目的基因T载体克隆实验步骤

PCR产物的T载体克隆
实验原理
一.重组质粒的构建：
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。

DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。

两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA 连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。

但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP 复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。

连接反应通常将两个不同大小的片断相连。

很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。

pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。

这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。

但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。

因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

二.感受态制备原理
细菌在0 C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。

三.β-半乳糖甘酶显色反应选择法（蓝白筛选）原理
LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。

β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。

现在一些特定的质粒（比如pUC/pBS等），常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶N端146个氨基酸（α肽段）的编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（MCS）,它并不影响lacZ的表达。

另外，常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段），的编码序列。

在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。

只有当携带α肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物IPTG的诱导下，载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶N端（α肽段），这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段）互补，形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。

而当外源基因插入到此种载体质粒lacZ的多克隆位点后，会造成lacZ基因不能表达，从而不能合成β—半乳糖核苷酶；而对于空载体，lacZ基因正常表达，通过α互补合成β—半乳糖核苷酶，分解培养基里的色素底物X-gal，最终形成蓝色的化合物，出现蓝色菌斑。

X-Gal，中文名为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，分子式为C14H15BrClNO6，分子量为408.63，它是β–半乳糖苷酶的底物，水解后呈蓝色。

IPTG，中文名，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，分子式: C9H18O5S ，分子量238.30 ，保存温度2-8°C冷藏保存,配制好后保存于-20°C，室温可放置一个月。

主要作用：异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用
实验准备
清洗，5个100ml锥形瓶（外加1个小的），6副培养皿，3个小试剂瓶，接种环，涂布棒准备100ml超纯水
溶液:LB300ml(液体50ml+50ml，固体100ml)，0.1mol/L CaCl2 10ml，100mg/mlAmp 1 ml，20mg/mlX-gal 1 ml，200mg/ml IPTG 1 ml。

大肠杆菌菌液1ml
感受态细胞连接产物
4管 4 x 5 = 20ul 做4份
目的基因T载体T4连接酶10x冲液
4 x 4uL 4x1uL 4x0.5uL 4x1uL
灭菌：5个100ml锥形瓶（外加1个小的），6副培养皿，3个小试剂瓶，接种环，涂布棒，10ml超纯水，LB培养基，1.5mlEP管，大小枪头，过滤用具2副，，0.1mol/L CaCl2
试剂
20mg/ml X-gal X-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。

用二基甲酰胺（DMF）溶
解X-gal配制成的20mg/ml（取0.02gX-gal，用DMF定容为1ml）的贮存液。

保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20℃。

X-gal溶液无须过滤除菌。

（DMF二甲基甲酰胺; Dimethylformamide; N,N-Dimethylformamide; DMF; CAS：68-12-2 理化性质:无色、淡的胺味的液体。

分子式C3-H7-N-O。

分子量73.10。

相对密度0.9445(25℃)。

熔点-61℃。

沸点152.8℃。

）
200mg/ml IPTG在0.8ml蒸馏水中溶解0.2g IPTG后，用蒸馏水定容至1ml，用0.22μm滤器过滤除菌，贮存于-20℃。

LB培养基：
配制每升培养基,应该在950 ml去离子水中加入:
胰化蛋白胨10g
酵母提取物5g
NaCl 10g
摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.3.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.（100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉为固体培养基）
0.1mol/LCaCl2：取0.11098g氯化钙固体定容至10ml
Amp（100mg/ml）：溶解0.1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至1ml，用0.22μm滤膜过滤除菌.
实验步骤
（一）.目的基因片段与载体连接
器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。

试剂
T 载体，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液，无菌dd Water
操作步骤
PCR产物与T载体直接连接：
（1）事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14~16︒C。

（2）取4个灭菌的200ul微量离心管，加入：（需要调整）
4μl 目的基因
1μl T载体
0.5μl T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul）后加
1μl 连接酶缓冲液10 x buffer
3.5 μl dd Water
总量10μl 体系
（3）述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14︒C干式恒温仪（或14︒C水中）中保温过夜（12-16h）。

（4）连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4︒C冰箱备用。

（二）.大肠杆菌感受态细胞的制备细菌转化
器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱，滤膜和过滤器
试剂
E. coli菌种，LB培养基，0.1 mol/L CaCl2溶液，无菌dd Water ，LB培养基（不加抗菌
素），LB培养基（加抗菌素），无菌dd water，IPTG，X-gal。

步骤
（1）在超净工作台中，将1ml大肠杆菌菌液加入100ml LB液态培养基（不含抗菌素），37℃摇床培养过夜。

（2）取0.5ml上述菌液转接到含有50mL LB培养基的三角烧瓶中，37℃下250r/min摇床培养2~3h，测定OD590为0.35~0.4左右（<0.4~0.6，细胞数<108/mL，此为关键参数！）。

（注意：此步摇菌的时候，要有一管不加菌的LB培养液同时摇菌）
（3）将1ml菌液加入到4支1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm离心5min。

（4）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。

（5）4℃，5000rpm离心5min，弃上清液后，用100μL 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，插入冰中放置2h，可以直接用作转化实验，或立即放入-4摄氏度冰柜中保藏。

（6）事先将恒温水浴的温度调到42℃。

（7）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μL）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。

（8）加入5μL连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。

（9）轻轻摇匀后插入42℃水浴中90s进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3min。

（10）在超净工作台中向上述各管中分别加入300μL LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h。

（11）在超净工作台中取上述转化混合液200μL，分别滴到含合适抗菌素（Amp 100ug/L）的固体LB平板培养皿中，再在平板上滴加40μL 20mg/ml X-gal，7μL 200mg/ml IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：一个不含抗生素作为对照组，玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂，菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。

）。

（12）在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。

（13）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。

（14）观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。

注意白色菌斑。

（三）.转化克隆的筛选和鉴定
器材
旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。

试剂
LB培养基（加抗菌素），PCR用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内且酶及其缓冲液，65%甘油（65%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris Cl pH8.0）。

操作步骤
方法一：快速PCR筛选法
（1）在转化的平板培养基上随机选取4个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。

（2）在0.2ml PCR 微量离心管中配制25μl反应体系。

dd water 16μl
10×PCR buffer（不含MgCl2） 2.5μl
25mM MgCl2 1.5μl
2.5mmol/L dNTP 2μl（每种dNTP终浓度0.2mM）
10μmol/L Primer1 1μl（12.5—25pmoles）
10μmol/L primer2 1μl（12.5—25pmoles）
模板质粒用小tip头轻轻粘一下选中的白色菌落，再伸入PCR混合液中洗一洗
Taq酶0.5μl（1.5u）
总体积25μl
（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序（本实验室已经设置为WZ）：
①94℃5min
②94℃1min
③60℃1min
④ 72℃1min50s
⑤goto②29 times
⑥72℃10min
（2）PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳（与原始插入片断同时比对）。

观察胶上是否有预计的主要产物带。

（3）按照编号找到培养皿中的原菌斑。

根据需要进行放大培养提取其质粒
（4）提取到的质粒与原先的空载体（或已知分子量的质粒）再对比电泳，以进一步确认。

方法二：提质粒再PCR或酶切鉴定
（1）在超净工作台中取3支无菌摇菌管，各加入3mL LB（含50μg/mL氨苄青霉素），用记号笔写好编号。

（2）在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙签。

用牙签的尖部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有3mL LB（含50μg/mL氨苄青霉素）的摇菌管中。

用此法随机取3个白色菌落，分别装入3个摇菌管中。

（3）37℃摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒。

摇菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。

（4）提取到的3管质粒样品可用PCR法扩增，或用酶切电泳法来鉴定其上是否含有外源插入片断（方法见有关实验）。

（5）将经过鉴定判断为正确的质粒保存。

按照编号找到冰箱中原菌液。

根据需要进行放大
培养提取其质粒或进行诱导表达，或取500μL菌液与500μL 65%甘油混合后-80℃保存。

（6）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面
附：目的基因PCR（选做）
在0.2ml PCR 微量离心管中配制50μl反应体系。

（以下加样量供参考，括号内是最终需要量，实验时需参照Taq酶说明书计算）
dd water 32μl
10×PCR buffer（不含MgCl2）5μl
25mM MgCl2 3μl
2.5mmol/L dNTP 4μl（每种dNTP终浓度0.2mM）
10μmol/L Primer1 2μl（12.5—25pmoles）
10μmol/L primer2 2μl（12.5—25pmoles）
模板质粒1μl（1×10-3pmoles）
3U/μl Taq酶1μl（3u）
总体积50μl
根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序：
①94℃5min
②94℃1min
③60℃1min
④ 72℃1min50s
⑤goto②29 times
⑥72℃10min
PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。

观察胶上是否有预计的主要产物带。

实验安排：
第一天：14:00 配液，灭菌(2h) 16:30 接种大肠杆菌菌种，摇菌
21:30 做PCR产物与T载体直接连接
第二天：9:00 再接种，再摇菌，OD合适后，做感受态细胞（大约6h）
13:00拿出转化体系，冰存
15:00 做转化，涂布（大约2h）
第三天观察，记录，拍照。