免疫学实验课件：实验三(2)琼脂免疫扩散实验
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琼脂免疫扩散实验
实验目的与要求
➢以牛血清白蛋白双向扩散试验为例，掌 握双向双扩散试验的原理、操作方法及 结果的判定。
实验原理：
➢ 双向双扩散试验是一种定型试验，可溶性抗原 与相应的抗体在琼脂凝胶中各自向四周扩散， 若抗原与抗体相对应，则在二者比例适当处形 成白色沉淀线;若抗原与抗体无关，则不会出 现沉淀线。
图4 抗原特异性与沉淀线形状的关系
▪ 2,相应抗原抗体所形成的沉淀线，如二者浓度相当，沉淀 线在孔中央，二者浓度不当时，则沉淀线偏向浓度低的一 侧
▪ 注意事项:
➢ 加样量பைடு நூலகம்定要精确，并且不同逸出孔外，否则 结果不好观察;
➢ 制板时，玻片要清洁，边缘要整齐，加琼脂糖 时要避免产生气泡;
➢ 打孔时注意避免产生裂缝或将琼脂与玻片脱离。
▪ 试剂与器材
➢1.2%的琼脂糖（用生理盐水配制） ➢已知抗原、待检血清、阳性血清、阴性
血清 ➢平皿或（载玻片）、酒精灯、湿盒、打
孔器、37℃恒温箱、移液器等。
操作方法
➢制板：趁热将已溶化琼脂糖倒入洁净的平板内或
（用注射器吸取3.5ml加热溶化的1.2%琼脂糖浇 注于一洁净的载玻片上，）厚度2.5-3.0mm，注 意勿产生气泡。
2）阴阳性检测：中央孔加抗原，外周孔分别加待检血清， 要设立阴性血清和阳性血清对照。
➢ 扩散:加样完毕后，将琼脂板放湿盒中，保持一定的湿度，
置37℃温箱中24h-48后，取出观察结果。
结果观察:
1、若凝胶中抗原、抗体是特异性的，则形成抗原抗 体复合物，在两孔之间出现清晰致密白色的沉淀线， 为阳性反应。若在72h仍未出现沉淀线则为阴性反应。
➢打孔：待琼脂板凝固后，用打孔器打孔，一般孔
径3-5mm，孔间距4-7mm（孔径和孔间距依不同 疫病检疫规程而定），根据需要，可打成梅花孔 （如下图所示，中央1孔，周围6孔），挑出孔内 琼脂。
➢ 封底:将琼脂板无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻灼烧，用手
背感觉微烫即可。
➢ 加样:
1）抗体效价测定：用移液器加样于中央孔加入已知抗原， 于周围孔加倍比稀释的血清，每个稀释度加一孔。加样时 勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。
2、抗体效价测定:以出现沉淀带的血清最高稀释倍数 为该血清的琼扩效价。
▪ 3、抗原特异性与沉淀线形状的关系:
1,根据抗原的成份可有以下三种现象:(1)若二孔中的抗原 相同，与相应抗体形成的沉淀线融合成弧形;(2)若二孔中 抗原不同，当抗血清中分别含有与抗原相应的抗体时，则 形成的沉淀线相交叉;(3)若两孔中抗原部分相同，抗血清 中有各相应的抗体，形成的沉淀线相切。
实验目的与要求
➢以牛血清白蛋白双向扩散试验为例，掌 握双向双扩散试验的原理、操作方法及 结果的判定。
实验原理：
➢ 双向双扩散试验是一种定型试验，可溶性抗原 与相应的抗体在琼脂凝胶中各自向四周扩散， 若抗原与抗体相对应，则在二者比例适当处形 成白色沉淀线;若抗原与抗体无关，则不会出 现沉淀线。
图4 抗原特异性与沉淀线形状的关系
▪ 2,相应抗原抗体所形成的沉淀线，如二者浓度相当，沉淀 线在孔中央，二者浓度不当时，则沉淀线偏向浓度低的一 侧
▪ 注意事项:
➢ 加样量பைடு நூலகம்定要精确，并且不同逸出孔外，否则 结果不好观察;
➢ 制板时，玻片要清洁，边缘要整齐，加琼脂糖 时要避免产生气泡;
➢ 打孔时注意避免产生裂缝或将琼脂与玻片脱离。
▪ 试剂与器材
➢1.2%的琼脂糖（用生理盐水配制） ➢已知抗原、待检血清、阳性血清、阴性
血清 ➢平皿或（载玻片）、酒精灯、湿盒、打
孔器、37℃恒温箱、移液器等。
操作方法
➢制板：趁热将已溶化琼脂糖倒入洁净的平板内或
（用注射器吸取3.5ml加热溶化的1.2%琼脂糖浇 注于一洁净的载玻片上，）厚度2.5-3.0mm，注 意勿产生气泡。
2）阴阳性检测：中央孔加抗原，外周孔分别加待检血清， 要设立阴性血清和阳性血清对照。
➢ 扩散:加样完毕后，将琼脂板放湿盒中，保持一定的湿度，
置37℃温箱中24h-48后，取出观察结果。
结果观察:
1、若凝胶中抗原、抗体是特异性的，则形成抗原抗 体复合物，在两孔之间出现清晰致密白色的沉淀线， 为阳性反应。若在72h仍未出现沉淀线则为阴性反应。
➢打孔：待琼脂板凝固后，用打孔器打孔，一般孔
径3-5mm，孔间距4-7mm（孔径和孔间距依不同 疫病检疫规程而定），根据需要，可打成梅花孔 （如下图所示，中央1孔，周围6孔），挑出孔内 琼脂。
➢ 封底:将琼脂板无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻灼烧，用手
背感觉微烫即可。
➢ 加样:
1）抗体效价测定：用移液器加样于中央孔加入已知抗原， 于周围孔加倍比稀释的血清，每个稀释度加一孔。加样时 勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。
2、抗体效价测定:以出现沉淀带的血清最高稀释倍数 为该血清的琼扩效价。
▪ 3、抗原特异性与沉淀线形状的关系:
1,根据抗原的成份可有以下三种现象:(1)若二孔中的抗原 相同，与相应抗体形成的沉淀线融合成弧形;(2)若二孔中 抗原不同，当抗血清中分别含有与抗原相应的抗体时，则 形成的沉淀线相交叉;(3)若两孔中抗原部分相同，抗血清 中有各相应的抗体，形成的沉淀线相切。