蛋白质相互作用(protein interaction)的研究方法

蛋白质相互作用的研究方法

万维松 2016-7-23

为什么要进行蛋白质研究？

（1）蛋白质是细胞的功能分子

（2）蛋白质表达水平受到诸多因素的调控

（3）DNA/RNA水平与蛋白质水平没有正相关性（4）DNA/RNA层面无法获知蛋白质翻译后修饰（5）蛋白质是药物治疗的重要靶位

（6）蛋白质研究是后基因组时代的终极目标

为什么要研究蛋白质的相互作用？

蛋白质控制了细胞中的所有生物系统，但是，通常它们不是“单

打独斗”，绝大多数蛋白质会与其他蛋白质相互作用，一起参与

生命过程。

蛋白相互作用有哪些类型？

◆稳定相互作用（ Stable interactions ）

指那些通常以多亚基复合物（ multi-subunit complexes ）纯化得到的相互作用蛋白，这些亚基可以是相同的，也可以是不同的。

Eg:血红蛋白（αβ）；核心RNA聚合酶（α2ββ’ ）

◆瞬态相互作用（ Transient interactions ）

被认为控制了主要的细胞过程，它们的相互作用是暂时的，并需要一定的条件来促进相互作用，如甲基化、磷酸化、构象改变等。

瞬态相互作用可强可弱，可快可慢。

蛋白相互作用的研究方法

◆In Vivo 体内方法

◆In Vitro 体外方法

◆In Silico 生物信息学方法

常用研究技术

Method Interactions type Property Adhibition Co-IP Stable or strong 内源筛选互作蛋白Pull-Down Assay Stable or strong 外源筛选互作蛋白TAP Stable or strong 标签筛选互作蛋白SILAC-PAP Stable or strong 标签筛选互作蛋白

BioID Transient 、weak or

insoluble 内源筛选互作蛋白

Far-Western Blot

Analysis

Moderately stable 外源验证互作蛋白IP Stable or strong 内源验证互作蛋白BiFc Transient or weak 内源验证互作蛋白

IP/Co-IP(内源)

IP/Co-IP (内源)

Endogenously expressed FBXW7 and HSF1 interact.

(a ) Native FBXW7 was immunoprecipitated (IP) from cell extracts with anti-FBXW7 antibody , followed by immunoblotting as indicated.

Rabbit IgG was used as control. Arrow indicates FBXW7 in input.

Bait

Interacting protein

GST Poly His

IP、Co-IP and Pull-Down比较

AP(标签)

◆AP：Affinity Purification

◆TAP：Tandem Affinity Purification ◆PAP：Parallel Affinity Purification

TAP (Flag-SBP/HA)

◆TAP是Co-IP的“近亲”，两者在寻找诱饵蛋白的互作蛋

白以及纯化互作蛋白的原理类似。

◆TAP引入了2个纯化标签（Flag，SBP或HA），经过2步纯

化，能有效纯化裂解液中的靶蛋白及其复合物，并使非特

异性蛋白的数量降至较低水平。

◆实验组和对照组洗脱的蛋白分别做质谱，从实验组结果

中扣除对照组中的蛋白，即可鉴定出与Bait互作的蛋白。

技术优势：

1、TAP/MS鉴定到的互作蛋白是细胞内与诱饵蛋白天

然互作的，符合体内真实生理情况，可信度高。

2、采用两步纯化，能有效减少非特异蛋白的结合。

SILAC+PAP+MS

与Co-IP、Pull down相比，

SILAC-PAP有以下优势：

◆特异性强,假阳性极低；

◆高通量，液质连用，能最大限度

的寻找到相互作用的蛋白质；

◆灵敏度高；

◆能直接检测出与bait蛋白互作的

其它蛋白的相对含量。

邻近蛋白标记-BioID

◆BirA*是生物素连接酶BirA的一种突变体；

◆具有捕获生物素标记邻近蛋白的能力，

而不管是直接还是间接相互作用甚至仅仅

是距离很近的被标记蛋白。

应用：

◆已经被成功地运用到研究哺乳动物细胞

和单细胞原核生物的各种各样的蛋白中；

◆特别适用于研究不易溶解或者很难得到

的亚细胞结构蛋白；

◆能够检测弱的，瞬时的蛋白相互作用。

Far-Western Blotting Bait protein

Tag bait protein

Biotinylated bait peotein

Far-WB vs WB

BiFC

Protein A Protein B

谢谢！