的DNA序列和已知的该物种的完整基因组序列比对，来检测该物种的基因组中发生的SNV、INDEL等突变。
进一步研究这些突变导致的转录翻译产物发生的变化。
目前第二代测序技术的两个平台Solexa 和Solid 均可用于重测序的研究，二者均为高通量测序。
与Solid 相比，Solexa 测序读长相对长一些（Hiseq2000的读长为100bp ），测序通量相差不大。
Solexa 的优势在于其后期分析可以选用的软件比较丰富，而由于Solid 采用的是双色谱碱基表示方法，可以在和已知基因组序列比对时纠正测序错误，使得其测序错误率降低。
但是后期分析的比对软件数量有限。
众信提供的重测序分析内容又分为两种，一种是基础分析，通常包含在整个项目的报价中，另一种是高级分析，需要额外询价。
重测序分析流程重测序分析内容分析内容解释 基础分析 测序质量评估及预处理 Reads 比对到参考基因组 比较Mapping 区域和期望的目标区域突变位点分析 编码区域的INDEL 分析 Exome 注释、及编码区SNP 分析和已知的SNP （如来自dbSNP 的数据）进行比较分析；三个样本共有的和特有的SNP 分析 SNP 深度变化高级分析 依据客户需求针对性设计分析内容原始数据质量评估及预处理 符合要求的数据参考基因组比对SNV/INDEL 预测SNV/INDEL 注释4. 重测序重要技术参数质量预处理：1) 滑动窗口法去除低质量片段：质量阈值20（错误率=1%），窗口大小5 bp，长度阈值35 bp2) 切除reads中含N部分序列：长度阈值35 bp若参与比对的reads数目超过80%可以比对到参考基因组上，则可以认为比对结果较好。
针对外显子的数据，外显子区域的覆盖率大于等于95%，平均深度大于30x为佳。
5. 重测序分析内容解释关于SNV/INDEL的注释由于不同物种的基因组完整的程度不一样，可以做到的注释程度也不同。
以人为例，由于对人的基因组研究比较深入，注释所需的信息比较全面，我们可以做的关于人的项目的注释也相对较多，除了SNV/INDEL突变导致的基因突变等常规的注释以外，还可以根据dbSNP和1000Genome数据库做已知SNP过滤。
关于重测序的高级分析，可以根据客户需求进行针对性的分析。
6. 重测序分析内容示例以外显子组重测序为例：测序数据处理及基因组比对使用solexa基因测序仪进行exome深度测序。
处理原始测序数据，经过质量控制，控制reads平均长度在90以上，平均质量在30以上，质量较好。
将所有数据进行genome mapping，使用HG18作为reference genome。
四个样本，能map到genome上的比例平均超过90%，结果较理想；exon capture效率四个样本均达到了较好的比对效果。
97%以上Exon区域被测序数据覆盖，覆盖度平均达26X以上。
EXON CAPTURE实验结果良好，数据量足够达到分析所需要的。
结论：总体看，样本xxx得到的数据量偏低，对突变位点的分析不造成影响。
从比对上去的Reads质量看，80%左右的Reads质量较好（平均质量大于20）；80%左右的Reads的PF值为1。
Exome深度分析四个样本的exome 平均深度的都主要集中出现在20X左右，出现了一个很明显的峰，证明exome-capturing target region被均匀的覆盖到了，近60%的target region有至少20X的覆盖深度，近40%的有至少30X的覆盖深度，符合分析的数据要求，可以进行后续分析以Demo1样本为例，target region 深度分布图如下：X轴-测序的深度Y轴-在给定深度下，target region 的数目以Demo1样本为例，target region 累积深度分布图如下：X轴-测序深度Y轴-大于等于给定深度的target region百分比SNP及INDEL分析SNP质量评估：四个样本的平均质量相近（N50质量为250），Demo1及Demo4样本深度为要略高于其他两个样本。
统计数据如下：样本号平均质量N50质量平均深度N50深度Demo1 83.83 293.11 5.15 14Demo2 79.43 271.35 4.88 13Demo3 74.85 193.53 4.86 10Demo4 86.22 246.49 5.72 13表格说明：平均质量：单核苷酸多态性位点平均质量值；N50质量：覆盖50% 所有SNP质量的最大单核苷酸多态性位点质量值；平均深度：单核苷酸多态性位点平均深度；N50深度：覆盖50% 所有SNP深度的最大单核苷酸多态性位点深度。
SNP、INDEL注释四个样本测得的SNP 得到的cSNP calls均在80000以上，其中被dbPSNP（SNP130）注释上比例在20%左右得到的INDEL均为短片段，为2~4bp左右，3n倍数的INDEL占总数近1/4左右。
四个样本SNP注释结果统计如下：Sample cSNP calls cInDel calls SNP/InDel in dbSNP 1000Genome Heterozygous Homozygous Demo1 275192 880 252804 242763 121446 154626 Demo2 279873 908 256923 246777 123018 157763 Demo3 150687 668 139028 133147 61429 89926Demo4 188596 780 172941 165532 80628 108748四个样本SNP类型统计如下：Sample cSNPcalls Non-Synonymous Synonymous StopgainStoplostDemo1 276012 9827 8834 168 14 Demo2 280488 9650 8818 153 16 Demo3 151225 7647 7624 110 10 Demo4 188596 8851 8581 128 14对INDEL数据进行单独分析：Sample cInDelcalls Non-frameshiftdeletionFrameshiftdeletionNon-frameshiftinsertionFrameshiftinsertionDemo1 880 21 29 17 41 Demo2 908 23 26 19 32 Demo3 668 16 13 9 17 Demo4 780 19 14 15 25SNP、INDEL的样本差异分析四个样本中共有的SNP的个数是40588个，占总SNP的比例较低，根据SNP质量分析，每个样本独有的SNP的质量偏低。