蛋白质相互作用(protein interaction)的研究方法
蛋白互作研究方法PPT课件
2) MbSUS 体系
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mbSUS 原理
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In vivo cloning into mbSUS vectors
GATEWAY cloning method
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P = Prey Protein, M = MagneG最S新T.课P件article.
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5 免疫共沉淀Co-IP
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6 Far-western analysis
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7 双分子荧光互补技术 BiFC
双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC) 分析技术，利用绿色荧光 蛋白(green fluorescent protein，GFP) 及其突变体 (YFP,CFP,BFP)的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割 成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋 白连接. 如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近， 就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近， 重新形成活性的荧光基团而发出荧光. 在荧光显微镜 下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用， 并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互 作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体 的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等， 这些信息对研究蛋白质相最互新课作件 用有一定意义。 38
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蛋白质相互作用网络的构建和分析
蛋白质相互作用网络的构建和分析蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）是生物学研究中的一个重要方向，因为它涉及到了复杂的生物过程中蛋白质之间的相互作用、信号传递、代谢途径、疾病机理等多个层面。
为了研究这些生物过程，如何构建和分析蛋白质相互作用网络是非常关键的。
一、蛋白质相互作用网络的构建蛋白质相互作用网络是指蛋白质之间相互作用关系在网络上的表示形式，其中每个蛋白质被表示为一个节点，蛋白质之间的相互作用边被表示为连接这些节点的线条。
根据所研究的生物体系不同，蛋白质相互作用网络可以包括单个细胞、组织器官、生物种群等范围内的蛋白质相互作用。
构建蛋白质相互作用网络的基本方法是高通量筛选技术，其中最常用的是酵母双杂交技术（yeast two-hybrid, Y2H）。
在Y2H中，把感兴趣的两个蛋白质编码序列分别与两种活化因子（activator）域构建的载体进行重组，形成“诱饵”（bait）和“猎物”（prey），然后将它们合并在一起，如果诱饵和猎物之间存在相互作用，就可以激活活化因子域，从而驱动报告基因（reporter gene）表达。
除了Y2H之外，还有一些其他的高通量筛选技术可以构建蛋白质相互作用网络，如质谱光谱法（mass spectrometry, MS）和蛋白质芯片技术（protein microarray）。
这些技术各自有其优缺点，在应用时需要根据实际情况进行选择。
二、蛋白质相互作用网络的分析构建蛋白质相互作用网络之后，需要对其进行分析，以探究其中蕴含的信息和潜在的功能模块。
下面介绍几种常用的蛋白质相互作用网络分析方法。
1. 网络基本参数分析网络基本参数分析是指对蛋白质相互作用网络的节点数、边数、度分布、聚类系数等基本参数进行分析。
这些参数可以反映网络的规模、复杂度和模块化程度等特征，有助于揭示网络的整体结构和特性。
2. 网络模块识别网络模块是指蛋白质相互作用网络中密集连接的节点集合。
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上寒风凛冽，又到了一年一度写标书的季节，你开始准备了么？在分子机制的研究中，蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了，研究蛋白互作的方法有很多，今天我们来介绍九种。
1、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）CoIP其实就是两个蛋白相互的IP（免疫沉淀反应）实验，在已知蛋白B和C之间有相互作用的前提下，这种前提一般需要有一个酵母双杂实验或者Pulldown实验来作为支持。
IP就是用来验证蛋白C和蛋白B之间相互作用的。
如果在Agarose珠上的Protean A/G所结合的抗体，可以结合并拉下蛋白B，那用Western Blot即可检测出蛋白C的表达，反之亦然，通过这种相互间免疫共沉淀的实验，就可以明确地验证出，B与C之间的相互作用了。
比如这份标书：PYK2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin？（百度检索题目可查到全文）2、Pull-down实验这个实验跟免疫共沉淀实验很像，不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的，在众多的蛋白里，拉住A蛋白的同时,把B蛋白也给拉出来了，这还不能证明是直接的结合，很有可能是A 拉住了C，而C拉住了B，这样拉住A蛋白的同时也能把B蛋白也给拉出来。
要证明直接的结合就是Pull-down实验。
提纯所要研究的两个蛋白（一般是在BL21等菌种表达提纯），这两个蛋白带上不同的标签（提纯蛋白一般带GST或者HIIS标签），然后将他们放在同一个体系里，使用GST-beads或者NI-beads,把其中一个蛋白拉下来，用WB检测另一个蛋白的存在。
比如这份标书：恶性肿瘤的发生、发展的细胞表观遗传学机制。
（同样可以百度检索到全文）3、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）——共定位将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。
蛋白质-适配体相互作用预测的方法
蛋白质-适配体相互作用预测的方法蛋白质-适配体相互作用（protein-ligand interaction，PLI）预测是药物研发、酶学和生物信息学等领域的重要研究方向。
准确预测PLI的方法对于发现新药物、设计蛋白质工程和预测蛋白质功能等都有重要意义。
本文将介绍常用的PLI预测方法，并对其适用性和局限性进行评估。
1. 分子对接（molecular docking）分子对接是指在计算机模拟系统中，预测蛋白质-配体复合物的稳定几何结构和互作模式的方法。
分子对接具有高效、精度高、可快速预测PLI的优点。
但其也有明显局限性，如无法预测蛋白质和配体的构象变化、局部柔性等导致的复合物的柔性和动态性的影响。
此外，由于诸如溶剂、电荷、热力学影响等原因，该方法容易出现误差。
2. 分子动力学模拟（molecular dynamics simulation，MD）分子动力学模拟是通过对分子的力场进行数值计算，以预测其动力学行为和结构演化。
与分子对接方法不同的是，MD可以对蛋白质-配体复合物中的构象变化、柔性、动态变化等进行准确预测。
但其也有着计算时间长、计算资源等方面上的局限性。
同时，由于受计算负荷所限，目前大多数MD模拟只能模拟比较短的时间范围，难以纳入宏观环境等影响因素。
分子力学和量子力学计算分别用于计算分子内部的能量和分子间的相互作用，然后模拟蛋白质-配体复合物的稳定能量等参数。
该方法的优点是可以更准确的预测PLI的稳定性和结构，但其也需要大量的计算资源和高质量的X光晶体学图像等，所以需要高度专业化的技术人员。
4. 机器学习方法（machine learning，ML）机器学习方法是指利用大量实验数据、算法模型和计算技术，在无需先验知识的情况下，通过学习历史数据及其预测的准确性等指标，从而逐步优化预测模型提高其预测准确性。
得益于其高效、快速的优点，近年来机器学习方法成为预测PLI的热门工具。
该方法目前已经被广泛应用于药物发现、分子设计、疾病诊断等领域。
蛋白质相互作用研究方法
应用
一、阳性: 人为转染重组体 artificial 验证实验:进一步验证实验证明其在生理情 况下是否真的有作用。
二.确定参与结合作用的 domain 或 motif
• Ade+ Expresses the ADE2 reporter gene; i.e., does not require Ade in the medium to grow.
• His+ Expresses the HIS3 reporter gene; i.e., does not require His in the medium to grow.
共聚焦显微镜法 • 也可同时进行核染色
Fig.21 Cellular localization of HPO and JAB1. COS 7 cells were tranfected with GFP-HPO or RFP-JAB1 constructs, respectively. The nuclei were stained by Hoechst 33342 (blue). All cell samples were visualized by confocal microscopy (Leica).
UASs, upstream activating sequences AD, activating domain BD, binding domain
• AD/library: A fusion of the GAL4 AD with a library cDNA/protein.
• DNA-BD/bait: A fusion of the GAL4 DNABD with a bait cDNA/protein.
Co-Immunoprecipitation (coIP)
蛋白质相互作用技术
蛋白质相互作用技术
蛋白质相互作用（Protein-protein interaction, PPI）技术是
指通过实验方法或计算模拟预测等手段，研究蛋白质在细胞内部和外
部相互作用的过程，以揭示蛋白质功能及其参与的复合体的组成成分、结构、拓扑和相互作用机制等方面的信息。
PPI技术通常包括两大类：基于实验的技术和基于计算的技术。
基
于实验的技术主要包括：
1.双杂交技术：利用酵母双杂交或其他物质进行蛋白质相互作用
的检测。
2.共沉淀技术：利用蛋白质之间的亲和吸附或非共价结合特性，
进行蛋白质的共沉淀和筛选。
3.表面等离子体共振（SPR）技术：通过检测蛋白质在银-金表面
上的反射光所引起的曲线变化，来确定蛋白质相互作用的强度和亲和力。
4.分子光子学技术：包括荧光共振能量转移（FRET）和荧光标记
生物分子的单分子技术等，可以用来研究蛋白质相互作用和配体的特征，以及蛋白质复合物的功能。
基于计算的技术主要包括：
1.蛋白质结构预测技术：通过模拟计算或分子动力学模拟等方法，预测蛋白质的三维结构，以及蛋白质之间的相互作用模式。
2.蛋白质相互作用网络构建技术：利用基因芯片或大规模质谱技术等，从细胞内部的相互作用过程中提取大量的蛋白质之间的关系，构建蛋白质相互作用网络图。
3.分子对接技术：利用分子对接算法，对蛋白质复合物的空间排列结构进行分析和预测。
总的来说，蛋白质相互作用技术是生物科学和医学领域研究的重要手段，可以帮助我们深入地了解蛋白质之间的相互关系，从而为相关药物研发和治疗策略的制定提供重要的参考依据。
蛋白质相互作用的研究方法_陈谋通
生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法·2009年第1期收稿日期：2008-08-18基金项目：国家自然科学基金资助项目（30571557）作者简介：陈谋通（1984-），男，硕士研究生，专业方向：微生物学；E -mail ：chen.moutong@ 通讯作者：刘建军，女，研究员，E -mail ：junii8@2003年4月，人类基因组测序的完成标志着一个新的生物学研究时代———后基因组时代（post -genomic era ）的来临。
各种各样的真核生物完整基因组序列的获得，为生物医学研究从“一基因一酶假说”方法变更到在基因组或者泛蛋白质组水平上分析基因或者蛋白质的策略奠定了基础。
全基因组的序列信息并不足以解释及推测细胞的各种生命活动现象，蛋白质才是细胞活性及功能的最终执行者，蛋白质-蛋白质之间的相互作用是蛋白质发挥功能的重要途径。
后基因时代的难题在于通过绘制组成型蛋白质图谱和蛋白质相互作用的动力学研究来测定细胞内蛋白质补体即蛋白质组如何组织成为功能性、高级有序的网络、以及构成细胞的所有组成蛋白有多少，它们复杂的动态相互作用关系如何调节等，这些问题的解决才能最终阐明细胞中各种生命活动的机制。
生物体内各种生命信息由不同的基因经转录、翻译传递到相应的蛋白质上并使其具有各自的生化特性及生物学活性；但每个蛋白质并不是独立的在细胞中完成被赋予的功能，通常与其它蛋白质相蛋白质相互作用的研究方法陈谋通刘建军（深圳市疾病预防控制中心，深圳518020）摘要：随着基因组测序工程数量的增加，未知功能蛋白质测序工作也呈现指数式增长。
生物学进程主要是由蛋白质执行和控制的，因此，阐明未知或已知蛋白质的生物学功能和从细胞水平上确定细胞机制，已成为蛋白质组学研究的主要目标。
目前，随着酵母[1]、果蝇[2]、线虫[3]相互作用图谱的相继完成，蛋白质相互作用研究方法也不断发展和完善。
蛋白质-适配体相互作用预测的方法
蛋白质-适配体相互作用预测的方法蛋白质-适配体相互作用（protein-ligand interaction）是指蛋白质与小分子化合物之间的结合。
这种相互作用在生物医学研究和药物发现中起着重要的作用，因为许多药物的作用机制是通过与蛋白质结合来实现的。
预测蛋白质-适配体相互作用对于药物研发和设计具有重要意义。
目前，有许多方法可以用于预测蛋白质-适配体相互作用，下面将介绍其中一些常用的方法。
1. 分子对接（Molecular Docking）分子对接是通过计算机模拟方法预测蛋白质与小分子化合物之间的结合模式和结合能。
这种方法通过搜索可能的结合构象，并根据得分函数评估每个结合构象的优劣，从而找到最可能的结合模式。
分子对接方法有许多种，包括基于基于力场的方法、基于机器学习的方法和基于结构的方法等。
2. 虚拟筛选（Virtual Screening）虚拟筛选是一种高通量计算方法，用于从大量化合物中筛选出有潜力的药物候选物。
虚拟筛选可以分为结构基/基于构象的筛选和基于药物特征的筛选。
结构基/基于构象的筛选利用蛋白质和化合物的结构信息进行筛选，例如通过分子对接预测蛋白质和化合物之间的结合能。
基于药物特征的筛选则是通过计算化合物的物理化学性质和药物特征来评估其活性。
3. 机器学习方法（Machine Learning）机器学习是一种通过从已有数据中学习模式来预测新数据的方法。
在蛋白质-适配体相互作用的预测中，机器学习可以利用已有的蛋白质-适配体结合数据，通过训练模型来预测新的蛋白质-适配体结合关系。
机器学习方法具有高通量和快速的优势，可以在较短的时间内生成预测结果。
4. 综合方法（Integrative approaches）综合方法是将多种方法和数据进行整合，以提高蛋白质-适配体相互作用的预测准确性和可靠性。
综合方法可以结合分子对接方法、机器学习方法和结构生物学方法等，利用多种信息源来预测蛋白质-适配体的相互作用。
蛋白质相互作用多种方法
串联亲和纯化（ TAP）
近年来质谱技术发展迅速，其功能强大且灵敏 度高，常用来鉴定相互作用的蛋白质复合体或复合 体亚基 ，但通常难以获得足够量纯化的蛋白质复 合体，成为质谱在这方面应用的一个限速步骤。 1999年Rigaut （德国）等人共同提出了一套分离 复合蛋白的新方法—串联亲和纯化(Tandem affinity purification，TAP)，兼具标准亲和纯化 （可以得到高纯度地拷贝数的蛋白质复合体）和免 疫共沉淀（用于特异性的标记蛋白与亲和柱之间的 相互作用）两种生化方法的优点，为蛋白质复合体 的分离鉴定提供了一条新路径。
GST-Pull down Assay
右：对照， 中间翻转混 合时发生相 互作用，胶 上只与GST 融合蛋白结 合而不与 GST结合的 特异性条带 表示新的相 互作用蛋白。
GST pull down
GST Fusion Protein Purification
binding
wash
elution
TAP缺点
更倾向于高丰度和稳定的相互作用，许多低亲和力、瞬 时和依赖特殊细胞环境的相互作用可能检测不到。 另外，TAP必须采用能产生表达TAP标签的蛋白，这种 标签蛋白的表达最好接近生理水平，所以最好将带标签 的基因用天然启动子表达。但在哺乳动物细胞中，天然 启动子表达标签蛋白是非常困难的，其表达水平不同于 无标签的内源蛋白，由非生理水平的诱饵蛋白而产生假 阳性。
优点： 1、相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的， 处于天然状态； 2、蛋白的相互作用是在自然状态下进行的， 可以避免人为的影响； 3、可以分离得到天然状态的相互作用蛋白 复合物。
缺点： 1、可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白 质相互作用； 2、两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能 有第三者在中间起桥梁作用； 3、如用western blot检验，必须在实验前预测目的 蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不 正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性， 灵敏度不如亲和色谱高。
蛋白质相互作用研究方法
•免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)
•双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence
complementation, BiFC)
•荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy
transfer, FRET)
荧光共振能量转移(FRET)
BD
UAS
AD
lacZ
两种待检测蛋白(X、Y)分别和AD、BD 融合表达, X与Y之间的相互 作用就可以将BD和AD在空间结构上重新联结为一个整体而与报告 基因的上游激活序列（upstream activation sequence）结合，进 而发挥激活转录的功能，使受调控的报告基因得到表达。
UAS
且易出现假阴性。
谢 谢
•免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)
•双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence
complementation, BiFC)
•荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy
transfer, FRET)
免疫共沉淀
两种蛋白在细胞内发生相互 作用时会形成两种蛋白的复 合物，这样就可以先用一种 蛋白的抗体把免疫复合物沉 淀下来，然后用另一种蛋白 的抗体进行Western blotting 检测。
免疫共沉淀
优点：可以保留蛋白质的修饰和结合状态，同时所需
的样本量较少,实验成本较低，减少了纯化步骤，能检
测到瞬时和较弱的蛋白相互作用； 缺点：Co-IP特异性较低，洗脱混合物中往往含有较多 的非特异结合蛋白。 因此，Co-IP 检测到的潜在相互作用蛋白需要通 过BiFC、FRET 等其他方法进一步验证。
蛋白质互作网络的构建和分析方法
蛋白质互作网络的构建和分析方法蛋白质互作网络（protein-protein interaction network）是由许多蛋白质分子在细胞内通过直接或间接相互作用而组成的复杂网络。
分析蛋白质互作网络可以揭示蛋白质相互作用的模式和特征，为深入研究生命科学和疾病发生机制提供重要的理论基础。
本文将介绍蛋白质互作网络的构建和分析方法，旨在帮助研究者深入了解这一领域的技术应用。
蛋白质互作网络的构建方法蛋白质互作网络的构建方法主要包括两种：实验法和计算法。
实验法是通过生化实验手段探究蛋白质之间相互作用的过程，进行互作数据的获取，最终获得互作网络图。
实验法的方法多种多样，根据实验方式的不同可分为分子遗传学、蛋白质芯片、蛋白质亲和层析法等。
其中蛋白质亲和层析法是最常用的实验法之一。
通过蛋白质亲和层析法，可将互作蛋白纯化，然后用质谱仪分析出被纯化蛋白质及其互作蛋白质。
分析后得到的互作数据可构建出蛋白质互作网络。
计算法是根据已有的蛋白质序列信息推断蛋白质之间的相互作用，计算蛋白质互作网络结果。
计算法的方法包括结构预测、演化比较、文献调查、人工智能等。
结构预测法通过模拟蛋白质结构，利用分子动力学模拟、蒙特卡罗模拟等方法，推断蛋白质之间的可能互作。
演化比较法利用多序列比对和进化模型的方法，推断蛋白质之间的共同进化程度，从而得到蛋白质互作网络。
文献调查法则是通过对已有文献数据的轮询和分析，挖掘出蛋白质互作关系。
人工智能法主要是通过机器学习算法分析蛋白质序列之间的关联，实现蛋白质互作网络的预测。
蛋白质互作网络的分析方法蛋白质互作网络是一张复杂的图，其分析方法主要包括结构分析、拓扑分析、社区发现、功能分析等。
结构分析是分析网络构建的根本，主要研究网络节点和边数量、分簇系数、小世界性、无标度性等指标。
其中分簇系数是指某节点邻居之间外部链接数和邻居之间连接数之比，用于表示网络中的子群结构。
小世界性则是指网络中不同区域之间的相互联系。
蛋白质交互作用网络分析
蛋白质交互作用网络分析蛋白质是细胞中重要的基本结构和功能分子，它们通过相互作用来完成细胞内的诸多生命活动。
蛋白质交互作用网络分析就是研究蛋白质相互作用的一种手段。
本文将介绍蛋白质交互作用网络分析的基本概念、意义以及分析方法。
一、蛋白质交互作用网络分析的基本概念蛋白质交互作用网络分析（Protein-protein interaction network analysis，简称PPI网络分析）是指通过实验和计算手段来鉴定蛋白质之间的相互作用，并将它们构建成网络模型，分析这个网络模型的拓扑结构和功能模块，以揭示蛋白质网络的特性和调控机制。
PPI网络中，蛋白质可以看作是网络中的节点，它们之间的相互作用关系则是节点之间的连边。
PPI网络分析的方法包括实验方法和计算方法，其中实验方法主要包括酵母双杂交、质谱分析、定量蛋白组学技术等；计算方法主要包括基于拓扑结构的方法、基于机器学习的方法等。
二、蛋白质交互作用网络分析的意义蛋白质交互作用网络分析是研究蛋白质功能和调控机制的重要方法之一。
通过分析PPI网络的结构和功能，可以揭示蛋白质相互作用关系的特点、蛋白质网络的功能模块、蛋白质网络的演化过程等。
同时，PPI网络分析还可以用来研究疾病的发病机制和药物的作用机理。
例如，肿瘤细胞具有与正常细胞不同的PPI网络结构，通过分析癌细胞的PPI网络结构可以揭示肿瘤细胞的发病机制，并为癌症的治疗提供新的思路和方法。
三、蛋白质交互作用网络分析的方法蛋白质交互作用网络分析的方法主要包括实验方法和计算方法两种。
实验方法主要包括酵母双杂交、质谱分析、定量蛋白组学技术等。
酵母双杂交是最常用的PPI鉴定方法之一，它的基本原理是利用酵母细胞的自由生长状态来检测蛋白质之间的相互作用。
质谱分析是利用质谱技术鉴定蛋白质之间的相互作用，这种方法可以用来鉴定PPI网络中大分子复合物和低亲和力的相互作用。
定量蛋白组学技术则是利用质谱技术来鉴定和定量蛋白质，以及其在蛋白质网络中的相互作用。
蛋白质的相互作用研究方法课件.ppt
四、Bimolecular Fluorescent Complementation
蛋白质的相互作用研究方法课件
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五、Yeast Two－Hybrid Systerm
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1.原理 酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真
蛋白质的相互作用研究方法课件
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2008年诺贝尔化学奖
蛋白质的相互作用研究方法课件
GFP主要应用: • 对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察
可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过 程中或外界刺激因子的作用下的时空表达, 如某种转录因 子的核转位、蛋白激酶C的膜转位等。
GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察 该分泌蛋白分泌到细胞外的过程
GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能 显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞 器的结构及病理过程。
膜蛋白的移动 （Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP ） • 蛋白之间的相互作用（FRET） • 报告分子 将GFP的基因连在特殊的启动子的后面，可以检 测基因表达的时间和部位。
容易检测 分子量小
Douglas Prasher was the 不需要其它底物
first person to realize the potential of GFP as a tracer molecule.
Douglas Prasher 1992 克隆了GFP基 因
蛋白质的相互作用研究方法课件
核基因转录调控中建立。 典型的真核生长转录因子， 如GAL4、GCN4、
研究蛋白质相互作用的技术
研究蛋白质相互作用的技术蛋白质相互作用是生命体系中非常重要的一环，对于理解细胞的生物学功能、疾病的发生和治疗等具有重要的意义。
随着科技的发展和创新，研究蛋白质相互作用的技术也在不断地更新和完善。
本文将介绍一些目前常用的蛋白质相互作用研究技术，并探讨它们的优缺点以及在科学研究中的应用。
1. 酵母双杂交技术酵母双杂交技术是最早用于蛋白质相互作用研究的技术之一。
通过将目标蛋白质与酵母双杂交体系中的另一个蛋白质进行融合，可以检测它们是否发生相互作用。
该技术的优点在于操作简单，对大规模筛选具有较高的效率。
酵母双杂交技术也存在一些局限性，例如在体内可能并不真实反映蛋白质相互作用的情况，以及可能存在假阳性和假阴性结果。
2. 共免疫共沉淀技术共免疫共沉淀技术利用抗体对蛋白质进行特异性结合，然后通过沉淀来寻找蛋白质之间的相互作用。
这项技术可以在原核细胞和真核细胞中进行，能够检测细胞内、细胞间以及细胞外的蛋白质相互作用。
但是该技术也存在一些局限性，比如需要高质量的特异性抗体、较长时间和较高技术要求等。
3. 质谱联用技术质谱联用技术已成为蛋白质相互作用研究的重要手段之一。
例如蛋白质质谱分析技术（Protein-Protein Interaction Mass Spectrometry，PPI-MS）能够对蛋白质的相互作用进行高通量分析。
通过将免疫沉淀后的蛋白质进行质谱分析，可以鉴定蛋白质相互作用的配体。
质谱联用技术的优势在于高灵敏度、高特异性和高通量性，但需要高质量的蛋白质组学数据。
4. 荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）是一种基于蛋白质间距离的技术，通过激发体系中的一个荧光蛋白（供体）来激发接受体系中的另一个荧光蛋白，从而检测蛋白质之间的相互作用。
该技术具有实时性、高灵敏度和高分辨率的特点，但也存在由于受到光源、色素、环境等外界因素影响的缺点。
蛋白质相互作用网络的构建及分析方法研究
蛋白质相互作用网络的构建及分析方法研究蛋白质是生物体内最基本的分子，蛋白质分子的功能与结构密不可分。
蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）是蛋白质功能的关键，探究PPI网络的构成及其特点对于理解蛋白质分子的基本功能机理具有重要意义。
因此，对于PPI网络的构建及分析方法的研究已经成为了生命科学中的一个热点研究领域。
一、蛋白质相互作用的检测方法在实验上，通常利用生物分子亲和层析法、荧光共振能量转移法、酵母双杂交法等技术来检测蛋白质相互作用事件。
其中，荧光能量转移技术是较为常用的方法之一。
荧光能量转移技术，即FRET技术（Fluorescence Resonance Energy Transfer），基于荧光原理。
其过程是：当一个荧光分子（受体）的激发状态与另一个相邻的、较远处的荧光分子（供体）的振动状态相互吻合时，后者会将能量传递给前者，致使前者的荧光发射猝灭，从而提供了一种检测分子间距离的手段。
利用FRET技术，可以将荧光蛋白作为信号标记，用以标记检测蛋白质，以此来判断蛋白质间的相互作用。
二、蛋白质相互作用网络的构建随着计算机技术和基因组学的迅速发展，从基因组水平探究蛋白质相互作用的研究方法取得了巨大突破。
目前，已经有许多自动化的蛋白质相互作用检测系统，而这些系统一般将检测到的数据存储在大规模的数据库中。
这些数据库不仅存储了蛋白质相互作用的实验数据，还包括了蛋白质组学的其他相关数据，如基因网络、表达数据、信号通路等。
对于数据库中的数据，需要进行预处理来构建PPI网络。
首先，需要去除重复数据、低置信度的数据和无相关信息的数据。
其次，需要建立PPI网络中节点之间的连接关系，即将相互作用的蛋白质之间进行边的连接。
然后，通过如Cytoscape等软件进行可视化，可以展示PPI网络的拓扑结构，以及各个节点之间的相互作用关系。
三、蛋白质相互作用网络的分析方法1. 中心性分析中心性分析是PPI网络中最为常用的方法，它描述了网络中每个节点在网络中所占据的中心位置。
蛋白质与蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction, PPI)研究方法概述
蛋白质与蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）研究方法概述目前检验蛋白质之间相互作用的实验方法主要有：酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）、噬菌体展示技术（Phage display）、串联亲和纯化-质谱（Tandem affinity purification-mass spectrometry, TAP-MS）以及GST pull-down。
其原理与适用范围如下：（1）酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）实验原理：双杂交系统的建立基于对真核生物调控转录起始过程的认识。
细胞起始基因转录需要有转录激活因子的参与，转录激活因子在结构上是组件式的，即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域（binding domain，简称为BD）和转录激活结构域（activation domain，简称为AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。
在酵母双杂交系统中，“诱饵”蛋白X（也就是已知的蛋白）克隆至DNA-BD载体中，表达DNA-BD/X融合蛋白；待测试蛋白Y克隆至AD载体中，表达AD/Y融合蛋白。
一旦X与Y蛋白间有相互作用，则DNA-BD和AD也随之被牵拉靠近，恢复行使功能，激活报告重组体中基因的表达。
图解：说明：其中，UAS即upstream activating sequence，上游激活序列。
适用范围：已知一种蛋白X，在体内（in vivo）筛选与其相互作用的蛋白，但前体是需预备一批可能与已知蛋白X相互作用的蛋白Y。
（2）噬菌体展示技术（Phage display）实验原理：将编码多肽的外源DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合后，以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性，导入了各种各样外源基因的一群噬菌体，就构成一个展示各种各样外源肽的噬菌体展示库。
蛋白质相互作用的研究方法
蛋白质相互作用的研究方法蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）研究方法可以分为生化方法、细胞生物学方法、生物物理化学方法和计算方法等多个方面。
以下将详细介绍几种常用的研究方法。
1. 酵母双杂交法（Yeast Two-Hybrid, Y2H）酵母双杂交法是一种广泛应用的PPI研究方法。
该方法利用酵母细胞中两个蛋白质结合后的活性报告基因表达，从而实现对蛋白质相互作用的筛选和鉴定。
该方法的优点是操作简单、高通量性能强，但也存在一些局限性，如可能存在假阳性结果和只能检测胞内相互作用。
2. 免疫共沉淀法（Immunoprecipitation, IP）免疫共沉淀法是一种常用的生化方法，用于鉴定蛋白质相互作用。
该方法基于抗体的特异性，将靶蛋白及其结合蛋白共同沉淀下来，通过蛋白质分析技术（如质谱分析）鉴定共沉淀的蛋白质。
该方法适用于研究细胞内和细胞间的蛋白质相互作用，但需要针对每个靶蛋白制备特异性抗体。
3. 原位近距离显微镜法（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）FRET是一种用于研究蛋白质相互作用的生物物理化学方法。
该方法通过将两个蛋白质分别与一对荧光染料标记，根据能量转移来检测蛋白质间的相互作用。
FRET可以在活细胞和组织中进行，具有高时空分辨率，但需要合适的显微镜设备和特定的染色体系。
4. 表面等离子体共振传感器法（Surface Plasmon Resonance, SPR）SPR是一种用于检测蛋白质相互作用的生物物理化学方法。
该方法通过检测表面等离子体共振信号的变化来定量分析蛋白质间的结合动力学和亲和性。
SPR具有高灵敏度和实时监测能力，可用于定量研究蛋白质相互作用，但需要具备专业的设备和表面修饰技术。
5. 结构生物学方法结构生物学方法包括X射线晶体学、核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）和电子显微镜（Electron Microscopy, EM）等。
第十一章蛋白质的相互作用（Protein-ProteinInteractions）
第⼗⼀章蛋⽩质的相互作⽤（Protein-ProteinInteractions）第⼗⼀章蛋⽩质的相互作⽤(Protein-Protein Interactions)1. 概况随着⼈类基因组测序⼯作的完成，⽣命科学进⼊到后基因组和蛋⽩组的时代。
因此，蛋⽩质的相互作⽤研究就显得越来越重要。
⽣命活动过程与蛋⽩质的相互作⽤是密不可分的，如DNA合成、基因转录激活、蛋⽩质翻译、细胞周期调控、信号转导等重要的⽣命过程均涉及到蛋⽩质复合体的作⽤。
下⾯以Wnt 信号通路为例对此加以说明。
Wnt信号通路是⼀条保守性很强的信号通路，该通路调节控制许多的⽣命过程，如细胞形态与功能的分化及维持、免疫、应激、细胞癌变与凋亡等等。
Wnt信号通路的作⽤分⼦包括：Wnt蛋⽩家族成员、卷曲(frizzled) 蛋⽩、Dishevelled蛋⽩、β-联蛋⽩(β-catenin)、轴蛋⽩(axin)、结肠癌抑制因⼦(APC)、糖原合酶激酶(GSK3β)、β-TrCP蛋⽩、淋巴增强因⼦(LEF)/T细胞因⼦(TCF) 等。
当没有Wnt信号时，GSK3β、APC、axin组成破坏复合体，使β-联蛋⽩被磷酸化，最终泛肽化⽽降解。
细胞核内，转录抑制因⼦Groucho家族成员与转录因⼦TCF形成复合物，通过HMG框结合在靶基因上，抑制靶基因的转录。
当有Wnt信号传⼊时，通路中的下游分⼦Dsh抑制了破坏复合体的作⽤，β-联蛋⽩在胞质中积累进⼊核内，TCF与⼊核的β-联蛋⽩结合，导致其与Groucho的结合下降，从⽽去除抑制作⽤，激活了靶基因的转录。
从上⾯可以看出，蛋⽩质的相互作⽤包括三个⽅⾯：⑴多亚基蛋⽩质的形成：即分离纯化后可形成两个或多个不同蛋⽩质，如⾎红素、⾊氨酸合成酶、⼤肠杆菌DNA合成复合酶等。
⑵多成分的蛋⽩质相互作⽤，如核孔复合体、剪接体、纺锤体等。
⑶瞬时的蛋⽩质相互作⽤，控制着⼀些重要的⽣命活动。
所有的蛋⽩质修饰过程都需要这类相互作⽤。
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蛋白质相互作用的研究方法
万维松 2016-7-23
为什么要进行蛋白质研究？
（1）蛋白质是细胞的功能分子
（2）蛋白质表达水平受到诸多因素的调控
（3）DNA/RNA水平与蛋白质水平没有正相关性（4）DNA/RNA层面无法获知蛋白质翻译后修饰（5）蛋白质是药物治疗的重要靶位
（6）蛋白质研究是后基因组时代的终极目标
为什么要研究蛋白质的相互作用？
蛋白质控制了细胞中的所有生物系统，但是，通常它们不是“单
打独斗”，绝大多数蛋白质会与其他蛋白质相互作用，一起参与
生命过程。
蛋白相互作用有哪些类型？
◆稳定相互作用（ Stable interactions ）
指那些通常以多亚基复合物（ multi-subunit complexes ）纯化得到的相互作用蛋白，这些亚基可以是相同的，也可以是不同的。
Eg:血红蛋白（αβ）；核心RNA聚合酶（α2ββ’ ）
◆瞬态相互作用（ Transient interactions ）
被认为控制了主要的细胞过程，它们的相互作用是暂时的，并需要一定的条件来促进相互作用，如甲基化、磷酸化、构象改变等。
瞬态相互作用可强可弱，可快可慢。
蛋白相互作用的研究方法
◆In Vivo 体内方法
◆In Vitro 体外方法
◆In Silico 生物信息学方法
常用研究技术
Method Interactions type Property Adhibition Co-IP Stable or strong 内源筛选互作蛋白Pull-Down Assay Stable or strong 外源筛选互作蛋白TAP Stable or strong 标签筛选互作蛋白SILAC-PAP Stable or strong 标签筛选互作蛋白
BioID Transient 、weak or
insoluble 内源筛选互作蛋白
Far-Western Blot
Analysis
Moderately stable 外源验证互作蛋白IP Stable or strong 内源验证互作蛋白BiFc Transient or weak 内源验证互作蛋白
IP/Co-IP(内源)
IP/Co-IP (内源)
Endogenously expressed FBXW7 and HSF1 interact.
(a ) Native FBXW7 was immunoprecipitated (IP) from cell extracts with anti-FBXW7 antibody , followed by immunoblotting as indicated.
Rabbit IgG was used as control. Arrow indicates FBXW7 in input.
Bait
Interacting protein
GST Poly His
IP、Co-IP and Pull-Down比较
AP(标签)
◆AP：Affinity Purification
◆TAP：Tandem Affinity Purification ◆PAP：Parallel Affinity Purification
TAP (Flag-SBP/HA)
◆TAP是Co-IP的“近亲”，两者在寻找诱饵蛋白的互作蛋
白以及纯化互作蛋白的原理类似。
◆TAP引入了2个纯化标签（Flag，SBP或HA），经过2步纯
化，能有效纯化裂解液中的靶蛋白及其复合物，并使非特
异性蛋白的数量降至较低水平。
◆实验组和对照组洗脱的蛋白分别做质谱，从实验组结果
中扣除对照组中的蛋白，即可鉴定出与Bait互作的蛋白。
技术优势：
1、TAP/MS鉴定到的互作蛋白是细胞内与诱饵蛋白天
然互作的，符合体内真实生理情况，可信度高。
2、采用两步纯化，能有效减少非特异蛋白的结合。
SILAC+PAP+MS
与Co-IP、Pull down相比，
SILAC-PAP有以下优势：
◆特异性强,假阳性极低；
◆高通量，液质连用，能最大限度
的寻找到相互作用的蛋白质；
◆灵敏度高；
◆能直接检测出与bait蛋白互作的
其它蛋白的相对含量。
邻近蛋白标记-BioID
◆BirA*是生物素连接酶BirA的一种突变体；
◆具有捕获生物素标记邻近蛋白的能力，
而不管是直接还是间接相互作用甚至仅仅
是距离很近的被标记蛋白。
应用：
◆已经被成功地运用到研究哺乳动物细胞
和单细胞原核生物的各种各样的蛋白中；
◆特别适用于研究不易溶解或者很难得到
的亚细胞结构蛋白；
◆能够检测弱的，瞬时的蛋白相互作用。
Far-Western Blotting Bait protein
Tag bait protein
Biotinylated bait peotein
Far-WB vs WB
BiFC
Protein A Protein B
谢谢！。