蔗糖酶的提取及活力
蔗糖酶的提取及活力、含量和相对分子质量测定
摘要：本学期共做了六次生化实验。.第一次是提取及纯化蔗糖酶，以为后续实验提供样品。实验主要目的是要求学生掌握高速离心机的使用。实验共得到不同纯化度的三种提取液，标记为A、B、C。将三种提取液分别放入冰箱保存，做为后续实验样品。也因此做此实验时必须保证各个操作无误，及准确，以免影响后续实验的结果。
第二次是有关蔗糖酶的柱层析法，主要目的是要求同学掌握离子交换层析的原理及柱层析的操作技术及紫外吸收的分析方法。此次实验通过柱层析及紫外吸收法得到2~3管的活力最大的分离液合并为分离液D，放入冰箱作为后续实验样品。第三次实验为蔗糖酶的活力测定，目的为掌握酶的活力测定方法，了解各个酶的纯化情况。利用分光度计测出各个样品的OD值，再对照葡萄糖的标准曲线来得出剩余葡萄糖的含量，从而获得各个酶的活力大小，了解各个酶的纯化情况。并得出结论酶的纯化度越高，活力越小。
第四次实验为蔗糖酶蛋白质的含量测定，目的为掌握学习Folin-酚测定蛋白质含量的原理及方法，制备标准曲线测定未知样品中蛋白质含量。同样利用与标准曲线对照来得到试样的蛋白质含量，并测出酶的比活力。测量蛋白质的方法有多种，我们必须根据所做实验的具体选择合适的方法来测定蛋白质。
第五次的实验是微量凯氏定氮测总蛋白。目的是要求同学掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理及方法。本实验除利用了凯氏定氮法外还加上了酸式滴定法最后得出了毫克级别的总蛋白含量。其结果与上一实验所测得的总蛋白质含量有所不同，正证明了不同的方法测量蛋白质造成的误差不同，致所得结果不同。
最后一次实验为SDS-PAGE测定蛋白质分子质量，目的为掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和测定蛋白质分子量技术。此实验操作复杂，需先制作凝胶再结果染色脱色，最后还要制作标准蛋白分子质量曲线图来进行试样对照。最后得到蔗糖酶的分子量在5万左右及9万左右。
关键字：实验；提取液；比活；蛋白质；SDS-PAGE；OD
正文：
1，蔗糖酶的提取及提纯
1.1，文献综述：蔗糖酶的分离利用的是细胞破壁法。细胞破壁：就酶在生物体
内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶时，要
破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。
材料不同，破壁也方法不同。我们用的菌体（微生物）细胞破壁方法是：自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系
将细胞破坏，是细胞内物质释放出来。自溶时需加少量防腐剂，以防外界
细菌污染。自溶法的缺点是时间较长。本实验的自溶条件是：加乙酸钠保持弱碱性条件、35 ℃、加入乙酸乙脂代替防腐剂，0.5-1h。自溶法的操作较简单方便，适合学生操作。
1.2，材料与方法
1.2.1，材料：啤酒酵母；醋酸钠；甲苯；4mol/L醋酸；95%乙醇；0.5mol/Lris-HCl PH7.3缓冲液；锥形瓶；量筒；烧杯；具塞试管；吸球；培养箱；恒温水浴锅；磁力搅拌器；搅拌子；高速冷冻离心机；
1.2.2，方法：
1.2.2.1,酵母自溶：
?250毫升锥形瓶,加入20克鲜酵母
?加入醋酸钠1.6克，搅拌使团块的酵母液化
?加1.5毫升甲苯，包扎好瓶口，摇动10分钟，使充分混匀
?放入37℃培养箱，保温48-60小时，使酵母自溶
1.2.2.2,初提液A制备.
?在培养箱中取出装有已自溶酵母的三角瓶，加10毫升蒸馏水，摇匀，倒入
离心管1中，平衡（互加平衡）。
?用高速冷冻离心机4℃，15000r／min离心10min。
?离心管中的悬浮液分三层，上层为浆状物（甲苯及其抽提物)，下层为固体
（细胞碎片沉淀），中间一层为液体(含酶)。
?小心仔细地取出中间层的液体，重新倒入离心管2中，4℃，15000r／min
离心10min （互加平衡）。
?取上清液倒入
?25毫升量筒
?量体积记录VA
?取出3ml保存
?得初提液A
1.2.2.3,热提取液B制备:
?将初提液A（VA-3ml）倒入50毫升的三角瓶中，加4mol/L的醋酸3.2ml
左右，使溶液的pH值约为4.5左右，摇匀
?50℃恒温水浴中保温25min(注意温度绝对不能超过50℃)，在保温过程中
不断的摇动三角瓶
?离心：4℃，15000rpm，10min
?（H2O平衡）
?仔细地倒出上层清液入10ml量筒测量体积，记为VB，此提取液为热提取
液B。
?取出3ml于具塞试管保存，用于后续实验。
1.2.2.4,乙醇沉淀提取液C制备
?将热提取液B （VB-3ml）倒入100ml的烧杯中，放入加有碎冰的大烧杯
冰浴，置于磁力搅拌器上，缓慢加入体积（VB-3ml ）-20℃95%乙醇。整个过程不少于25min，结束后再继续搅拌5min
?将烧杯内的液体全部移入离心管中，杯底白色固体保留待用，4℃，
15000rpm,离心10min 加（95%÷2）乙醇平衡。离心后弃去上清液
?用5毫升tris HCL溶解烧杯中的白色固体，再倒入离心管中搅拌使管内的
固体溶解，再次离心，4℃，15000rpm,10min,平衡用tris HCL溶液平衡
?离心后取上层清液入10ml量筒
?测量体积，记为VC
?此提取液为乙醇沉淀提取液C
?测量其体积为VC。全部保存于具塞试管，用于后续实验。
1.3,结果与讨论
实验得到ABC各三种不同程度纯化的蔗糖酶提取液，颜色各从深及浅，说明蔗糖酶本身的颜色较浅。
初提液A 热提取液B 乙醇沉淀提取液C
溶液体系水溶液醋酸tris HCl
特点pH值4.5左右pH值7.3左右
体积/ml 16 19.04 7.9
颜色状态黄色溶液黄色溶液淡黄色溶液
影响因素温度、酸碱度控制不准会影响蔗糖酶产量
1.4,结论
实验中在将提取液A水浴时必须不断摇动锥形瓶，温度不能超过50℃，取出后迅速在水浴中冷却，之后所有的操作都必须在冰浴上。而在提取液B放入乙醇时，必须要保证乙醇的速度缓慢，是乙醇混合均匀，析出最大量的沉淀使所需酶充分变性沉淀。整个操作必须严谨细心，保证蔗糖酶得到了最优纯化。
提纯酶时可以充分利用蛋白质的变性、复兴的性质来得到纯化的酶液。
2,蔗糖酶的纯化Q Sepharose -柱层析法
2.1文献综述：通过对不同离子交换层析方法的比较,进行酵母蔗糖酶纯化实验改进,采用Q Sepharose离子交换介质;流动相经 5 0 min由0 .0 5 MTris- HCLp H7.3缓冲液到1MNa CL的0 .0 5 MTris- HCL p H7.3缓冲液,进行梯度洗脱分离,分离效果最好,蔗糖酶与杂蛋白得到了有效的分离,回收率为9
3.2 %,是现有实验的3.17倍,浓缩倍数为 2 .91,是现有实验的 1.4 3倍,提高了实验效果。
2.2,材料与方法
2.2.1,材料
?试剂：0.05mol/LTris-HCl PH7.3缓冲液；1mol/LNaCl和0.05mol/LTris-HCl
PH7.3缓冲液; 0.5mol/LnaOH; Q Sepharose
?器具：层析柱、梯度发生器及搅拌子、紫外分光光度计、点滴板等
2.2,.2, 方法
2.2.2.1,离子交换柱的填充
?固定和清洗：层析冲洗。下面留一点水。柱子垂直固定，下端的橡皮管夹
子夹紧、取下上部盖子，加水5毫升
?凝胶装柱：高约5公分，上面填平，注意上部水面高于交换剂平面，放松
夹子，使水流下，直到与表面相切，夹紧夹子。
2.2.2.2,缓冲液盐度梯度发生器的安装
?连通：先加入水，两个旋钮朝一个方向可以连通，使液体进入，连接桥不
可以有气泡。然后使旋钮回到正中，加入相应的溶液。
?装入溶液：第一个杯子加入20毫升0.05摩尔/升Tris HCl pH 7.3 ，并加
入磁力棒，第二个加入20毫升1摩尔/升NaCl
2.2.2.3,柱的平衡
?在小烧杯中加入15毫升Tris HCl
?恒流泵进口插入烧杯液面下
?恒流泵出水管一端连接柱子
?放松夹子
?打开恒流泵
?用Tris HCl冲洗
?直到缓冲液面与交换剂相切
2.2.2.4,加样及洗穿透峰：
?夹紧下端夹子, 在烧杯加入15毫升Tris HCl
?从上部缓慢加入0.5ml提取液C，放松夹子
?样品全部刚好进入交换剂内，相切，夹紧夹子
?先打开恒流泵，再放开夹子
?用量筒收集全部流出液体，每管收集3ml
?直到液面相切
2.2.2.5,氯离子梯度洗脱
?将梯度发生器出口与恒流泵相连
?恒流泵与柱相连
?③打开搅拌器，打开连通器旋钮，打开恒流泵
?④用20 毫升Tris HCl 缓冲液配制的
?1摩尔/升NaCl20 毫升溶液
?开始梯度洗脱
?打开夹子
?⑤用量筒收集3 毫升/管，
?直到全部缓冲液流出
2.2.2.6,离子交换剂的再生
?烧杯加入15 毫升NaCl洗脱→不用收集→凝胶冲到小烧杯→全部凝
胶回收
?最后一个班用0. 5摩尔/升NaOH洗3CV，除去氯离子，不用回收洗脱液
→最后凝胶回收，冲到烧杯里面
2.2.2.7,用紫外分光光度计测每管的紫外吸光度OD值，并记录。
测定后样品回收!!
2.2.2.8,酶活力测试
?样品选取（老师指导下）
?从洗穿透峰样品中选择1-2个蛋白质浓度较高的样品测定酶活力
?从梯度洗脱样品中选取峰值附近的几个样品进行酶活力测定。
?酶活力测定：点滴板中滴2滴5%蔗糖→加2滴待测洗脱液→玻璃棒搅匀
→放置5min→浸入葡萄糖试纸→1s（延长时间）取出→过60s比较颜色深浅→用“+”表示酶活力的大小
?体积测定
?将酶活力较高的2-3个样品合并测量体积（洗穿透峰样品不用合并），记为
VD，用具塞试管保留，其他样品可以洗掉。
2.3,结果与讨论
2.3.1结果
酶活力测试：
0.081 0.171 0.144 0.111 0.034 0.018 0.077 0.009 0.048 0.050
0.139 0.181 0.220 0.283 0.525 0.6330.584 0.375 0.224 0.154
0.206 0.309 0.291 0.180 0.06 0.025
保存11，13管 V=5.3ml
OD值分布图
2.3.2分析
此图有3个峰。第一个峰用无盐的Tris-HCIpH7.3缓冲液，
所以洗脱出来的是缓冲液无蔗糖酶。第二个峰是线性洗
脱，采用CI-带动蛋白质往下降，随着CI-浓度增加，蔗
糖酶的浓度有一个最大值。第三个峰是应为酶提取液C中
3，蔗糖酶活力的测定
a) 3.1，文献综述:在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比
例关系，可用于比色测定，可用DNS比色法测定还原糖的含量，可用
DNS比色定糖法测定蔗糖酶的活力.。
3.2，材料与方法
3.2.1，材料
?试剂3、5-二硝基水杨酸；葡萄糖标准溶液0.2mg/ml；0.2mol/L醋酸钠缓
冲液，pH4.6；5%蔗糖用0.2mol/L醋酸钠缓冲液，pH4.6配置；2mol/L NaOH
?器材：电炉；恒温水浴锅；分光光度计；试管、移液管
3.2.2，方法
3.2.2.1，葡萄糖标准曲线制作
?烧水，不要太多
?DNS反应：注意振荡混匀，移液管对应，要及时清洗
试管号0 1 2 3 4 5
葡萄糖/ml 0 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
蒸馏水/ml 3.0 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6
DNS/ml 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
总体积/ml 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5
?测吸光值
?于540波长处测OD值。用0号做对照。
?测定要求：测定数据在（0.1-0.7A），波动可以到0.2-0.8，最小不能小于0.1，
最大不能超过1.0。
?绘制葡萄糖标准曲线：以葡萄糖的毫克数为横坐标，OD值为纵坐标，画
出葡萄糖标准曲线。数据结果回去处理。
?要求R2值接近1，至少0.999。
3.2.2.2,酶活力测定
?稀释样品：
?稀释方法：
提取液 A B C D
比例1：200 1：200 1：200 1：20
移液管原
液
0.25ml 0.25ml 0.25ml 0.5ml
定容50ml容量
瓶
50ml容量
瓶
50ml容量
瓶
10ml移液
管
?稀释顺序：浓度从低到高，即C→B→A，防止污染。
?水解反应
试管
项目
A0 A1 B0 B1 C0 C1 D0 D1
酶液A稀释液各取4种稀释液2.00 ml，加入8支试管，按项目名称编号NaOH ml变性0.5 --- 0.5 --- 0.5 --- 0.5 ---
预热5%蔗糖试剂瓶，8支试管（放在试管架上），于35℃预热10min
蔗糖ml 各试管加入5%蔗糖 2 ml加入后立即摇匀开始计时，35℃准确反应3min
NaOH 终止反
应
--- 0.5 --- 0.5 --- 0.5 --- 0.5 总体积/ml 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50
3.2.2.3, 进行DNS 反应，测吸光值 试管号/ml A0
A1
B0
B1
C0
C1
D0
D1
反应液V
测
0.1 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.3 0.3
从上次水解反应液中分别取出V 测，用ABCD 移液管，先取对照 蒸馏水 2.9
2.9
2.9
2.9
2.85
2.85
2.7
2.7
DNS 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 总体积 4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
? 测吸光值
? 调零：以A0、BO 、C0、D0分别作对照调平。每组需重新调平。 ? 测过的样品不要倒掉。
?
如果测得的OD 值结果不在标准曲线还原糖范围内，则可增加或减少取样量，加倍或减半，重新做DNS 反应，直到OD 值在标准曲线范围内为止（0.1-1.0之间）。
? 吸光值结果分别代入葡萄糖曲线公式，计算4.5 ml 溶液中所含还原糖的量
（以葡萄糖计），用表格记下。 3.2.2.4, 计算出酶活力单位 3.3,结果与讨论 1.结果 A0 A B0 B C0 C D0 D V 0.15 0.15 0.25 0.25 0.10 0.10 0.30 0.30 蒸馏水 2.85 2.85 2.75 2.75 2.90 2.90 2.70 2.70 DNS 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 V 测 0 0.938 0 1 0 0.721 0 0.632 OD 值 0 0.470 0 0.512 0 0.340 0 0.287 mg 0 4.50 0 4.90 0 3.58 0 3.17
vA 总=16.0 vB 总=15.5 vC 总=7.9 Vd =56.7
项目初提取液A 热提取液B 乙醇提取液C 柱分离液D
总活力
单位数
/U
36700 36382 18322 13271
回收率
/%
100 99 49.9 36.2
2.讨论
随着蔗糖酶的提纯，纯化柱分离与蔗糖酶的总活力单
位数依次下降，这是由于随着每一步进行，难免有损
失，或者有舍弃部分，因此酶的总活力单位数依次下
降；由酶的回收率的定义可知，在该实验中随着每一
步纯化步骤的进行，由于操作上的损失以及纯化过程
中的取舍原因，每一次的分离纯化得到的蔗糖酶的总
活力单位数依次下降，因此酶的回收率也依次下降。
4，蔗糖酶蛋白质含量测定
a) 4.1，文献综述:凡含有两个及两个以上肽键（—CO—NH—）的化合物
（如双缩脲：H2N—CO—NH—CO—NH2），在碱性溶液中（如Folin-
甲试剂）都能与Cu2+作用，形成紫色的复合物；蛋白质是由多个氨基酸
通过肽键连接起来的，故所有的蛋白质均可与Folin-甲试剂反应，形成
紫色的铜-蛋白质复合物；铜-蛋白质复合物在pH=10的碱性溶液中可将
磷钼酸-磷钨酸（Folin-乙试剂）还原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物，其颜
色的深浅（在一定范围内）与蛋白质的含量成正比；在测定液体蛋
白质样品含量的常用方法中（双缩脲法、Folin-酚法和紫外吸收法），Folin-酚法的灵敏度最高（比紫外吸收法高10-20倍，比双缩脲法高100
倍），所以我们选用本方法。
4.2，材料与方法
4.2.1材料
?试剂：试剂A：碱性铜试剂（碱性）；试剂B：酚试剂，黄色试剂，保存在
棕色瓶中；标准浓度牛血清白蛋白溶液（200ug/ml）；Na2WO4·2H2O；
Na2MoO4·2H2O；85%H3PO4；浓HCl；Li2SO4·H2O；溴水；酚酞指示剂；
Na2CO3；NaOH；CuSO4·5H2O；酒石酸钾钠；牛血清白蛋白。所用试剂均为化学纯或分析纯。
?器具：①721分光光度计②刻度吸管0.5ml（*1），2ml*2，5ml*1③试管
1.5cm*15cm（*8）④恒温水浴槽
4.2.2，方法
4.2.2.1蛋白质含量标准曲线绘制
?Folin-酚反应
所加试剂/ml 管号
0 1 2 3 4 5
标准牛血清蛋白液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
水/ ml 4.5 4.3 4.1 3.9 3.7 3.5
试剂A / ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 摇匀，静置10min
试剂B / ml 第一次
0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
立即迅速充分混合，加一管摇一管，静置10分钟
第二次
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
立即迅速充分混合，加一管摇一管，55℃5min，注意水浴锅
水位足够，取出试管置于冷水冷却1Min
总体积/ml 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 OD660
?测吸光值：OD 660nm；0号试管作对照
?绘制标准曲线：横坐标为标准蛋白质微克数，纵坐标为吸光值。
?未知蛋白质浓度测定
样品稀释
A B C D
稀释比例1:100
1:100
1:20 1:1
稀释方法0.5ml原液：
50 ml容量瓶
0.5ml原液：
50 ml容量瓶
0.5ml原液
+
9.5 ml 移液
管量取
不稀释
测样品蛋白含量
试剂量/ml 所加试剂管号
A0 A1 B1 C0 C1 D0 D1
样品稀释液/ml
移液管：酶液0 0.5 0.5 1/20
Tris
0.5 ml
0.5 Tris
3ml
3
水/ ml 4.5 4.0 4.0 4.0 4.0 1.5 1.5 试剂A 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
试剂B 第
一
次
0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
第
二
次
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
总体积/ml 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 OD660nm/A
4.3，结果与讨论
各样品测定结果表 管号 项目 A1 B1 C1 D1 OD660nm/A 0.414 0.224 0.406 0.155 蛋白含量/ mg 0.116 0.058 0.106 0.038 总蛋白/ mg 139.2 96.00 30.24 0.0760 比活力（U / mg ） 37.8
26.0
67.2
3498.7
各提取液酶活力等比较
总体积/ml 总酶活/U
总蛋白/mg 比活力/U/mg 蛋白回收率% 酶活回收率% 纯化倍数
/倍
初提液A 6.0
5265
139.2
37.8
100
100
1
热提取液
B
6.0 2494.8 96.0 26.0 69.0 4
7.4 0.69
乙醇提取
液C
6.0 2031.8 30.23 6
7.2 21.7 3
8.6 1.78
柱分离液
D 6.0 265.9 0.456 3498.7 0.33 5.1 92.56
4.4结论
本次实验利用了Folin-酚原理，该实验方法灵敏度高，但蛋白质浓度和光密度的线性关系不够严格，而且不同的蛋白质的Tyr 和Typ 含量不同，显色程度也会有
差异，所以造成了实验的一些误差，使制作的曲线线性程度不够，且B的纯化倍数<1.另实验中的一些操作不规范，也可能导致实验结果产生误差，故在实验中必须规范实验操做，仔细滴加试剂，减小实验误差。
5，微量凯氏定氮法测总蛋白氮
5.1，文献综述:凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。(参考文献：微量凯氏定氮法测定食品中粗蛋白的含量)
5.2，材料与方法
5.2.1，材料
?试剂：（1）蛋白样品：2g牛血清蛋白溶于0.9% NaCl溶液并稀释至100（2）
98% 浓硫酸。（3）硫酸钾3份与硫酸铜1份（w/w）混合研磨成粉末。（4）30%NaOH溶液：30 g氢氧化钠溶于蒸馏水，稀释至100 ml。（5）2%硼酸溶液：2 g溶于蒸馏水，稀释至100 ml。（6）混合指示剂：0.1 %甲基红乙醇溶液与0.1 %甲基蓝乙醇溶液，临用时按2:1的比例混合。或0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液,临用时按1:5的比例混合。（7）
0.01mol/L HCl标准溶液
?仪器：改良式凯氏定氮仪
5.2.2，方法
5.2.2.1，消化
原理：NH2CH2COOH + H2SO4 →2CO2 + 3SO2 + H2O + NH3 （1）2NH3 + H2 SO4 →（NH4）2 SO4 （2）
5.2.2.2，洗涤
?蒸汽发生器2内通入水，2/3左右
?漏斗3加入10ml 蒸馏水，流入反应室1，中间用夹子夹住
?100ml锥形瓶盛有2%硼酸液10.0ml和指示剂4滴，冷凝管的管口插入酸
液内0.5cm，硼酸液颜色不变色（变淡可以），表示仪器洗净。变色需吸去重新洗。
?加热，产生蒸汽经贮液管、反应室至冷凝管，冷凝的液体流入接收瓶9
?移去硼酸，继续蒸馏1min ，用水冲洗冷凝管口，吸去反应室残液。
?吸去反应室残液方法：除去锥形瓶，撤去酒精灯，蒸汽瓶温度降低，压力
减小，导致反应室内高压气体将反应室内液体压入蒸汽瓶，反应室内残液即被倒吸出去。然后放开上下端水管，使液体流出一会儿，冷却反应室和蒸汽瓶。
5.2.2.3，蒸馏
?蒸汽发生器2内通入水，2/3左右
?由小漏斗加入5 ml消化液V3至反应室，用蒸馏水洗涤小漏斗，洗涤液由
小漏斗流入反应室，高度低于球部
?用小量筒量取10ml 30% NaOH ，倒入小漏斗，放松弹簧夹，流入反应室，
当小漏斗内仍有少量NaOH 溶液时，夹紧夹子。
?再加约3 ml 蒸馏水于小漏斗内，同样缓缓放入反应室，并留少量水在漏斗
内作水封。
?100ml锥形瓶盛有2%硼酸液10.0ml和指示剂4滴，管口插入酸液内0.5cm ?接受瓶先放置好再开始加热，产生蒸汽经贮液管、反应室至冷凝管，冷凝
的液体流入接收瓶9
?当硼酸液由葡萄紫色变成绿色后→再蒸馏3 Min →然后降低锥形瓶，使冷
凝管口离开酸液液面约1 cm 。再蒸馏1min →用少量蒸馏水冲洗冷凝管口，移去锥形瓶，准备滴定。→吸去反应室残液，洗涤反应器。
?重复蒸馏三次，每次均需洗涤，方法同步骤（二）
5.2.2.4，滴定
?用0.01 mol/L HCl 溶液滴定锥形瓶中的硼酸液至粉红色即可，记录所耗的
HCl 溶液量。
?原理：（NH4）2B4 O7 + 2 HCl + 5H2O →2NH4Cl + 4H3BO3 （5）
?注意：滴定管要排除里面气体。
5.3,结果与讨论
1.结果
滴定所消耗的0.01mol/LHCI溶液体积为
V1=0.43ml V2=0.44ml V3=0.44ml
V11=0.40ml V22=0.44ml V33=0.40ml
V平均=0.425ml
样品B含氮量=0.425*0.01*14.008*50/0.05*5=11.91mg/ml
蛋白质含量=11.91*6025*20.67=1538.6mg
2.分析
与上一次Folin-酚法测定的结果有差异，可能原因有：
①样品B中含有-NH2基因等杂质，消化时产生的NH3比实际蔗糖酶
等消化产生的NH3高，导致结果偏高。②由于凯氏定氮法测得的样品
中含氮的总含量，因此样品中混有其他无机氮化合物被算入总氮量，
使结果偏高。
③由于操作不当引起误差。
6,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量
6.1,文献综述：各种蛋白质因所带的净电荷、分子量大小和形状不同而有不同的迁移率。消除净电荷对迁移率的影响，可采用聚丙烯酰胺浓度梯度电泳，利用它所形成孔径不同引起的分子筛效应，可将蛋白质分开。也可在整个电泳体系加入十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sμlfate简称SDS），则电泳迁移率主要
依赖于分子量，而与所带的净电荷和形状无关，这种电泳方法称为SDS-PAGE。
用SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理：SDS是阴离去污剂，在单体浓度为0.5mmol/L以上时，蛋白质和SDS就能结合成复合物；当SDS单体浓度大于1mmol/L时，它与大多数蛋白质平均结合比为 1.4g SDS/1g蛋白质；在低于0.5mmol/L浓度时，其结合比一般为0.4g SDS/1g蛋白质。由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。在蛋白质溶解液中，加入SDS 和巯基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽组分分成单个亚单位。SDS可使蛋白质的氢键、疏水键打断，因此它与蛋白质结合后，还引起蛋白质构象的改变。此复合物的流体力学和光学性质均表明，它们在水溶液中的形状近似雪茄形的长椭圆棒。不同蛋白质-SDS复合物的短轴相同，约1.8nm，而长轴改变则与蛋白质的分子量成正比。基于上述2种情况，蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是与椭圆棒的长度，也就是蛋白质分子量的函数有关。进行SDS-PAGE时，可利用已知分子量蛋白质的电泳迁移率和分子量的对数作出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。用此法测定蛋白质分子量具有仪器设备简单，操作方便，样品用量少，耗时少（仅需一天），分辨率高，重复效果好等优点，因而得到非常广泛的应用与发展。它不仅用于蛋白质分子量测定，还可用于蛋白质混合组分的分离和亚组分的分析，当蛋白质经SDS-PAGE分离后，设法将各种蛋白质从凝胶上洗脱下来，除去SDS，还可进行氨基酸顺序、酶解图谱及抗原性质等方面的研究。（参考文献：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理）
6.2，材料与方法
6.2.1，材料
?30%丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺（Acr作为单体）29.2g，甲叉双丙烯酰胺(Bis
作为交联剂）0.8g，溶解于双蒸水100ml，中枢神经毒物凝聚后无毒。
?10%的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)：0.1mlTEMED+0.9ml双蒸
水（凝固加速剂）；
?10％过硫酸铵溶液（凝固的催化剂）；
?分离胶缓冲液贮液（1.5mol／L Tris-HCl，pH8.8）；
?浓缩胶缓冲液贮液（1mol／L Tris-HCl，PH6.8）；
?2×SDS-样品缓冲液：1ml浓缩胶缓冲液贮液+ 4ml 10%SDS + 1ml疏基乙
醇+ 2ml甘油+ 0.5ml 0.1%（w/v）溴酚蓝（电泳指示剂），加双蒸水至10ml。
4℃保存；
?SDS-电极缓冲液贮存液（0.025mol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％SDS，
pH8.3）：在900ml双蒸水中溶解15.1g Tris和94g甘氨酸，加入50ml 10%（w/v）SDS贮液，加双蒸水补至1000ml则成5×SDS-电极缓冲液；
?10% SDS：25g SDS用双蒸水溶解至250ml，室温保存；
?染色液：0.25gR250考马斯亮蓝溶于90ml甲醇∶水（1∶1，v/v）和10ml
冰乙酸的混合液
?脱色液：50ml甲醇加75ml冰乙酸，加蒸馏水至1000ml；
?蛋白质样品液：A、B、C、D；
?标准蛋白质：包括兔磷酸化酶B，MW97400；牛血清蛋白，MW66200；兔
肌动蛋白，MW43000；牛碳酸酐酶，MrW31000；胰蛋白酶抑制剂，MW20100；鸡蛋清溶菌酶，MW14400。
6.2.2，方法
6.2.2.1，玻璃板清洗和安装
6.2.2.2，分离胶制备
?配分离胶成分：12%分离胶
分离胶缓冲液30%聚丙烯酰胺
贮液
10% SDS
10% 的过硫酸铵溶
液
水10%的TEMED
2.5ml 4.0 ml 0.1 ml 0.1ml
3.3 ml 55 ul
移液管Acr移液管
用后要洗
移液枪AP,移液枪移液管
移液枪，具塞试管中避光保存
最后加入，加好后马上灌胶
?各成分加入小烧杯，加入每一种应立即用塑料吸管抽吸慢慢混匀，不要有
过多气泡
?TEMED最后加入，马上灌胶
?用塑料吸管从一边加入玻璃板之间，防止气泡，不要全部挤入（2/3高度，
梳子下端距分离胶上边缘1.5cm）
?加水覆盖，加满水，出现界面，再次出现界面聚合完成，
?倒出水，用滤纸条吸出表面的水
?聚合30~60 min
6.2.2.3，浓缩胶制备
?用滤纸吸干水层
?配制5%浓缩胶：5%
浓缩胶缓冲液30%聚丙烯酰胺贮液 10% 的过硫酸铵溶液水10%的TEMED
0.5ml 0.67 ml 40ul 2.7 ml 35 ul
?各成分加入小烧杯，加入每一种应立即用塑料吸管抽吸慢慢混匀，不要有
过多气泡
?TEMED最后加入，马上灌胶
?用塑料吸管从一边加入玻璃板之间，混匀加入在分离胶上层
?插入梳子，不要插反
?聚合
?取出梳子（注意用力平衡，不要左右摇摆）
?用滤纸条除去样品槽内的水分。
?撕去胶条，玻璃板方向：凹槽向内，不要用力压
6.2.2.4，加样品
6.2.2.5，电泳
条件：平均电流80 mA，染料距底部边缘1.5cm 时（一个板到达，两个
都要停下），停止电泳，关闭电源。
6.2.2.6，染色和脱色
?取出凝胶平板，移去玻璃板（用自来水慢慢冲下）
?凝胶浸泡于染色液中（培养皿中放置）
?染色4h 或过夜
?第二天来倒掉染色液（回收）换脱色液
?第三天再换一次脱色液
?第四天再换一次脱色液（胶可以保存在脱色液中，直到下次来讲结果）
6.3，结果与讨论
1.结果
编号 1 2 3 4 5 6
标准溶液0.2cm 0.7cm 1.1cm 1.3cm 1.7cm 2.4cm
A溶液0.6cm 1.2cm 1.5cm
B溶液0.6cm 1.2cm 1.5cm
C溶液0.6cm 1.2cm
D溶液 1.4cm
染料迁移距离为3.7cm
各样品的染料迁移率分别为0.152，0.331，0.422
根据蛋白质分子量对数对电泳迁移率图可计算得蔗糖酶中
所含的蛋白质相对分子质量分别为68291，36528，25619。
2.讨论
本实验通过SDS-PAGE凝胶电泳法得到了蛋白质分子对数与相对迁
移率的标准曲线，R2=0.9629，线性程度不是很高。这可能与前面
分离胶与浓缩胶的制备有关，后面进行加样前的拆板的步骤使凝
胶内混入气泡使测出来的结果不输特别符合线性。
根据洗脱出来的凝胶可看出A,B样品中含有的杂蛋白较多，所以
阴影的地方很多，而C,D样品经提纯之后蛋白的含量少量，而且
蛋白也越来越纯，所以D只有一块阴影和标准蛋白对齐3,4条线。
这就是蔗糖酶电泳出来的线。
总结
通过一系列实验，我们分离提纯蔗糖酶，测定出酶活力以
及比活力，通过Folin-酚法，凯氏定氮法测定蛋白氮含量
以及蛋白质含量，通过SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质分子
量大小。直观的显示了蔗糖酶的物化性质。试验中我们掌
握了分离提纯，测定性质的基本方法，从中学习到了更多
了操作知识。
参考文献
【1】《生物化学技术实验指导》作者：孙培龙，吴石金出版社：化学工业出版社
啤酒酵母的蔗糖酶的提取提纯及测定
浙江工业大学药学院生物化学实验论文 2013 年12 月13日
啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文 摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：（1），蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液A；b、接着调PH并加热、离心得热提取液B；c、用乙醇沉淀离心得提取液C。（2），蔗糖酶的纯化—Q Sepharose 柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液D。（3），蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反应后的值，得各提取液的酶活力与回收率。（4），蔗糖酶蛋白质含量的测定及活力OD 540 计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的OD 660值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍数。(5),微量凯氏定氮法（以B为样品）：先将样品B消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用HCl滴定馏出液，计算蛋白质含量。（6），SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量：首先制备分离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。 关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳； 正文： 文献综述 蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。蔗糖酶的最适温度为45℃-50℃，最适ph为4.0-4.5. 实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会 1 蔗糖酶的提取及初步提纯 1.1实验原理 酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。 1.2 试剂与器材 1.2.1试剂
淀粉酶活力测定实验报告
淀粉酶活力测定实验报告 淀粉酶活力测定实验报告实验三、淀粉酶活性的测定实验报告 实验四、淀粉酶活性的测定 一、实验目的: 1、了解α - 淀粉酶和β - 淀粉酶的不同性质及其淀粉酶活性测定的意义; 2、学会比色法测定淀粉酶活性的原理及操作要点。 二、实验原理: 淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。根据α-淀粉酶和β-淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化;β-淀粉酶不耐热，70? 15min 则被钝化。测定时，使其中一种酶失活，即可测出另一种酶的活性。 淀粉在淀粉酶的催化作用下可生成麦芽糖，利用麦芽糖的还原性与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸，测定其吸光度，从而确定酶液中淀粉酶活力(单位重量样品在一定时间内生成麦芽糖的量)。 三、实验用具: 1、实验设备 研钵,具塞刻度试管,离心管，分光光度计，酸度计，电热 恒温水浴锅，离心机，电磁炉。 2、实验材料与试剂 (1)0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液:A液:称取柠檬酸20.01g，定容至 1000ml;B液:称取柠檬酸钠29.41g，定容至1000ml;取A液55ml与B液145ml混匀。 (2)1%可溶性淀粉溶液:1g淀粉溶于100ml 0.1mol/l pH5.6
的柠檬酸缓冲液; (3)1%3,5-二硝基水杨酸试剂:称取3,5-二硝基水杨酸1g、NaOH 1.6g、酒石酸钾钠30g，定容至100ml水中，紧盖瓶塞，勿使CO2进入; (4)麦芽糖标准溶液:取麦芽糖0.1g溶于100ml水中; (5)pH 6.8的磷酸缓冲液: 取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解，用 0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至 6.8，加水稀释至1000ml即得。 (6)0.4mol/L的NaOH溶液; (7)1%NaCl溶液。 (8)实验材料:萌发的谷物种子(芽长约1cm) 四、操作步骤 1、酶液提取:取6.0g浸泡好的原料，去皮后加入10.0mL 1%的NaCl 溶液，磨碎后以2000r/min 离心10min，转出上清液备用。取上清液1.0ml，用pH 为6.8的缓冲溶液稀释5倍，所得酶液。 2、a- 淀粉酶活力测定 (1) 取试管4支,标明2支为对照管,2支为测定管。 (2) 于每管中各加酶液lml ,在 70?士0.5? 恒温水浴中准确加热15min ,取出后迅速用流水冷却。 (3) 在对照管中加入4m1 0.4mol/L氢氧化钠。 (4) 在4支试管中各加入1ml pH5.6的柠檬酸缓冲液。 (5) 将4支试管置另一个40?士 0.5? 恒温水浴中保温15min ,再向各管分别加入40?下预热的1,淀粉溶液 2m1,摇匀,立即放入40?恒温水浴准确计时保温 5min。取出后向测定管迅速加入4ml 0.4mol/L氢氧化钠,终止酶 活动,准备测糖。
【免费下载】生物化学实验示范报告 蔗糖酶的提取与纯化正确
生物化学实验示范报告: 实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化 实验目的: 1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法； 2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理； 3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法； 4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。 实验原理： 蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。酶分离 提纯的原理与蛋白质的相同。但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。 有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉 淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶 蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。 蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质 的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。 蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。在本实验条件下，每3min释放lmg还原糖所需的酶量定义为一个活力单位；通过Folin法测定酶蛋白的含量，计算蔗糖酶的比活。单位质量的酶蛋白中所含酶的活力称为酶的比活。 主要实验器材： 1. 试管、血糖管； 2. 秒表； 3. 冰盐浴； 4. 恒温水浴； 5.离心机； 6. 721- 型分光光度计； 7. 柱层析装置； 8. 梯度洗脱装置； 9. 部分收集器；10. 电磁搅拌器；11. 冰箱；12. DEAE—纤维素。
实验七尿淀粉酶活性测定
实验七尿淀粉酶活性测定 淀粉酶（AMY或AMS在体内的主要作用是水解淀粉，它随机地作用于淀粉分子内的 a—1, 4糖苷键生成葡萄糖、麦芽糖、寡糖及糊精。血清中的淀粉酶主要有胰型（P型）和 唾液型（S型）及其亚型同工酶组成，P型淀粉酶主要来源于胰腺，S型淀粉酶主要来源于唾 液腺。正常淀粉酶因分子量小，故可从肾小球滤过而由尿中排出。 【目的】 1、验证淀粉酶的催化作用。 2、观察淀粉及其水解产物分别与碘反应呈现的颜色变化。 【原理】血清及尿中的淀粉酶来源于胰腺和唾液腺，正常血清与尿中有一定活性。 Winslow 氏法测定尿和血清中淀粉酶活性是将试样作等比稀释，观察一系列试样在规定的 37C、30分钟的条件下，恰好能将0.1%淀粉溶液1ml水解（指加入碘液后不再呈蓝色）的 酶量定为淀粉酶的一个活性单位，乘以尿的稀释倍数，即可得知每项ml 尿液中的淀粉酶活性。 【器材】 试管（10mn X 100mr）、试管架、电热恒温水浴箱、吸管、洗耳球、滴管。 【试剂】 1 、 9%NaCl 2、0.3%碘液 3、0.1%淀粉溶液 【操作】 1 、准备尿液（自备）。 2、取 10支试管，编号，用吸管向管中加入0.9%NaCl 1ml。 3、用1ml吸管（注意应用刻度到头的）向第一管加尿液1ml，混合，再将试管中的液 体吸起，然后任其流回试管，如此重复三次，以便全管混匀，并借此冲洗吸管内壁。吸出此混合液1ml 移入第二管中。 4、用同法处理第二管使之混匀，并取出1ml 置于第三管中。依此类推，如此继续稀释 至第九管后，吸出1ml混合液弃之，这样既可获得分别含原尿液为1/2ml,1/4ml,1/8ml, ... 1/512ml 的不同浓度的尿稀释液。第十管不加尿液作为对照管。 5、从第十管起依次向各管迅速准确加入0.1%淀粉液2ml，迅速摇匀（是否充分混匀往
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酵母蔗糖酶提取方法的研究 生命科学学院 10级生物科学类李倩 10197022 指导老师：陶芳 摘要：采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，通过抽提、30﹪乙醇分级、50﹪乙醇分级和透析，同时测定各步的蛋白质浓度和酶活，并据此计算比活、回收率和纯化倍数。 关键词：蔗糖酶提取自溶法 Research on the Extraction Method of Yeast Sucrose School of Life Sciences，Biological Sciences of grade 2, li Qian, 10197022 Abstract:The autolysis extract from yeast invertase,through extraction,30 ethanol fractionation and dialysis,simultaneous determination of each step of concertration of protein and enzyme avtivity,and then calculate the radio of live,recovery and purification. Key words:yeast；extraction；autolysis method 前言：蔗糖酶（Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶（Invertase),1928年Dumas等首先指出酵母菌发酵蔗糖时必须有这种酶的存在，蔗糖在蔗糖酶的作用下，水解为葡萄糖和果糖，还原力增加，又由于生成果糖，甜度增加。 按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶（β-D-frutofuranosidases,EC 3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidases,EC 3.2.1.20)。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。工业上多从酵
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蔗糖酶的发酵生产及酶学性质研究 摘要：本实验酵母中蔗糖酶进行分离纯化并对酶学性质进行了初步的研究。结果表明:酵母蔗糖酶的最适pH为5.0, 最适温度为45℃。 关键词：蔗糖酶、酶学性质 1前言 蔗糖酶(Sucrase, EC3.2.1.26) 又称转化酶(Invertase)。可作用于β-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。由于果糖甜度高,可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。 本实验对酶的动力学性质分析, 是酶学研究的重要方面。本研究通过一系列实验对酵母蔗糖酶的动力学性质如最适温度、最适pH、酶的固定化等进行了初步研究，更好的了解了没得性质。 2材料与方法 2.1 材料与设备 2.1.1 实验材料 酵母、活性干酵母、壳聚糖 2.1.2 试剂及配制方法 葡萄糖、蔗糖、豆芽汁浸汁、Na 2HPO 4 、KH 2 PO 4 、MgSO 4 、NaCl、NaOH、Na 2 CO 3 、盐 酸、氨水、琼脂、酒精均为国产分析纯。 95%乙醇溶液、DEAE-Sepharose Fast Flow、1 mol/L醋酸溶液、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(内含0.5 mol/L NaCl溶液，pH值7.3) 葡萄糖标准液配制（1mg/ml）：预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500ml容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。 1% 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。 10%蔗糖溶液：10g蔗糖溶解于蒸馏水中，定容至100ml 0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液
实验三、淀粉酶活性的测定实验报告
实验四、淀粉酶活性的测定 一、实验目的： 1、了解α - 淀粉酶和β - 淀粉酶的不同性质及其淀粉酶活性测定的意义； 2、学会比色法测定淀粉酶活性的原理及操作要点。 二、实验原理： 淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。根据α-淀粉酶和β-淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；β-淀粉酶不耐热，70℃ 15min 则被钝化。测定时，使其中一种酶失活，即可测出另一种酶的活性。 淀粉在淀粉酶的催化作用下可生成麦芽糖，利用麦芽糖的还原性与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸，测定其吸光度，从而确定酶液中淀粉酶活力（单位重量样品在一定时间内生成麦芽糖的量）。 三、实验用具： 1、实验设备 研钵,具塞刻度试管,离心管，分光光度计，酸度计，电热恒温水浴锅，离心机，电磁炉。 2、实验材料与试剂 （1）0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液：称取柠檬酸20.01g，定容至1000ml；B液：称取柠檬酸钠29.41g，定容至1000ml；取A液55ml与B液145ml混匀。 （2）1%可溶性淀粉溶液：1g淀粉溶于100ml 0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液； （3）1%3,5-二硝基水杨酸试剂：称取3,5-二硝基水杨酸1g、NaOH 1.6g、酒石酸钾钠30g，定容至100ml水中，紧盖瓶塞，勿使CO2进入； （4）麦芽糖标准溶液：取麦芽糖0.1g溶于100ml水中； （5）pH 6.8的磷酸缓冲液:取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，加水稀释至1000ml即得。 （6）0.4mol/L的NaOH溶液； （7）1%NaCl溶液。 （8）实验材料：萌发的谷物种子（芽长约1cm） 四、操作步骤 1、酶液提取：取6.0g浸泡好的原料，去皮后加入10.0mL 1%的NaCl 溶液，磨碎后以2000r/min 离心10min，转出上清液备用。取上清液1.0ml，用pH 为6.8的缓冲溶液稀释5倍，所得酶液。 2、a- 淀粉酶活力测定 (1) 取试管4支,标明2支为对照管,2支为测定管。 (2) 于每管中各加酶液lml ,在 70℃士0.5℃恒温水浴中准确加热15min ,取出后迅速用流水冷却。 (3) 在对照管中加入4m1 0.4mol/L氢氧化钠。 (4) 在4支试管中各加入1ml pH5.6的柠檬酸缓冲液。 (5) 将4支试管置另一个40℃士 0.5℃恒温水浴中保温15min ,再向各管分别加入40℃下预热的1％淀粉溶液2m1,摇匀,立即放入40℃恒温水浴准确计时保温5min。取出后向测定管迅速加入4ml 0.4mol/L氢氧化钠,终止酶
土壤蔗糖酶、纤维素酶的测定方法
土壤蔗糖酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法） 一、原理 蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及 土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生 成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度 与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1）酶促反应试剂：基质8%蔗糖，pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠 （11.876g Na2HPO4·2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成，甲苯 2）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 3） 3,5- 二硝基水杨酸试剂（DNS试剂） 称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2mol/LNaOH和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释定容至100ml（保存期不过7天）。 三、操作步骤 （1）标准曲线绘制 分别吸1 mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新 沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色， 以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。 （2）土壤蔗糖酶测定
淀粉酶活性的测定
淀粉酶活性的测定 一、原理 淀粉酶（amylase）包括几种催化特点不同的成员，其中α－淀粉酶随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶；β－淀粉酶每次从淀粉的非还端切下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶；葡萄糖淀粉酶则从淀粉的非还原端每次切下一个葡萄糖。淀粉酶产生的这些还原糖能使3，5－二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3－氨基－5－硝基水杨酸。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。可以用麦芽糖制作标准曲线，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。几乎所有植物中都存在有淀粉酶，特别是萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性最强，主要是α－和β－淀粉酶。Α－淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；而β－淀粉酶不耐热，在70℃15min则被钝化。根据它们的这种特性，在测定时钝化其中之一，就可测出另一个的活力。本实验采用加热钝化β－淀粉酶测出α－淀粉酶的活力，再与非钝化条件下测定的总活力（α＋β）比较，求出β－淀粉酶的活力。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：萌发的小麦种子（芽长约1cm）。 （二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 离心机；3. 恒温水浴（37℃，70℃，100℃）；4.具塞刻度试管；5. 刻度吸管；6. 容量瓶。 （三）试剂（均为分析纯）：1. 标准麦芽糖溶液（1mg/ml）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100ml；2. 3，5－二硝基水杨酸试剂：精确称取1g3，5－二硝基水杨酸，溶于20ml2mol/L NaOH溶液中，加入50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100ml。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用；3.01mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7.H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L；B液（0.1mol/L 柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7.2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。取A液55ml与B液145ml混匀，即为0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液；4.1％淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100ml0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 三、实验步骤 （一）麦芽糖标准曲线的制作：取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表（详教材）加入试剂。摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20ml。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定。以麦芽糖含量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制标准曲线. （二）酶液制备：称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加少量石英砂和2ml蒸馏水，研磨成匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15～20min，每隔数min搅动1次，使其充分提取。然后在3000rpm 下离心10min，将上清液倒入100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液10ml，放入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液。 （三）酶活力的测定：取6支干净的具塞刻度试管，编号，按表（详教材）进行操作。（四）结果计算：淀粉酶活力=C×V T/(W×V s×T)(mg/g/min)。式中，C为从标准曲线上查得的麦芽糖含量（mg）；VT为淀粉酶原液总体积（ml）；Vs为反应所用淀粉酶原液体积（ml）；W为样品重量（g）；t为反应时间（min）。
参考教案-蔗糖酶的提取纯化与鉴定分析
参考教案：酵母蔗糖酶的提取纯化与鉴定 蔗糖酶（E.C.3.2.1.26）（ —D—呋喃果糖苷果糖水解酶），能催化非还原性双糖（蔗糖）的1，2-糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。 由于果糖甜度高 ,约为蔗糖1.36～1.60倍 ,在工业上具有较高的经济价值。可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的 软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。 蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶,其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过NeLson法测定还原糖的产生数量来测定。一个酶活力单位规定为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。比活力单位为每毫克蛋白含有酶活力单位。 （本实验以酵母为原料） 一、教学目的 通过酵母菌扩大培养及蔗糖酶的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子（酶）制备方案设计和开展实践研究的方法，体验从复杂细胞混合物体系中提取纯化酶的基本原理、 过程和方法。 本实验为学生提供一个较全面的科学研究实践机会，整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的设计空间和动手机会，有利于培养学生的学习兴趣和从事科学研究的能力。 二、教学内容
测定α-淀粉酶活力的方法
实验五激活剂、抑制剂、温度及PH 对酶活性的影响 一、目的要求通过实验加深对酶性质的认识，了解测定a-淀粉酶活力的方法。 二、实验原理 酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。酶催化的反应称为酶促反应。生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。 能提高酶活力的物质，称为激活剂。激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。 酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。 温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。同样，反应中某一PH 范围内酶活力可达最高，在最适PH 的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。 食品级a - 淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、 黑曲霉、米曲霉等微生物产生。但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对 淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。a -淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的a -1,4 糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称 a -淀 粉酶为液化淀粉酶。a -淀粉酶不能水解淀粉支链的 a -1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽 糖、葡萄糖和a -1,6 键的寡糖。 本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于6 个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪a -淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。 三、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响 （一）试剂及材料 1、1: 30唾液淀粉酶配置用蒸馏水漱口，1min后收集唾液，以1: 30倍蒸馏水稀释。
酵母蔗糖酶的提取及性质测定
酵母蔗糖酶的提取及性质测定 引论及原理 酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。本实验属综合性实验，接近研究性实验，包括八个连续的实验内容，通过对蔗糖酶的提纯和性质测定，了解酶的基本研究过程；同时掌握各种生化技术的实验原理、基本操作方法。本实验技术多样化，并且多个知识点互相联系，实验内容逐步加深，构成了一个综合性整体，为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。 蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol 蔗糖，就生成2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson 比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。 在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 （一）实验目的 学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。 （二）实验原理（略） （三）实验仪器、材料及试剂 仪器 1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱 2. 电子天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯 3. 离心管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒 材料及试剂 1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存） ＋ H 2O 蔗糖酶 O H H O
蔗糖酶测定方法
蔗糖酶测定（比色法）： 蔗糖酶是一种可以把土壤中高分子量蔗糖分子分解成能够被植物和土壤微生物吸收利用的葡萄糖和果糖的水解酶，为土壤生物体提供充分能源，其活性反映了土壤有机碳累积与分解转化的规律。 蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。因此，蔗糖酶的活性可以根据水解生成物与某些物质（3，5-二硝基水杨酸或磷酸铜）生成有色化合物含量来确定。现介绍3，5-二硝基水杨酸比色法，该方法以蔗糖为基质，根据葡萄糖与3，5-二硝基水杨酸反应生成黄色产物，来确定土壤蔗糖酶活性。 试剂 1）3，5-二硝基水杨酸溶液：称取0.5克二硝基水杨酸，溶于20mL 2mol/L氢氧化钠和50毫升水中，再加入30克酒石酸钾钠，用水稀释至100mL（不超过一周）。 2）pH值为5.5的磷酸缓冲液：1/15mol/L磷酸氢二钠（11.867g Na2HPO4·2H2O溶于1升蒸馏水中）0.5毫升加1/15mol/L 磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1升蒸馏水中）9.5毫升配成。 3）8％蔗糖溶液。 4）甲苯 5) 标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50-58℃条件下，真空干燥至恒重。然后取500mg 溶于100ml蒸馏水中，即成葡萄糖标准溶液（5mg/ml）。再将此液稀释10倍制成葡萄糖工作液（0.5mg/ml）。 操作步骤 称取5g土，置于50mL三角瓶中，加入5滴甲苯，15min后注入15mL 8％蔗糖溶液和5mL pH 5.5磷酸缓冲液，摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。 到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1mL，注入50mL容量瓶中，加3mL3，5－二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3－氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处比色。 每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。 在分析样品的同时，取0、1、2、3、4、5、6、7mL葡萄糖工作液，分别注入50mL容量瓶中，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究
论文 论文题目：蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究 作者姓名周柱林 指导教师钟莉 学科专业食品科学与工程1102 所在学院生物与环境工程学院 提交日期 2013年12月
蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究 周柱林 生物与环境工程学院食品科学与工程1102班 摘要：对啤酒酵母蔗糖酶的相关性质进行研究讨论，实验采用酵母自溶法初步得到粗蔗糖酶，离心除杂质法得到初提取液A，接着制备热提取液B，接着制备乙醇沉淀提取液C，接着采用Q Sepharose-柱层析法得到纯度较高的D液，然后用DNS法、标准曲线法和分光光度法测定蔗糖酶的活力，用Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量及计算比活力，用微量凯氏定氮法测定总蛋白含量，最后用SDS-PAGE法测定蛋白质的相对分子质量，并对其基本性质进行了研究。实验测定结果A、B、C提取液的酶回收率（％）分别为100、128.5、56.6，蛋白回收率（％）分别为100、98.15、4.29，比活力分别为17.4、22.8、230.1，纯化倍数分别为1、1.31、13.22，SDS-PAGE测定酵母蔗糖酶相对分子质量为A:99150、45000；B：10140；C：92200、65660. 关键词：蔗糖酶、提取、纯化、酶活力、蛋白质含量、比活力、相对分子质量 1.前言（文献综述）： 啤酒酵母也叫营养酵母，可以从其中提取蔗糖酶，蔗糖酶又称为转化酶，属于水解酶类，蔗糖在蔗糖酶的催化下，水解为两种还原糖D一葡萄糖和D一果糖。蔗糖酶在植物的运输贮藏、碳水化合物代谢中发挥主要作用，并在渗透调节、抗逆性生长繁殖、以及信号传导方面也发挥着重要的作用。按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶（β -D-frutofuranosidases,EC 3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidases,EC 3.2.1.20)。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。工业上多从酵母中提取。 目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多 , 有SDS抽提法，正交法等等，其中以甲苯自溶法最为常见。本实验采用此自溶法从啤酒酵母中提取蔗糖酶，利用有机溶剂将胞内蔗糖酶释放，经过初提取的离心去杂和等电位沉淀，制得的粗酶经醇沉后，采用Q Sepharose-柱层析法纯化，利用DNS法测定其酶活力，利用Folin-酚法测定蛋白质的含量及比活力，利用微量凯氏定氮法测总蛋白氮，以及用SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量，并对其基本性质进行了研究，也为酵母蔗糖酶在食品工业中的应用和蔗糖酶基因工程产品的技术开发提供了实验依据。
蔗糖酶的提取及活力
蔗糖酶的提取及活力、含量和相对分子质量测定 摘要：本学期共做了六次生化实验。.第一次是提取及纯化蔗糖酶，以为后续实验提供样品。实验主要目的是要求学生掌握高速离心机的使用。实验共得到不同纯化度的三种提取液，标记为A、B、C。将三种提取液分别放入冰箱保存，做为后续实验样品。也因此做此实验时必须保证各个操作无误，及准确，以免影响后续实验的结果。 第二次是有关蔗糖酶的柱层析法，主要目的是要求同学掌握离子交换层析的原理及柱层析的操作技术及紫外吸收的分析方法。此次实验通过柱层析及紫外吸收法得到2~3管的活力最大的分离液合并为分离液D，放入冰箱作为后续实验样品。第三次实验为蔗糖酶的活力测定，目的为掌握酶的活力测定方法，了解各个酶的纯化情况。利用分光度计测出各个样品的OD值，再对照葡萄糖的标准曲线来得出剩余葡萄糖的含量，从而获得各个酶的活力大小，了解各个酶的纯化情况。并得出结论酶的纯化度越高，活力越小。 第四次实验为蔗糖酶蛋白质的含量测定，目的为掌握学习Folin-酚测定蛋白质含量的原理及方法，制备标准曲线测定未知样品中蛋白质含量。同样利用与标准曲线对照来得到试样的蛋白质含量，并测出酶的比活力。测量蛋白质的方法有多种，我们必须根据所做实验的具体选择合适的方法来测定蛋白质。 第五次的实验是微量凯氏定氮测总蛋白。目的是要求同学掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理及方法。本实验除利用了凯氏定氮法外还加上了酸式滴定法最后得出了毫克级别的总蛋白含量。其结果与上一实验所测得的总蛋白质含量有所不同，正证明了不同的方法测量蛋白质造成的误差不同，致所得结果不同。 最后一次实验为SDS-PAGE测定蛋白质分子质量，目的为掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和测定蛋白质分子量技术。此实验操作复杂，需先制作凝胶再结果染色脱色，最后还要制作标准蛋白分子质量曲线图来进行试样对照。最后得到蔗糖酶的分子量在5万左右及9万左右。 关键字：实验；提取液；比活；蛋白质；SDS-PAGE；OD 正文： 1，蔗糖酶的提取及提纯 1.1，文献综述：蔗糖酶的分离利用的是细胞破壁法。细胞破壁：就酶在生物体 内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶时，要 破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。 材料不同，破壁也方法不同。我们用的菌体（微生物）细胞破壁方法是：自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系 将细胞破坏，是细胞内物质释放出来。自溶时需加少量防腐剂，以防外界
α–淀粉酶活力测定
α–淀粉酶活力测定 ----目视碘比色法 一实验目的 1. 了解α–淀粉酶酶活力测定原理。 2．掌握α–淀粉酶酶活力测定的方法步骤。 二、实验原理 比色法作为一种定量分析的方法，是以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯比尔定律 (A＝kLC)为基础。 酶活力的大小、即酶量的多少用酶活力单位（U）（active unit）表示。1961年国际生物化学学会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”（IU）来表示酶的活力，规定为：在最适条件（25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位，即1IU = 1μmol /min。这样酶的含量就可用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶活力单位来表示（U/g或U/ml）。 淀粉（紫蓝色，30分子以上）红色糊精（红棕色，7-30分子）无色糊精（7分子以下）、麦芽糖不显色。通过测定酶促反应分解一定量淀粉的时间，以标准糊精（红色糊精）和碘反应的颜色作为终点指示（所给定的淀粉都已转化为糊精的时间）。 碘比色法酶活力规定：在60℃条件下，1小时转化1g 淀粉变为糊精的酶量定义为1个酶活力单位。 三、实验操作 1．取试管1支，加入1ml标准糊精和3ml 标准稀碘液。 2．取锥形瓶一个，加入2%淀粉20ml和Ph6.0的缓冲液5ml。
3．将锥形瓶置于60℃水浴中，保温5分钟。 4．在比色盘中加入比色碘液，每穴2滴。 5．在锥形瓶中加入淀粉酶溶液2 ml，摇匀，开始计时。 6．在反应的前4分钟，每隔1分钟从锥形瓶中取1滴液体，与比色稀碘液混合，而后，每隔30秒从锥形瓶中取1滴液体与稀碘液混合，直至呈色与终点色一致。 四、酶活性计算 实验注意事项： （1）测定酶促反应在锥形瓶中进行，标准反应在试管中进行。 （2）比色盘第1号位加入标准糊精和2滴标准碘液。 （3）应时间大约在10-15分钟。 （4）稀释倍数1250倍。
测定α-淀粉酶活力的方法
实验五激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响 一、目的要求通过实验加深对酶性质的认识，了解测定α-淀粉酶活力的方法。 二、实验原理 酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。酶催化的反应称为酶促反应。生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。 能提高酶活力的物质，称为激活剂。激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。 酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。同样，反应中某一PH范围内酶活力可达最高，在最适PH的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。 食品级α-淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉等微生物产生。但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。α-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称α-淀粉酶为液化淀粉酶。α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6键的寡糖。 本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于6个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪α-淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。 三、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响
大实验 酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究
大实验酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究 本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质作初步的研究。 一．实验原理及相关知识 （1）蔗糖酶的介绍 自1860年Bertholet从酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（invertase）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的 —呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。 （2）。实验原理： 本实验提取面包酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 两种酶的性质对照表如下： 实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖）的量或旋光法来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。 本实验共有以下分实验： 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定
关于蔗糖酶活性的研究 生物化学实验
对啤酒酵母的蔗糖酶的相关测试与研究 兰德新（同组：李建鑫） 浙江工业大学海洋学院食工1201 摘要： 目的学习测试与研究蔗糖酶的相关技术，以20克新鲜啤酒酵母菌为原料进行一系列实验。方法蔗糖酶的提取及初步提纯，蔗糖酶的纯化——Q Sepharose-柱层析法，蔗糖酶活力的测定，Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量测定及比活力计算，微量凯氏定氮法测蔗糖酶中总蛋白氮，SDS-PAGE测定蔗糖酶中蛋白质的相对分子质量。结果通过这一阶段性的综合实验，学会了提取及初步提纯酶及胞内酶的提纯，酶活力的测定方法，蛋白质的测定方法和蛋白质相对分子质量的测定方法。为我们将来的实验奠定了技术上的基础。 关键词：蔗糖酶，Q Sepharose-柱层析法，酶活力，Folin-酚法，微量凯氏定氮法，SDS-PAGE 文献综述: 蔗糖酶能催化水解蔗糖生成果糖和葡萄糖，果糖的甜度较高，约为蔗糖的1.36~1.60倍，在工业上具有较高的经济价值，葡萄糖也是我们的主要碳源，并且在植物中蔗糖酶分解的果糖和葡萄糖能为植物的生长和发育提供碳源和能源。因此人们对蔗糖酶的研究越来越多，做了很多的实验来研究蔗糖酶的性质[2] , 其中在“蔗糖酶水解蔗糖的研究”这篇文章中，作者通过一系列对比实验，得出蔗糖酶的几个性质如下：蔗糖酶的活性达1.575×105u/ml；其表观Km（米氏常数）值约为0.015mol/1；初速度反应时间为0~10min；最适酶量为3.152×103~7.88×103 u/mmol；最适底物浓度为0.5mol/l；最适pH在NaAc-HAc体系中为4.4；最适反应温度为50℃。 而在植物体中，蔗糖酶也起到不可代替的作用。在“蔗糖酶在植物中的生理作用”这篇文章中，作者主要介绍了蔗糖酶在植物体中的5个作用，分别是：1.参与叶片的光合作用 2. 参与贮藏器官碳水化合物组成中的作用 3. 参与细胞对胁迫的响应 4. 参与植物的生长发育 5. 在信号传导中的作用目前，对蔗糖酶的研究已取得了很大的进展，不仅分离、纯化了各种蔗糖酶，建立了活性